專利名稱：一種復(fù)合材料多孔支架的制備方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種復(fù)合材料多孔支架的制備方法，涉及一種以絲素蛋白、膠原蛋白以及殼聚糖為原料，制備具有同細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)相類似的多孔支架技術(shù)，所制備的多孔支架孔徑直徑在50 μ πΓ400 μ m之間，可應(yīng)用于組織和創(chuàng)面的填充和修復(fù)，以及組織工程，藥物釋放等技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
生物醫(yī)學(xué)工程中一個(gè)重要方面在于支架材料的研究。引入合適支架材料是促進(jìn)細(xì)胞沿著需要的方向分化并形成組織的一個(gè)重要因素，這樣利于組織的修復(fù)。三維多孔的細(xì)胞支架不但可以容納細(xì)胞、細(xì)胞產(chǎn)物和細(xì)胞外基質(zhì)，更是細(xì)胞附著的基本框架和代謝場(chǎng)所，它的形態(tài)和功能直接影響其所構(gòu)成的組織形態(tài)和功能。
絲素蛋白是從蠶絲中提取的天然高分子纖維蛋白，絲素蛋白作為組織工程支架材料具有強(qiáng)度高、多孔、易加工處理、生物相容性多，以及促進(jìn)細(xì)胞粘附、增值和分化的優(yōu)點(diǎn)。通常制備成各種形狀、如膜、海綿、無(wú)紡網(wǎng)而廣泛應(yīng)用到人工皮膚、骨等領(lǐng)域。通過(guò)調(diào)整絲素蛋白的晶體結(jié)構(gòu)種類和含量來(lái)調(diào)整支架生物降解性。膠原用于組織修復(fù)已有20多年的歷史，膠原是用于組織修復(fù)中研究得最廣泛的天然材料。膠原作為支架材料的優(yōu)勢(shì)在于可以被細(xì)胞相關(guān)酶類識(shí)別，通過(guò)重建和降解為新生組織提供場(chǎng)所和空間。膠原作為天然細(xì)胞外基質(zhì)的成分，含有利于細(xì)胞粘附的基團(tuán)，為細(xì)胞提供了較為接近自然狀態(tài)的表面。相比于其他支架，膠原還具有適合的分子信號(hào)刺激種子細(xì)胞合成新的膠原。殼聚糖是由自然界廣泛存在的幾丁質(zhì)經(jīng)過(guò)脫乙酰作用得到的，化學(xué)名稱為聚葡萄糖胺(1-4) -2-氨基-B-D葡萄糖，由于其生物相容性、血液相容性、安全性、微生物降解性等優(yōu)良性，這種天然高分子在生物醫(yī)藥行業(yè)得到了廣泛的應(yīng)用。單一材料構(gòu)建的組織工程支架往往無(wú)法同時(shí)滿足生物相容生物活性及一定的力學(xué)性能等特性，比如絲素蛋白雖有上述優(yōu)點(diǎn)，但是由于其親水性較差，降解緩慢而使其應(yīng)用受到了限制。再比如，膠原蛋白也有機(jī)械性能差，強(qiáng)度不夠，降解過(guò)快的缺點(diǎn)使其應(yīng)用受到限制。殼聚糖具有很好的止血和吸水的能力，但是同樣有強(qiáng)度不高，降解快的缺點(diǎn)。有文獻(xiàn)表明，有人曾用膠原蛋白和絲素蛋白制備復(fù)合支架。雖然該復(fù)合支架有著優(yōu)異的生物相容性和力學(xué)強(qiáng)度高等特點(diǎn)，但是在親水性和吸水能力方面卻不盡人意，并且在組織和創(chuàng)面修復(fù)的過(guò)程中，止血效果也不是很好。

發(fā)明內(nèi)容
鑒于上述不足之處，本發(fā)明目的是提供一種復(fù)合材料多孔支架制備的方法，可以制備出一種強(qiáng)度高，組織相容性好，吸水性好的多孔支架。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明通過(guò)將不同優(yōu)異性能的材料復(fù)合，形成優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)的新型復(fù)合支架材料。基于這個(gè)原理，我們以絲素蛋白為“骨架”，再以I型膠原蛋白和殼聚糖包裹和填充絲素蛋白的復(fù)合方式的一種新型材料。既包含膠原蛋白良好的生物相容性，又有絲素蛋白優(yōu)異的機(jī)械性能，并且還具有殼聚糖的止血和吸水能力，同時(shí)我們可以通過(guò)調(diào)整絲素蛋白，膠原蛋白和殼聚糖在復(fù)合材料里的比例來(lái)控制其生物學(xué)功能和降解時(shí)間。本發(fā)明的具體技術(shù)方案為一種復(fù)合材料多孔支架的制備方法，其特征在于，包括下述步驟
(1)取膠原蛋白溶液、絲素蛋白溶液、殼聚糖溶液混合
將一混合容器置于(Tl0°c冷水浴和超聲振蕩環(huán)境中，然后再向混合容器中加入殼聚糖溶液，用攪拌器一邊勻速攪拌一邊加入膠原蛋白溶液，加入完畢后繼續(xù)攪拌1(Γ120分鐘得復(fù)合溶液；最后將絲素蛋白溶液用均勻滴入復(fù)合溶液中，勻速攪拌，此滴入過(guò)程同樣處于(T10°C冷水浴和超聲振蕩環(huán)境中，滴入完畢后繼續(xù)攪拌1(Γ120分鐘得粘稠物，然后將粘稠物分裝注入凍干模具后在(Tl(TC下保存f 6小時(shí)得初凍物備用；加入絲素蛋白溶液、膠原蛋白溶液和殼聚糖溶液的質(zhì)量比為I: I: f 7:7:1 ;、
(2)冷凍干燥
將步驟(I)所得的初凍物放入-10°C '80°C冷凍6h，然后再放到真空冷凍干燥器中凍干48h，得海綿狀支架；
(3)乙醇水溶液蒸汽熏蒸
將濃度為95%乙醇水溶液放入蒸汽發(fā)生器，將發(fā)生的乙醇水溶液蒸汽注入一個(gè)密閉容器內(nèi)，再將步驟(2)得到的海綿狀支架放入密閉容器里，蒸汽熏蒸flO小時(shí)；
(4)真空干燥
將步驟(3)熏蒸后的海綿狀支架放入真空干燥器中干燥24h，得到復(fù)合材料多孔支架。所述膠原蛋白溶液由以下方法制備
選取天然無(wú)污染的新鮮牛跟腱，將其搗碎，再按質(zhì)量比1:3(Γ60比例加入濃度為3%的醋酸和按牛跟腱質(zhì)量計(jì)為1°/Γ20%的胃蛋白酶，在0°C 10°C的溫度下進(jìn)行酶解，然后離心取上清液，調(diào)PH值到6 8，再向上清液中加入固體的氯化鈉，使氯化鈉的終濃度為I. Omol/L^2. 5mol/L,靜置2 12小時(shí)后離心取沉淀，再用蒸餾水洗滌三次后用濃度為1%的醋酸溶解，最后用蒸餾水透析得到膠原蛋白溶液，加蒸餾水將其調(diào)整濃度為19Γ5%。所述絲素蛋白溶液由以下方法制備
將蠶繭置于濃度為1%的碳酸鈉沸水中煮30分鐘脫去絲膠，然后過(guò)濾，再用蒸餾水洗滌三次，烘干得絲素纖維，將絲素纖維加入到質(zhì)量比為I、 I的Ca (NO3)2 4H20:CH3CH2OH的溶液中，4(TlO(rC，溶解O. 5飛個(gè)小時(shí)，待冷卻至室溫后過(guò)濾，最后用蒸餾水透析得到膠原蛋白溶液，加蒸餾水將其調(diào)整濃度為1% 5%。所述殼聚糖溶液由以下方法制備
將殼聚糖溶解在濃度為O. 59Γ3%的醋酸中，得到濃度為1°/Γ5%殼聚糖溶液。構(gòu)成本發(fā)明多孔支架的材料為絲素蛋白，膠原蛋白，殼聚糖。采用本發(fā)明制備方法制得的多孔支架的孔隙率達(dá)到98%以上，孔徑尺寸為50^400 μ m,微孔之間互通。本發(fā)明的復(fù)合材料多孔支架既包含膠原蛋白良好的生物相容性，又有絲素蛋白優(yōu)異的機(jī)械性能，并且還具有殼聚糖的止血和吸水能力，其強(qiáng)度高，組織相容性好，吸水性好，可以用來(lái)制備組織和創(chuàng)面的填充和修復(fù)器械、組織工程器械、藥物釋放器械。
本發(fā)明主要用于需要較好機(jī)械強(qiáng)度和較長(zhǎng)降解時(shí)候的填充類生物支架。其復(fù)合材料本身還可以作為人工血管組織支架的原材料來(lái)應(yīng)用。本發(fā)明的有益效果是
1、本發(fā)明所制備的復(fù)合多孔支架的孔隙率達(dá)到98%以上，且尺寸分布于5(Γ400 μ m，微孔之間互通。2、本發(fā)明得到的復(fù)合多孔支架強(qiáng)度高，易吸水，組織相容性好，未引入交聯(lián)劑等細(xì)胞毒性物質(zhì)。3、本發(fā)明所得的復(fù)合多孔支架再浸水后能保持原有的形態(tài)，有海綿的功能，擠壓后能恢復(fù)原有形態(tài)。


圖1是復(fù)合材料多孔支架的外觀照片。圖2是復(fù)合材料多孔支架的內(nèi)部結(jié)構(gòu)掃描電鏡圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例子及附圖，對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。本施例所提供的復(fù)合材料多孔支架制備步驟如下
(1)膠原蛋白溶液制備選取20g天然無(wú)污染的新鮮牛跟腱，將其搗碎，再加入濃度為3%的醋酸和跟腱質(zhì)量5% (1g)的胃蛋白酶，4°C下進(jìn)行酶解。然后8000轉(zhuǎn)離心30分鐘，取上清液，用NaOH調(diào)pH值到7. 0，再加入固體的氯化鈉，使氯化鈉的終濃度為2. Omol/L，靜置12小時(shí)后9500轉(zhuǎn)離心30分鐘，取沉淀，再用蒸餾水洗滌三次后用濃度為1%的醋酸溶解，最后用蒸餾水透析得到純度較高的膠原蛋白溶液，然后用蒸餾水將膠原蛋白溶液調(diào)整到濃度為3% ο(2)絲素蛋白溶液制備將5g蠶繭置于濃度為1%的碳酸鈉沸水中煮30分鐘脫去絲膠，然后過(guò)濾，再用蒸餾水洗滌三次，烘干得3. 5g絲素纖維。將絲素纖維加入到質(zhì)量比為3:1的Ca(NO3)2 · 4H20: CH3CH2OH的溶液中，60°C，溶解I. 5個(gè)小時(shí)。待冷卻至室溫后用過(guò)濾，用蒸餾水透析得到絲素蛋白溶液，然后用蒸餾水將絲素蛋白溶液調(diào)整到濃度為3%。(3)殼聚糖溶液制備將5g殼聚糖溶解在濃度為3%的醋酸中，得到濃度為3%殼聚糖溶液。(4)將混合容器置于4°C冷水浴和超聲振蕩環(huán)境中，然后再向混合容器中加入步驟
(3)制得的濃度為3%的殼聚糖溶液，然后用攪拌器一邊勻速攪拌一邊加入步驟(I)制得的濃度為3%的膠原蛋白溶液，加入完畢后繼續(xù)攪拌30分鐘得復(fù)合溶液；最后將步驟(2)制得的濃度為3%的絲素蛋白溶液用均勻滴入復(fù)合溶液中，勻速攪拌，此滴入過(guò)程同樣處于4°C冷水浴和超聲振蕩環(huán)境中，滴入完畢后繼續(xù)攪拌30分鐘得粘稠物，然后將粘稠物分裝注入凍干模具后在4°C下保存3小時(shí)得初凍物備用；在本步驟中，絲素蛋白溶液、膠原蛋白溶液和殼聚糖溶液的加入量的質(zhì)量比為5 :5 :1。(5)將初凍物放入_20°C '40°C冷凍6小時(shí)；然后放到真空冷凍干燥器中凍干48小時(shí)，真空度小于10Pa，得海綿狀支架。
(6)將濃度為95%乙醇水溶液放入蒸汽發(fā)生器，將發(fā)生的乙醇水溶液蒸汽注入一個(gè)密閉容器內(nèi)，再將步驟(5 )得到的海綿狀支架放入密閉容器里，蒸汽熏蒸6小時(shí)；
(7)將步驟(6)熏蒸后的海綿狀支架放入真空干燥器中干燥24h，真空度小于10Pa，得到多孔復(fù)合支架。得到樣品的外觀如圖I所示，其內(nèi)部結(jié)構(gòu)通過(guò)掃描電鏡觀察，如圖2所示?？梢钥吹狡淇紫堵屎芨?，孔徑大部分在5(Γ400 μ m。吸水測(cè)定
參照《中華人民共和國(guó)藥典》(2010年版)二部的吸收性明膠海綿吸水力檢查測(cè)定，以被水完全侵潤(rùn)的時(shí)間記為吸水時(shí)間，以吸水后的重量與自身重量的倍數(shù)比為吸水量，測(cè)得實(shí)施例制備的復(fù)合材料多孔支架吸水時(shí)間和吸水量數(shù)據(jù)如表I :
權(quán)利要求
1.一種復(fù)合材料多孔支架的制備方法，其特征在于，包括下述步驟 (1)取膠原蛋白溶液、絲素蛋白溶液、殼聚糖溶液混合 將一混合容器置于(TlO°C冷水浴和超聲振蕩環(huán)境中，然后再向混合容器中加入殼聚糖溶液，用攪拌器一邊勻速攪拌一邊加入膠原蛋白溶液，加入完畢后繼續(xù)攪拌1(T120分鐘得復(fù)合溶液；最后將絲素蛋白溶液用均勻滴入復(fù)合溶液中，勻速攪拌，此滴入過(guò)程同樣處于(TlO°C冷水浴和超聲振蕩環(huán)境中，滴入完畢后繼續(xù)攪拌1(T120分鐘得粘稠物，然后將粘稠物分裝注入凍干模具后在(Tl(TC下保存I飛小時(shí)得初凍物備用；加入絲素蛋白溶液、膠原蛋白溶液和殼聚糖溶液的質(zhì)量比為I: I: f 7:7:1 ； (2)冷凍干燥 將步驟(I)所得的初凍物放入-10°C '80°C冷凍6h，然后再放到真空冷凍干燥器中凍干48h，得海綿狀支架； (3)乙醇水溶液蒸汽熏蒸 將濃度為95%乙醇水溶液放入蒸汽發(fā)生器，將發(fā)生的乙醇水溶液蒸汽注入一個(gè)密閉容器內(nèi)，再將步驟(2)得到的海綿狀支架放入密閉容器里，蒸汽熏蒸f 10小時(shí)； (4)真空干燥 將步驟(3)熏蒸后的海綿狀支架放入真空干燥器中干燥24h，得到復(fù)合材料多孔支架。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的復(fù)合材料多孔支架的制備方法，其特征在于所述膠原蛋白溶液由以下方法制備 選取天然無(wú)污染的新鮮牛跟腱，將其搗碎，再按質(zhì)量比1:30飛0比例加入濃度為3%的醋酸和按牛跟腱質(zhì)量計(jì)為1% 20%的胃蛋白酶，在0°C 10°C的溫度下進(jìn)行酶解，然后離心取上清液，調(diào)PH值到6 8，再向上清液中加入固體的氯化鈉，使氯化鈉的終濃度為I. Omol/L^2. 5mol/L，靜置2 12小時(shí)后離心取沉淀，再用蒸餾水洗滌三次后用濃度為1%的醋酸溶解，最后用蒸餾水透析得到膠原蛋白溶液，加蒸餾水將其調(diào)整濃度為1% 5%。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的復(fù)合材料多孔支架的制備方法，其特征在于所述絲素蛋白溶液由以下方法制備 將蠶繭置于濃度為1%的碳酸鈉沸水中煮30分鐘脫去絲膠，然后過(guò)濾，再用蒸餾水洗滌三次，烘干得絲素纖維，將絲素纖維加入到質(zhì)量比為廣9:1的Ca(NO3)2 4H20 = CH3CH2OH的溶液中，4(TlO(rC，溶解0. 5飛個(gè)小時(shí)，待冷卻至室溫后過(guò)濾，最后用蒸餾水透析得到絲素蛋白溶液，加蒸餾水將其調(diào)整濃度為1% 5%。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的復(fù)合材料多孔支架的制備方法，其特征在于所述殼聚糖溶液由以下方法制備 將殼聚糖溶解在濃度為0. 59T3%的醋酸中，得到濃度為19^5%殼聚糖溶液。
5.一種如1-4任意一項(xiàng)權(quán)利要求所述的復(fù)合材料多孔支架的制備方法所制得的復(fù)合材料多孔支架。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的復(fù)合材料多孔支架，其特征在于構(gòu)成該多孔支架的材料為絲素蛋白，膠原蛋白，殼聚糖。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的復(fù)合材料多孔支架，其特征在于，該多孔支架的孔隙率達(dá)到98%以上，孔徑尺寸為5(T400iim，微孔之間互通。
8.權(quán)利要求5所述的復(fù)合材料多孔支架在作為制備組織和創(chuàng)面的填充和修復(fù)器械、組織工程器械、藥物釋放器械的應(yīng)用。
9.權(quán)利要求6或7所述的復(fù)合材料多孔支架在作為制備組織和創(chuàng)面的填充和修復(fù)器械、組織工程器械、藥物釋放器械的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種復(fù)合材料多孔支架的制備方法。該方法將絲素蛋白、膠原蛋白和殼聚糖復(fù)合在一起，得到白色海綿狀的復(fù)合多孔支架。該方法制備的多孔支架可應(yīng)用于組織和創(chuàng)面的填充和修復(fù)，以及組織工程，藥物釋放等技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明所制備的復(fù)合多孔支架的孔隙率達(dá)到98%以上，且尺寸分布于50~400μm，微孔之間互通。本發(fā)明所得的復(fù)合多孔支架再浸水后能保持原有的形態(tài)，有海綿的功能，擠壓后能恢復(fù)原有形態(tài)。
文檔編號(hào)A61L27/26GK102973984SQ20121056908
公開(kāi)日2013年3月20日 申請(qǐng)日期2012年12月25日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月25日
發(fā)明者王松 申請(qǐng)人:成都維德醫(yī)療器械有限責(zé)任公司