專利名稱：一種膠原蛋白組織工程皮膚的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)用材料技術(shù)領(lǐng)域，更具體地說(shuō)涉及一種膠原蛋白組織工程皮膚的制備方法。
背景技術(shù)：
膠原蛋白是動(dòng)物體內(nèi)含量最豐富的蛋白質(zhì)，它屬于不溶性纖維型蛋白質(zhì)，也是細(xì)胞外基質(zhì)中的一類(lèi)，膠原蛋白可以從動(dòng)物中提取不同組織中不同類(lèi)型的膠原蛋白，其功能和作用也不同。提取膠原蛋白能夠溶解的一般是前膠原。膠原蛋白是人體皮膚中的主要成分，皮膚中膠原蛋白占了 72 %，真皮中80 %是膠原蛋白，膠原蛋白在皮膚中構(gòu)成了一張細(xì)密的彈力網(wǎng)，鎖住水分，如支架般支撐著皮膚，承托著乳房，它使細(xì)胞胞漿豐滿、水分充盈， 皮膚充滿彈性、潤(rùn)澤、細(xì)膩、光滑”。膠原蛋白可使血液凝固，具有凝血功能，用作傷口止血敷料，主要是基于膠原蛋白能夠與傷口緊密結(jié)合，滲入新生組織當(dāng)中，并作為細(xì)胞生長(zhǎng)時(shí)之支架。I型膠原蛋白屬于序列保守性的蛋白質(zhì)，在哺乳動(dòng)物不同種屬之間氨基酸種類(lèi)，數(shù)目和排列順序上基本相同，因此抗原性很低；再通過(guò)生化方法切去兩端非螺旋性的多肽，進(jìn)一步降低其抗原性，使通過(guò)生化提取膠原蛋白并應(yīng)用成為可能。聚乳酸-輕基乙酸共聚物(poly (lactic-co-glycolic acid), PLGA)由兩種單體——乳酸和羥基乙酸隨機(jī)聚合而成，是一種可降解的功能高分子有機(jī)化合物，具有良好的生物相容性、無(wú)毒、良好的成囊和成膜的性能，被廣泛應(yīng)用于制藥、醫(yī)用工程材料和現(xiàn)代化工業(yè)領(lǐng)域。在美國(guó)PLGA通過(guò)FDA認(rèn)證，被正式作為藥用輔料收錄進(jìn)美國(guó)藥典。PLGA可以通過(guò)靜電紡絲的方法制成一定強(qiáng)度的紗線，經(jīng)編織成網(wǎng)做成支架纖維，具有生物可降解性、可被人體吸收。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)之不足，而提供帶傳感器的輪轂軸承，它制備出來(lái)的人工皮膚，可以用于各種創(chuàng)面修復(fù)，生物相容性好，可替代自體植皮，用途廣泛，前景廣闊。本發(fā)明的技術(shù)解決措施如下一種膠原蛋白組織工程皮膚的制備方法，它包括以下步驟a、膠原蛋白的提取，取新鮮牛跟腱，去除筋膜，切成Icm 2cm長(zhǎng)的小段，倒入氫氧化鈉溶液中充分?jǐn)嚢柽M(jìn)行病毒滅活，反應(yīng)結(jié)束用4°C的純化水充分洗滌至中性；將經(jīng)預(yù)處理的牛跟腱放入組織搗碎機(jī)中充分搗碎,經(jīng)搗碎的牛跟腱放入反應(yīng)釜中,加入4°C、pH=2的醋酸溶液，按重量計(jì)經(jīng)搗碎的牛跟腱醋酸溶液=1:60 80，再添加胃蛋白酶，胃蛋白酶的添加量為按重量計(jì)醋酸溶液的3% 10%,反應(yīng)24h 48h ；反應(yīng)結(jié)束將膠原溶液稀釋至料液比1:150，稀釋后的膠原溶液真空抽濾，收集濾液，不濾物進(jìn)行2次提取，濾液中加入過(guò)氧化氫溶液滅酶，將經(jīng)過(guò)滅酶處理的膠原溶液經(jīng)4000r/min離心，取上清液，將澄清的膠原溶液至于鹽析操作臺(tái)上，用飽和氯化鈉溶液鹽析，直至氯化鈉的終濃度約為5%，經(jīng)鹽析的膠原溶液經(jīng)高速離心甩干去除多余水分；將經(jīng)甩干的膠原放入截留分子量為8000-14000Da的透析袋中，于4°C條件下進(jìn)行透析脫鹽直至透析液中無(wú)氯離子檢出，將透析得到的膠原配制成5mg/ml的溶液；b、膠原蛋白與殼聚糖的復(fù)配，按O. 5%的比例將殼聚糖倒入蒸餾水中充分混勻，再按O. 5%的濃度加入醋酸充分?jǐn)嚢钃u勻，使殼聚糖溶解，按膠原蛋白殼聚糖=9:1的比例配制膠原-殼聚糖溶液，按O. 1%的比例加入戊二醛溶液進(jìn)行交聯(lián)，配制好的溶液于負(fù)壓條件下除氣泡；C、膠原蛋白與PLGA得復(fù)合，將PLGA立體支架放入模具中，注入膠原溶液使其沒(méi)過(guò)支架，于-20°C凍結(jié)，該P(yáng)LGA立體支架由PLGA溶液經(jīng)靜電紡根據(jù)模具的規(guī)格制成，將經(jīng)凍結(jié)的模具進(jìn)行真空冷凍干燥，得到由膠原-殼聚糖和PLGA組成的復(fù)合支架。
本發(fā)明的有益效果在于采用PLGA靜電紡絲然后制備出纖維支架，再?gòu)?fù)合膠原蛋白，制備人工皮膚，可以用于各種創(chuàng)面修復(fù)，生物相容性好，可替代自體植皮，用途廣泛，前景廣闊。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例一種膠原蛋白組織工程皮膚的制備方法，它包括以下步驟a、膠原蛋白的提取，取新鮮牛跟腱，去除筋膜，切成Icm 2cm長(zhǎng)的小段，倒入氫氧化鈉溶液中充分?jǐn)嚢柽M(jìn)行病毒滅活，反應(yīng)結(jié)束用4°C的純化水充分洗滌至中性；將經(jīng)預(yù)處理的牛跟腱放入組織搗碎機(jī)中充分搗碎,經(jīng)搗碎的牛跟腱放入反應(yīng)釜中,加入4°C、pH=2的醋酸溶液，按重量計(jì)經(jīng)搗碎的牛跟腱醋酸溶液=1:60 80，再添加胃蛋白酶，胃蛋白酶的添加量為按重量計(jì)醋酸溶液的3% 10%,反應(yīng)24h 48h ；反應(yīng)結(jié)束將膠原溶液稀釋至料液比1:150，稀釋后的膠原溶液真空抽濾，收集濾液，不濾物進(jìn)行2次提取，濾液中加入過(guò)氧化氫溶液滅酶，將經(jīng)過(guò)滅酶處理的膠原溶液經(jīng)4000r/min離心，取上清液，將澄清的膠原溶液至于鹽析操作臺(tái)上，用飽和氯化鈉溶液鹽析，直至氯化鈉的終濃度約為5%，經(jīng)鹽析的膠原溶液經(jīng)高速離心甩干去除多余水分；將經(jīng)甩干的膠原放入截留分子量為8000-14000Da的透析袋中，于4°C條件下進(jìn)行透析脫鹽直至透析液中無(wú)氯離子檢出，將透析得到的膠原配制成5mg/ml的溶液；b、膠原蛋白與殼聚糖的復(fù)配，按O. 5%的比例將殼聚糖倒入蒸餾水中充分混勻，再按O. 5%的濃度加入醋酸充分?jǐn)嚢钃u勻，使殼聚糖溶解，按膠原蛋白殼聚糖=9:1的比例配制膠原-殼聚糖溶液，按O. 1%的比例加入戊二醛溶液進(jìn)行交聯(lián)，配制好的溶液于負(fù)壓條件下除氣泡；C、膠原蛋白與PLGA得復(fù)合，將PLGA立體支架放入模具中，注入膠原溶液使其沒(méi)過(guò)支架，于-20°C凍結(jié)，該P(yáng)LGA立體支架由PLGA溶液經(jīng)靜電紡根據(jù)模具的規(guī)格制成，將經(jīng)凍結(jié)的模具進(jìn)行真空冷凍干燥，得到由膠原-殼聚糖和PLGA組成的復(fù)合支架。
權(quán)利要求
1.一種膠原蛋白組織工程皮膚的制備方法，其特征在于它包括以下步驟 a、膠原蛋白的提取，取新鮮牛跟腱，去除筋膜，切成Icm 2cm長(zhǎng)的小段，倒入氫氧化鈉溶液中充分?jǐn)嚢柽M(jìn)行病毒滅活，反應(yīng)結(jié)束用4°C的純化水充分洗滌至中性；將經(jīng)預(yù)處理的牛跟腱放入組織搗碎機(jī)中充分搗碎,經(jīng)搗碎的牛跟腱放入反應(yīng)釜中,加入4°C、pH=2的醋酸溶液，按重量計(jì)經(jīng)搗碎的牛跟腱醋酸溶液=1:60 80，再添加胃蛋白酶，胃蛋白酶的添加量為按重量計(jì)醋酸溶液的3% 10%，反應(yīng)24h 48h ； 反應(yīng)結(jié)束將膠原溶液稀釋至料液比1:150，稀釋后的膠原溶液真空抽濾，收集濾液，不濾物進(jìn)行2次提取，濾液中加入過(guò)氧化氫溶液滅酶，將經(jīng)過(guò)滅酶處理的膠原溶液經(jīng)4000r/min離心，取上清液，將澄清的膠原溶液至于鹽析操作臺(tái)上，用飽和氯化鈉溶液鹽析，直至氯化鈉的終濃度約為5%，經(jīng)鹽析的膠原溶液經(jīng)高速離心甩干去除多余水分；將經(jīng)甩干的膠原放入截留分子量為8000-14000Da的透析袋中，于4°C條件下進(jìn)行透析脫鹽直至透析液中無(wú)氯離子檢出，將透析得到的膠原配制成5mg/ml的溶液； b、膠原蛋白與殼聚糖的復(fù)配，按O.5%的比例將殼聚糖倒入蒸餾水中充分混勻，再按O.5%的濃度加入醋酸充分?jǐn)嚢钃u勻，使殼聚糖溶解，按膠原蛋白殼聚糖=9:1的比例配制膠原-殼聚糖溶液，按O. 1%的比例加入戊二醛溶液進(jìn)行交聯(lián)，配制好的溶液于負(fù)壓條件下除氣泡； C、膠原蛋白與PLGA得復(fù)合，將PLGA立體支架放入模具中，注入膠原溶液使其沒(méi)過(guò)支架，于-20°C凍結(jié)，該P(yáng)LGA立體支架由PLGA溶液經(jīng)靜電紡根據(jù)模具的規(guī)格制成，將經(jīng)凍結(jié)的模具進(jìn)行真空冷凍干燥，得到由膠原-殼聚糖和PLGA組成的復(fù)合支架。
全文摘要
一種膠原蛋白組織工程皮膚的制備方法，它包括以下步驟a、膠原蛋白的提取，b、膠原蛋白與殼聚糖的復(fù)配，c、膠原蛋白與PLGA得復(fù)合，將PLGA立體支架放入模具中，注入膠原溶液使其沒(méi)過(guò)支架，于-20℃凍結(jié)，該P(yáng)LGA立體支架由PLGA溶液經(jīng)靜電紡根據(jù)模具的規(guī)格制成，將經(jīng)凍結(jié)的模具進(jìn)行真空冷凍干燥，得到由膠原-殼聚糖和PLGA組成的復(fù)合支架。它制備出來(lái)的人工皮膚，可以用于各種創(chuàng)面修復(fù)，生物相容性好，可替代自體植皮，用途廣泛，前景廣闊。
文檔編號(hào)A61L27/24GK102836462SQ201210353249
公開(kāi)日2012年12月26日 申請(qǐng)日期2012年9月20日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月20日
發(fā)明者張新強(qiáng), 韓春茂, 胡修元, 張銳 申請(qǐng)人:紹興好士德醫(yī)用品有限公司