專利名稱：包含作為佐劑的i型ifn的疫苗和涉及它們的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及疫苗，特別是亞單位疫苗。
背景技術(shù)：
疫苗是本領(lǐng)域已知的。通常，它們包括滅活的或減毒的病原體和亞單位疫苗，施用它們是為了預(yù)防、減輕或治療傳染病。
具體地說，亞單位疫苗是基于來自病原體組分的抗原的疫苗，所述組分被認(rèn)為是對(duì)于由宿主免疫系統(tǒng)介導(dǎo)的保護(hù)作用重要的靶。雖然證明是高度安全的，但亞單位疫苗通常因下列實(shí)事而導(dǎo)致不適當(dāng)?shù)拿庖邞?yīng)答，即，作為它們的基礎(chǔ)的抗原要么是差免疫原性的，要么是非免疫原性的。
于是，為了提高免疫原性，亞單位疫苗通常需要包含佐劑或者需要與佐劑一起施用。佐劑的定義是，它是這樣一種物質(zhì)，當(dāng)該物質(zhì)與抗原一起施用時(shí)，產(chǎn)生比單獨(dú)的抗原更有效的免疫應(yīng)答。
雖然已有很多類佐劑用于動(dòng)物模型中，而且佐劑的典型實(shí)例包括，油乳液，鋁鹽或鈣鹽，皂苷和LPS衍生的產(chǎn)物，但目前，基于鋁的無機(jī)鹽是常規(guī)含于人用疫苗制劑中的僅有佐劑。雖然安全，但這樣的鹽是用于抗體誘導(dǎo)的弱佐劑，所以不能刺激典型的細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。
需要誘導(dǎo)抗體和細(xì)胞介導(dǎo)的應(yīng)答這兩者來提供對(duì)入侵病原體高度有效的防御從而限制它們的擴(kuò)散或消滅它們。疫苗需要提供或誘導(dǎo)2類信號(hào)以便激發(fā)強(qiáng)烈的、保護(hù)性的免疫應(yīng)答。首先，疫苗需要輸送抗原，后者觸發(fā)T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞上的抗原特異性的受體。其次，有效的疫苗需要誘導(dǎo)通過呈遞抗原細(xì)胞對(duì)共同刺激分子的表達(dá)，它們隨后促進(jìn)抗原觸發(fā)的淋巴細(xì)胞的強(qiáng)烈應(yīng)答。當(dāng)應(yīng)用含活病原體的疫苗時(shí)，所述第二種信號(hào)通常是由與感染相關(guān)的因子提供的，但是通常在亞單位疫苗中缺乏活病原體，導(dǎo)致它們的差免疫原性。添加可貢獻(xiàn)所述第二種信號(hào)的佐劑將增強(qiáng)疫苗的效果，而且另外可決定激發(fā)的免疫應(yīng)答的類別。
這些信號(hào)對(duì)宿主的免疫系統(tǒng)的指導(dǎo)作用能夠隨后發(fā)展效應(yīng)機(jī)制，該機(jī)制可表征對(duì)給定的感染劑的總免疫應(yīng)答的類別和功效。
細(xì)胞因子在對(duì)抗原和感染劑的免疫應(yīng)答過程中代表T細(xì)胞、B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突細(xì)胞和其它免疫細(xì)胞之間的通訊所涉及的主要因子。一些對(duì)小鼠和人T輔助(Th)克隆的研究為Th細(xì)胞(稱為Th1和Th2)表現(xiàn)的不同活性的存在提供了大量證據(jù)，這是從細(xì)胞因子分泌的分布圖推導(dǎo)的。因此，IFN-γ或IL-4的產(chǎn)生分別被認(rèn)為是Th1或Th2應(yīng)答的典型標(biāo)志。Th1型免疫應(yīng)答通常與小鼠內(nèi)IgG2a產(chǎn)生和細(xì)胞免疫的發(fā)生相關(guān)，而Th2型應(yīng)答通常則與IgE產(chǎn)生，嗜酸性粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞產(chǎn)生相關(guān)。人們通常認(rèn)為，Th1型免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)有助于對(duì)病毒和某些細(xì)菌感染產(chǎn)生保護(hù)性免疫應(yīng)答。在這方面，值得一提的是，臨床可獲得的佐劑(例如，基于鋁的無機(jī)鹽)傾向于誘導(dǎo)Th2型免疫應(yīng)答，而某些Th1促進(jìn)佐劑的應(yīng)用通常受毒性或安全問題的限制。
上述意義上高度有效的佐劑的缺乏對(duì)于成功開發(fā)疫苗(特別是針對(duì)需要細(xì)胞免疫的胞內(nèi)病原體的那些疫苗)構(gòu)成嚴(yán)重障礙。
因此，盡管可獲得可能有效的重組抗原，但對(duì)于接種的弱反應(yīng)性或沒有反應(yīng)性和患者順應(yīng)性仍保持對(duì)預(yù)防性或治療性亞單位疫苗的較多關(guān)注。亞單位疫苗的弱免疫原性使得有必要多次接種這些疫苗以便激發(fā)令人滿意的應(yīng)答，使患者順應(yīng)性的缺乏成為嚴(yán)重問題。
所以，實(shí)際上長(zhǎng)期感到需要這種佐劑，即，即使在一次劑量后，也可改善抗原免疫原性和一貫地促進(jìn)強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答，減少誘導(dǎo)血清轉(zhuǎn)變/血清保護(hù)率所需的疫苗劑量的數(shù)目。
在這方面，由于上文表現(xiàn)的性質(zhì)，本領(lǐng)域中細(xì)胞因子被認(rèn)為是可能的佐劑。其中特別是干擾素(IFN)受到一定的關(guān)注。
現(xiàn)在，人們公認(rèn)IFNs是由各種細(xì)胞響應(yīng)病毒感染或其它刺激而分泌的復(fù)雜的一族抗病毒蛋白質(zhì)，它們表現(xiàn)多重生物活性。根據(jù)它們借以誘導(dǎo)它們的生物活性的受體系統(tǒng)將它們分為兩大類i)I型IFNs，它們包括IFN-α，IFN-β和IFN-ω的至少13個(gè)功能亞類的IFN-α族；ii)II型IFN，也稱為IFN-γ。
最初被認(rèn)為是簡(jiǎn)單的抗病毒物質(zhì)，后來證實(shí)I型IFNs表現(xiàn)多種生物效應(yīng)，包括在試驗(yàn)?zāi)Ｐ秃突颊咧械目鼓[瘤活性。早期研究報(bào)導(dǎo)了I型IFN對(duì)體外和體內(nèi)免疫應(yīng)答的幾個(gè)效應(yīng)。然而，有人對(duì)這些研究中的一些持有某些懷疑，因?yàn)樵诤芏嗲闆r下IFN制劑仍然不純。長(zhǎng)期以來，人們通常認(rèn)為I型IFN對(duì)免疫系統(tǒng)的效應(yīng)就其重要性來說比不上II型IFN(被認(rèn)為是保護(hù)性細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的主要介體，這符合它的“免疫IFN”原始定義)表現(xiàn)的那些效應(yīng)。
還證實(shí)I型IFNs對(duì)體外抗體產(chǎn)生和T細(xì)胞增殖發(fā)揮有效力的抑制效果，引起了這個(gè)問題，即，這些細(xì)胞因子在體內(nèi)將以刺激方式還是抑制方式起作用？值得一提的是，一些作者最近強(qiáng)調(diào)I型IFN的可能的免疫抑制效應(yīng)。該概念甚至導(dǎo)致在HIV-1感染的患者中的臨床應(yīng)用，它基于中和被認(rèn)為是疾病進(jìn)行中涉及的推定免疫抑制因子的內(nèi)源性IFN這一基本原理。另一方面，在不同模型系統(tǒng)中獲得的系綜數(shù)據(jù)最近已經(jīng)指出了I型IFN在如下方面的重要性，即，誘導(dǎo)Th1型免疫應(yīng)答和支持某些T細(xì)胞亞群的增殖、機(jī)能活動(dòng)和存活率(Belardelli F.和Gresser I.，I型干擾素在T細(xì)胞應(yīng)答中的被忽視的作用它的臨床應(yīng)用的意義，今日免疫學(xué)(Immunol Today)17369～372，1996；以及Tough DF，Borrow P和Sprent J.，病毒和I型干擾素在體內(nèi)誘導(dǎo)的在場(chǎng)T細(xì)胞增殖，科學(xué)(Science)2721947～1950，1996)。
I型干擾素目前是臨床實(shí)踐中最常用的細(xì)胞因子。具體地說，在全世界40個(gè)以上的國(guó)家中應(yīng)用IFN-α來治療某些病毒病(特別是丙型肝炎)和人類各種癌癥，包括一些血液惡性腫瘤(多毛細(xì)胞白血病、慢性髓細(xì)胞白血病、一些B細(xì)胞和T細(xì)胞淋巴瘤)和某些實(shí)體瘤，例如，黑素瘤、腎癌和卡波西肉瘤。反之，IFN-γ則遭遇了差臨床應(yīng)用情況，主要是由于毒性。在過去數(shù)年中，一些研究提供的證據(jù)說明，在不同試驗(yàn)?zāi)Ｐ椭?，I型和II型IFNs發(fā)揮的生物效應(yīng)在活性類別方面可能基本不同。在某些情況下，例如，黑素瘤和多發(fā)性硬化，IFN-γ的臨床應(yīng)用導(dǎo)致了與I型IFN達(dá)到的那些效應(yīng)相反的效應(yīng)。
盡管它的廣泛臨床應(yīng)用，但I(xiàn)型IFN還沒有用作疫苗佐劑。這是由于，關(guān)于I型IFN在調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答中的作用和重要性的現(xiàn)有技術(shù)狀況還使人糊涂和引起爭(zhēng)議。
僅僅對(duì)于II型IFN(即，IFN-γ)顯示了IFNs在體內(nèi)作為疫苗中的佐劑的相關(guān)應(yīng)用。具體在EP 0241725中，描述了一種含粗蛋白提取物的疫苗，來自感染了Plasmodium yoelii的致病性強(qiáng)的YM系的小鼠血細(xì)胞，它包含作為佐劑的IFN-γ。指出了疫苗中包含的IFN-γ的量在每劑量1.000～10.000U范圍內(nèi)，其中，指出產(chǎn)生輔助效果的IFN-γ的量在100～50.000U范圍內(nèi)。即使指出了低于200單位的劑量也是有效的，但應(yīng)用的劑量是5.000U。
雖然一些現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)展望了I型IFN作為佐劑的應(yīng)用，但是沒有證實(shí)或啟示當(dāng)用作疫苗佐劑時(shí)I型IFN在增強(qiáng)體內(nèi)保護(hù)性Th-1型響應(yīng)的任何功效的證據(jù)。
其實(shí)，在WO/8704076中，公開了通過用傳染性牛鼻氣管炎(IBR)病毒感染牛犢的研究提出了利用IFN-α間接增強(qiáng)免疫應(yīng)答的可能性。
具體地說，按照WO/8704076，以不大于每天約5IU/磅體重的很低劑量(優(yōu)選的劑量是1IU/磅體重)優(yōu)選通過經(jīng)口途徑施用IFN-α。不但這些量太低而達(dá)不到本發(fā)明獲得的效果，而且上述申請(qǐng)的實(shí)施例中報(bào)導(dǎo)的結(jié)果表明，IFN的量增大到5IU/磅的優(yōu)選濃度以上導(dǎo)致降低免疫應(yīng)答的相反效果。
Stǜrchler等[疫苗(Vaccine)，Vol 7，1989，pp457～461]描述了，用抗惡性瘧原蟲(Plasmodium falciparum)疫苗免疫接種志愿者后，IFN-α對(duì)IgG和IgM抗體的產(chǎn)生發(fā)揮的普通佐劑(genericadjuvant)效應(yīng)。然而，在體外觀察到的IgG和IgM效價(jià)的適當(dāng)增大不是體內(nèi)保護(hù)效果的證據(jù)。于是，從該文獻(xiàn)不能推斷出體內(nèi)保護(hù)效果。
此外，Stürchler等沒有公開或者甚至啟示IFN-α以選擇性和無毒的方式誘導(dǎo)體內(nèi)保護(hù)性Th-1型免疫應(yīng)答的能力。
Anton P.等(癌癥生物療法和放射性藥物(Cancer biotherapy andradiopharmaceuticals)，Liebert，US，Vol.11，No.5，1996，pp315～318)描述了含滅活的自體腫瘤細(xì)胞和重組IFN-α2a的抗腫瘤疫苗的試驗(yàn)。雖然該文獻(xiàn)描述了免疫接種處理中的一些效果，但該文獻(xiàn)沒有區(qū)別由于自體細(xì)胞和由于IFN的貢獻(xiàn)。因此，IFN的輔助效果僅僅是被宣稱的，更不用說獲得的免疫應(yīng)答的類別了。因而不能從該文獻(xiàn)推測(cè)I型IFN在本發(fā)明的含意中的輔助效果。
Grob P.J.等[歐洲臨床微生物學(xué)雜志(Eur.J.Clin.Microbiol.)，1994，Vol.3，no.3，pp195～198]描述了，對(duì)于不響應(yīng)在先免疫接種的患者施用重組IFN-α和商品化抗乙型肝炎疫苗。結(jié)果證明了血清轉(zhuǎn)變發(fā)生率低，而IFN處理的患者中抗體效價(jià)增幅這樣低，就不能期望體內(nèi)保護(hù)效果。應(yīng)強(qiáng)調(diào)的是，在該情況下，將IFN-α和疫苗分開施用。在構(gòu)思上，該方法不同于利用任何物質(zhì)作為佐劑的方法(該方法通常包括將佐劑與抗原結(jié)合)。
與前述現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的范圍是，在體內(nèi)保護(hù)性免疫接種處理中提供增強(qiáng)對(duì)疫苗的Th-1型體液免疫應(yīng)答的安全而高效的方法，特別是關(guān)于包含滅活的病原體的疫苗，或者更具體地關(guān)于亞單位疫苗。
發(fā)明概述本發(fā)明的目的是，I型IFN在制備用來增強(qiáng)在體內(nèi)保護(hù)性免疫接種處理中對(duì)疫苗的Th-1型體液免疫應(yīng)答的無毒佐劑組合物中的應(yīng)用，其中，應(yīng)用的IFN劑量大于或等于100.000 IU/疫苗劑量。
這種增強(qiáng)的體液免疫應(yīng)答引起選擇性誘導(dǎo)IgG1和/或IgG2a和/或IgG2b和/或IgG3和/或IgA和/或IgM產(chǎn)生。
所述無毒佐劑組合物特別適用于通過皮下、肌內(nèi)或皮內(nèi)注射或者經(jīng)口或粘膜或鼻內(nèi)施藥而進(jìn)行的體內(nèi)保護(hù)性免疫接種。
具體地說，本發(fā)明的一個(gè)目的是I型IFN在制備上述目的的無毒佐劑組合物中的應(yīng)用，其中，所述組合物是為了與疫苗同時(shí)送遞到施藥部位而配制的。優(yōu)選將佐劑組合物與疫苗一起配制。
本發(fā)明的進(jìn)一步目的是一種疫苗，它包含作為佐劑、劑量大于或等于100 000IU/疫苗劑量的I型IFN，用于可控、長(zhǎng)期地釋放抗原和佐劑還有任何所需的藥物上可接受的載體或助劑。
本發(fā)明又一個(gè)目的是一種分部分的試劑盒，它含有供分別施用的上述含IFN的佐劑組合物和一種疫苗組合物。
本發(fā)明第一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是，由此制備的一種含佐劑的疫苗能改善Th-1型免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)，其特征在于，由總抗體產(chǎn)生的程度決定的長(zhǎng)期抗體產(chǎn)生和免疫記憶。
本發(fā)明第二個(gè)優(yōu)點(diǎn)是，一種以規(guī)定劑量的I型IFN組合物為佐劑的疫苗即使單一疫苗施用后，也能誘導(dǎo)特異性Th-1型體內(nèi)保護(hù)性體液和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。
本發(fā)明第三個(gè)優(yōu)點(diǎn)還有，迅速誘導(dǎo)Th-1型免疫保護(hù)的高效率，不存在任何毒性，特別是不存在對(duì)于已知可促進(jìn)動(dòng)物內(nèi)Th-1型應(yīng)答的目前可獲得的佐劑(例如，CFA或IFA)來說典型的毒性和/或安全性憂慮。
由I型IFN誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答是Th-1型應(yīng)答，其特征在于特別的Igs分布型，即，在小鼠中，IgG2a和/或IgA的特異性誘導(dǎo)，它賦予防御病原體攻擊(例如，細(xì)菌或病毒)的保護(hù)作用。
在本發(fā)明的無毒佐劑組合物中，I型IFN可以是屬于該族的任意干擾素，只要它以前述劑量包含于組合物中即可。在這方面，人體中最有效的劑量是在1×106～6×106IU范圍內(nèi)。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中應(yīng)用了來自健康供體的受刺激白細(xì)胞的天然IFN-α(不同的IFN-α亞類或各個(gè)IFN-α亞類的混合物)或者來自Namalwa細(xì)胞的類淋巴母細(xì)胞IFN-α，合成的I型IFN，例如，共有序列IFN(CIFN)和IFN-β，或者重組IFN-α亞類，例如，IFN-αa和IFN-αb，或IFN-ω ，或者通過DNA改組方法產(chǎn)生的新IFN分子，只要它們以上述每疫苗劑量指示的劑量應(yīng)用即可。
可應(yīng)用聚乙二醇處理過的I型IFN亞類，優(yōu)點(diǎn)是注射后IFN在體內(nèi)更高的半壽期，原則上有益于實(shí)現(xiàn)更顯著的和迅速的免疫應(yīng)答。
以融合了能靶向樹突細(xì)胞的單克隆抗體的重組I型IFNs代表的融合雜合蛋白可能特別有效作為包含于疫苗制劑中的佐劑。
本發(fā)明的佐劑組合物可與一種或甚至多種來自一種感染劑或其它來源的抗原以含佐劑的疫苗形式結(jié)合。
抗原包括蛋白質(zhì)、肽、碳水化合物或脂質(zhì)抗原的純化的或部分純化的制劑，和/或與全細(xì)胞，特別是已經(jīng)與抗原混合的樹突細(xì)胞結(jié)合的抗原?？傮w說來，任何病原體都可看成與作為佐劑的I型IFN結(jié)合的可能的免疫原，并且可容易由本領(lǐng)域技術(shù)人員鑒定。
每個(gè)含佐劑的疫苗劑量中存在的抗原量選定為能在接種的受治療者中誘導(dǎo)保護(hù)性免疫應(yīng)答的量。該量將取決于特定的抗原和可能存在的其它典型佐劑，并且可由本領(lǐng)域技術(shù)人員確定。通常，每個(gè)劑量將含1～1000μg抗原，優(yōu)選10～200μg。
在本發(fā)明的佐劑組合物或含佐劑的疫苗中還可有利地存在其它組分。具體地說，在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，在所述組合物中包含其它佐劑，特別是鋁鹽。
至于劑型，本發(fā)明的佐劑組合物可配制成供同時(shí)送遞所述佐劑和疫苗到施藥部位。優(yōu)選的是，將所述佐劑組合物和疫苗一起配制于一種含佐劑的疫苗形式的組合物。佐劑組合物或含佐劑的疫苗的制劑可呈適合將佐劑與抗原結(jié)合施用的本領(lǐng)域已知的任意形式。
在一些情況下，為了達(dá)到預(yù)期的效果和應(yīng)用方便，可通過皮下或肌內(nèi)注射所述佐劑組合物和疫苗或含佐劑的疫苗。對(duì)于某些疫苗可有效地進(jìn)行皮內(nèi)注射，還可考慮適合將相關(guān)數(shù)量的樹突細(xì)胞募集到注射部位的其它送遞系統(tǒng)。
尤其對(duì)于通過例如病毒的呼吸感染(例如，流感病毒感染)的這些感染途徑傳遞的那些感染劑來說，還應(yīng)包括鼻內(nèi)和經(jīng)口施藥。
此外，鼻內(nèi)、經(jīng)口或任何其它粘膜施用所述佐劑組合物和疫苗或者直接含佐劑的疫苗體現(xiàn)了有價(jià)值的選擇，這意外地和有利地通過利用很實(shí)際的疫苗送遞感覺模式而引起誘導(dǎo)有效力的保護(hù)性局部和/或系統(tǒng)性免疫。
本領(lǐng)域技術(shù)人員可在這方面確定起接種所針對(duì)的抗原的作用的最適合制劑。
本發(fā)明的佐劑組合物或含佐劑的疫苗可按常規(guī)方法配制，作為藥物組合物，它包含無菌的生理相容的載體(例如，生理鹽水溶液)，賦形劑，其它佐劑(如果有的話)，防腐劑，穩(wěn)定劑。
所述佐劑組合物或含佐劑的疫苗可呈液體或凍干的形式，在使用前溶于無菌載體。制劑中還可能存在alum或脂質(zhì)體樣的顆粒，因?yàn)樗鼈冞m用于達(dá)到IFN和抗原兩者的緩慢釋放。本領(lǐng)域技術(shù)人員容易發(fā)現(xiàn)能緩慢釋放IFN輔助的疫苗的其它措施，這些措施應(yīng)包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
藥物上可接受的載體介質(zhì)或輔助劑可容易由本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)各種制劑而確認(rèn)。
在這方面，還作為本發(fā)明的一個(gè)目的包括一種制備本發(fā)明的含佐劑疫苗的方法，它包括如下步驟-將一種抗原與I型IFN一起配制，所述I型IFN的劑量大于或等于100.000IU/疫苗劑量。
上述含佐劑疫苗可用于傳染病和癌癥的預(yù)防性和治療性處理。具體地說，本發(fā)明的佐劑組合物或含佐劑的疫苗可用于處理以防病毒性疾病和細(xì)菌性疾病(即，預(yù)防性疫苗)以及用于處理嚴(yán)重的慢性傳染病(即，治療性疫苗)。此外，當(dāng)應(yīng)用合適的抗原時(shí)，所述佐劑組合物或含佐劑的疫苗還可用于預(yù)防和治療癌癥。
這可通過應(yīng)用下列抗原來實(shí)現(xiàn)，即，抗與人惡性腫瘤(EBV、HPV和幽門螺桿菌(H.pilori))相關(guān)的感染劑的抗原，或者明確定義的腫瘤相關(guān)的抗原，例如，特征在于人黑素瘤的那些(MAGE抗原，酪氨酸羥化酶gp100，MART)以及其它人體腫瘤中的那些。
具體地說，本發(fā)明的佐劑組合物或含佐劑的疫苗特別適合接種所謂的低反應(yīng)或無反應(yīng)的受試驗(yàn)者，例如，無免疫應(yīng)答的受試驗(yàn)者，諸如維持血液透析和移植的患者。一般說來，本發(fā)明的佐劑組合物或含佐劑的疫苗有利地適合接種在任何情況下處于高危感染的個(gè)體，對(duì)他們來說需要早期血清轉(zhuǎn)變/血清保護(hù)。
這些特征特別涉及接種抗乙型肝炎病毒。
作為另一個(gè)實(shí)例，所述佐劑組合物或含佐劑的疫苗可能特別有益于在對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)的接種反應(yīng)差的老年個(gè)體中誘導(dǎo)抗流感病毒的保護(hù)作用。
對(duì)于乙型肝炎病毒疫苗和其它病毒疫苗來說，皮下或肌內(nèi)注射途徑可能是優(yōu)選的，而在其它情況下，從效率和/或患者順應(yīng)性考慮，鼻內(nèi)施藥可表現(xiàn)出優(yōu)勢(shì)，尤其對(duì)于能通過呼吸系統(tǒng)感染宿主的作用劑。
按第二方面，還可通過分開施用I型IFN和亞單位疫苗來獲得本發(fā)明的I型IFN的輔助效果。
為了有效，應(yīng)該通過允許在相同部位同時(shí)存在活性劑的感覺模式進(jìn)行施藥。實(shí)際上，當(dāng)將I型IFN與劑量在100.000～200.000IU或者甚至更高劑量(1×106～2×106IU)范圍內(nèi)的疫苗一起注射時(shí)，在動(dòng)物中實(shí)現(xiàn)了最佳效果。當(dāng)首先同時(shí)施用疫苗和佐劑，然后在首次施用疫苗后的第1天或者第1和第2天每天單獨(dú)施用一個(gè)附加劑量的佐劑，可獲得甚至更強(qiáng)的免疫應(yīng)答增強(qiáng)作用。當(dāng)在相對(duì)于施用疫苗的第-1或+1天單獨(dú)施用IFN時(shí)，觀察到低得多的效果(

圖11C)。
因此，本發(fā)明還包括分部分的試劑盒，它包含-一種包含I型IFN和藥物上可接受的載體的組合物；-一種疫苗組合物，它包含一種抗原或者兩種或更多種抗原(確定的蛋白質(zhì)或肽)或者殺死的或滅活的病原體的組合，供在治療與所述抗原的存在相關(guān)的疾病時(shí)分別、同時(shí)或依次使用。
本發(fā)明試劑盒的組合物的配方、形式和施用途徑都與上述相同。
借助于附圖將更好地描述本發(fā)明。
對(duì)附圖的描述圖1示出了聚肌胞苷酸[poly(IC)]對(duì)在體內(nèi)對(duì)雞丙種球蛋白(CGG)的初級(jí)抗體應(yīng)答的影響效果。
A組示出了，用CGG單獨(dú)注射或者CGG+聚肌胞苷酸注射(如圖中X軸上所示)的B6小鼠血清中檢測(cè)的CGG-特異性抗體的終點(diǎn)滴定度。每一幅單一圖是用測(cè)定的終點(diǎn)滴定度涉及的亞類抗體(IgM、IgG1、IgG2b、IgG2a和IgG3)標(biāo)記的。
抗體應(yīng)答以終點(diǎn)滴定度的平均值±SD表示。
B組示出了，在用CGG單獨(dú)注射或者CGG+聚肌胞苷酸注射(如圖中X軸上所示)的野生型129sv品系小鼠(白色條)或者I型IFN受體KO(I型IFNR KO)129sv小鼠(黑色條)中獲得的抗體應(yīng)答。每一幅單一圖是用測(cè)定的終點(diǎn)滴定度涉及的亞類抗體(IgM、IgG1、IgG2b、IgG2a和IgG3)標(biāo)記的。
抗體應(yīng)答以終點(diǎn)滴定度的平均值±SD表示。
圖2A和B示出了，用卵清蛋白(OVA)+佐劑免疫接種的小鼠中的抗體應(yīng)答。
A組示出了，在用生理鹽水、OVA、OVA+IFA和OVA+CFA(如圖中X軸上所示)處理的野生型(白色條)或I型IFNR KO C3H/HeJ(灰色條)小鼠中測(cè)定的特異性抗體水平。
在圖I、圖II和圖III中分別報(bào)導(dǎo)了，通過對(duì)于OVA特異性總Igs或Ig亞類IgG2a和IgG1的標(biāo)準(zhǔn)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法測(cè)定的，免疫接種24天后小鼠的血清中存在的終點(diǎn)抗體滴定度。測(cè)定值以重復(fù)測(cè)定的三份單獨(dú)的血清的終點(diǎn)稀釋滴定度平均值表示。
B組示出了，在用生理鹽水、卵清蛋白(OVA)、OVA+CpG和OVA+Alum(如圖中X軸上所示)處理的野生型(白色條)或I型IFNR KOC3H/HeJ(灰色條)小鼠中的特異性抗體水平。
在圖I、圖II和圖III中分別報(bào)導(dǎo)了，通過對(duì)于OVA特異性總Igs或Ig亞類IgG2a和IgG1的標(biāo)準(zhǔn)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法測(cè)定的，免疫接種25天后小鼠的血清中存在的終點(diǎn)抗體滴定度。測(cè)定值以重復(fù)測(cè)定的三份單獨(dú)的血清的終點(diǎn)稀釋滴定度平均值表示。
圖3示出了I型IFN在聚肌胞苷酸增強(qiáng)對(duì)于CGG的體內(nèi)T細(xì)胞應(yīng)答的作用。
A組示出了，對(duì)于通過注射聚肌胞苷酸、CGG或CGG+聚肌胞苷酸(如圖中X軸上所示)致敏的129小鼠或I型IFNR KO小鼠的T細(xì)胞的CGG的體外增殖應(yīng)答。
白色條和窄條紋條指示，來自當(dāng)存在(白色)或不存在(窄條紋)CGG時(shí)培養(yǎng)的129小鼠的引流淋巴結(jié)(DrLNs)細(xì)胞懸浮物的增殖。
黑色條和寬條紋條指示，來自當(dāng)存在(黑色)或不存在(寬條紋)CGG時(shí)培養(yǎng)的I型IFNR KO小鼠的DrLNs細(xì)胞懸浮物的增殖。
B組示出了，對(duì)于通過注射聚肌胞苷酸、CGG或CGG+聚肌胞苷酸(如圖中X軸上所示)致敏的129小鼠或I型IFNR KO小鼠的CD4+T細(xì)胞的IFN-γ分泌。
白色條和窄條紋條指示，通過從存在(白色)或不存在(窄條紋)CGG時(shí)培養(yǎng)的免疫接種129小鼠的DrLNs純化的CD4+T細(xì)胞與來自培養(yǎng)的非免疫接種同系小鼠的T缺失型脾細(xì)胞分泌的IFN-γ。
黑色條和寬條紋條指示，通過從存在(黑色)或不存在(寬條紋)CGG時(shí)培養(yǎng)的免疫接種I型IFNR KO小鼠的DrLNs純化的CD4+T細(xì)胞與來自培養(yǎng)的非免疫接種同系小鼠的T缺失型脾細(xì)胞分泌的IFN-γ。
圖4示出了內(nèi)源性I型IFN在致敏用于體外增殖的T細(xì)胞和接種了OVA+佐劑的小鼠中的DTH應(yīng)答中的作用。
A組示出了，用生理鹽水、卵清蛋白和CFA(如圖中X軸上所示)處理的正常小鼠(白色條)或I型IFNR KO C3H/HeJ(灰色條)小鼠的T細(xì)胞攝取的特異性3H胸苷。
B組示出了，用生理鹽水、卵清蛋白和卵清蛋白+CpG或Alum(如圖中X軸上所示)處理的正常小鼠(白色條)或I型IFNR KO C3H/HeJ(灰色條)小鼠的T細(xì)胞攝取的特異性3H胸苷。
C組示出了，用生理鹽水、卵清蛋白和卵清蛋白+IFA或CFA(如圖中X軸上所示)處理的野生型(白色條)或I型IFN受體KO C3H/HeJ(灰色條)小鼠中的特異性DTH響應(yīng)。
D組示出了，用生理鹽水、卵清蛋白和卵清蛋白+CpG或Alum(如圖中X軸上所示)處理的野生型(白色條)或I型IFN受體KO C3H/HeJ(灰色條)小鼠中的特異性DTH響應(yīng)。
圖5通過注射IFN-I增強(qiáng)對(duì)CGG的初級(jí)抗體應(yīng)答。
全部小鼠接受CGG的一次注射。還接受可溶性IFN-α/β或IFN-β的那些小鼠或者僅在免疫接種時(shí)(1X)被注射有關(guān)的IFN，或者在1天后(2X)或者1天和2天后(3X)被另外注射IFN。
A組示出了，單獨(dú)用CGG免疫接種或者用CGG免疫接種并用IFN-α/β處理(如圖中X軸上所示)的B6小鼠中的抗體應(yīng)答。
每一幅圖是用測(cè)得的終點(diǎn)滴定度涉及的抗體亞類(IgM、IgG1、IgG2b、IgG2a和IgG3)標(biāo)記的?？贵w應(yīng)答以終點(diǎn)滴定度的平均值±SD表示。
B組示出了，單獨(dú)用CGG免疫接種或者用CGG免疫接種并用IFN-β處理的B6小鼠中的抗體應(yīng)答。每一幅圖是用測(cè)得的終點(diǎn)滴定度涉及的抗體亞類(IgM、IgG1、IgG2b、IgG2a和IgG3)標(biāo)記的。抗體應(yīng)答以終點(diǎn)滴定度的平均值±SD表示。
圖6示出了通過IFN-α/β+alum增強(qiáng)對(duì)CGG的初級(jí)抗體應(yīng)答。
數(shù)據(jù)(黑色條)示出了，在通過一次皮下注射單獨(dú)的CGG或者與可溶性IFN-α/β、alum或IFN-α/β+alum結(jié)合的CGG(如圖中X軸上所示)對(duì)B6小鼠免疫接種10天后，通過酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法檢測(cè)的CGG-特異性抗體。符號(hào)3X指示免疫接種1天和2天后可溶性IFN-α/β的另外注射。
每一幅圖是用測(cè)得的終點(diǎn)滴定度涉及的抗體亞類(IgM、IgG1、IgG2b、IgG2a和IgG3)標(biāo)記的。
數(shù)據(jù)代表終點(diǎn)滴定度±SD(每組3只小鼠)。
圖7示出了由I型IFN和油基佐劑增強(qiáng)的抗體應(yīng)答的對(duì)比。
數(shù)據(jù)(黑色條)示出了，在通過皮下注射CGG、CGG+IFN-α/β(在第0天與CGG一起注射IFN-α/β，然后在第1和2天單獨(dú)注射)、在IFA中乳化的CGG(在第0天與CGG一起注射IFA，然后在第1和2天單獨(dú)注射)或者在TiterMax中乳化的CGG(在第0天與CGG一起注射TiterMax，然后在第1和2天單獨(dú)注射)(如圖中X軸上所示)對(duì)B6小鼠免疫接種10天后，通過酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法檢測(cè)的CGG-特異性抗體。
結(jié)果以終點(diǎn)滴定度的平均值±SD表示(每組3只小鼠)。每一幅圖是用測(cè)得的終點(diǎn)滴定度涉及的抗體亞類(IgM、IgG1、IgG2b、IgG2a和IgG3)標(biāo)記的。
圖8示出了可溶性IFN-α/β增強(qiáng)抗體應(yīng)答到與CFA相似的程度，它的佐劑活性取決于內(nèi)源性I型IFN。
在通過皮下注射單獨(dú)的CGG、CGG+IFN-α/β(在免疫接種后第1和2天又注射兩次IFN-α/β)或者CGG+CFA(如圖中X軸上所示)進(jìn)行免疫接種后的WT 129小鼠(白色條)或IFN-IR KO小鼠(黑色條)中比較了抗體應(yīng)答。免疫接種10天后通過酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法檢測(cè)CGG-特異性抗體。結(jié)果以終點(diǎn)滴定度的平均值±SD表示(每組3只小鼠)。每一幅圖是用測(cè)得的終點(diǎn)滴定度涉及的抗體亞類(IgM、IgG1、IgG2b、IgG2a和IgG3)標(biāo)記的。
圖9示出了I型IFN刺激長(zhǎng)期抗體產(chǎn)生和免疫記憶。
A組示出了6個(gè)月前通過注射單獨(dú)的CGG或者CGG+IFN-α/β免疫接種的B6小鼠中的終點(diǎn)抗體滴定度。
數(shù)據(jù)(黑色條)示出了，在通過皮下注射單獨(dú)的CGG或者CGG+IFN-α/β(在免疫接種后第1和2天又注射兩次IFN-α/β)對(duì)B6小鼠免疫接種6個(gè)月后，通過酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法檢測(cè)的CGG-特異性抗體。
結(jié)果以終點(diǎn)滴定度的平均值±SD表示(每組3只小鼠)。每一幅圖是用測(cè)得的終點(diǎn)滴定度涉及的抗體亞類(IgM、IgG1、IgG2b、IgG2a和IgG3)標(biāo)記的。
B組示出了，在首次用于試驗(yàn)的小鼠(No)內(nèi)以及在如A組那樣在6個(gè)月前用單獨(dú)的CGG或者CGG+IFN-α/β免疫接種的小鼠內(nèi)，用單獨(dú)的CGG處理6天后的特異性抗體應(yīng)答。
結(jié)果表示攻擊前(白色條)和攻擊6天后(黑色條)的抗體終點(diǎn)滴定度，以終點(diǎn)滴定度的平均值±SD表示(每組3只小鼠)。每一幅圖是用測(cè)得的終點(diǎn)滴定度涉及的抗體亞類(IgM、IgG1、IgG2b、IgG2a和IgG3)標(biāo)記的。
圖10示出了，對(duì)I型IFN的DC反應(yīng)性足以增強(qiáng)抗體產(chǎn)生和通過I型IFN的同種型轉(zhuǎn)換。
數(shù)據(jù)示出了，在免疫接種10天后，通過酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法檢測(cè)的CGG-特異性抗體。脾DC是從下列小鼠純化的129小鼠(wt)或者I型IFNR KO小鼠(如圖中X軸上所示)，短暫地與CGG一起培養(yǎng)并且對(duì)I型IFNR KO小鼠經(jīng)皮下注射了(黑色條)或者沒有注射(白色條)IFN-α/β(在后一種情況下在免疫接種后第1和2天又注射兩次IFN-α/β)。
結(jié)果以終點(diǎn)滴定度的平均值±SD表示(每組3只小鼠)。每一幅圖是用測(cè)得的終點(diǎn)滴定度涉及的抗體亞類(IgM、IgG1、IgG2b、IgG2a和IgG3)標(biāo)記的。
圖11I型IFN對(duì)用流感疫苗免疫接種小鼠的抗體應(yīng)答的佐劑活性。
標(biāo)準(zhǔn)免疫接種方案如下用0.2ml含15μg純化的流感疫苗和2×105U的鼠I型IFN的制劑、作為對(duì)比的單獨(dú)的疫苗或生理鹽水對(duì)7～8周齡的C57BL/6小鼠進(jìn)行肌內(nèi)注射。14天后，將小鼠抽血并通過標(biāo)準(zhǔn)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法檢測(cè)血清而測(cè)定流感特異性抗體水平。測(cè)定值表示5份單獨(dú)的血清平均值±SD。
A組示出了劑量/響應(yīng)試驗(yàn)，其中，用包含與I型IFN log10稀釋物(2×105，2×104或2×103單位)混合的疫苗或者單獨(dú)的疫苗或生理鹽水(作為負(fù)對(duì)比)的不同制劑對(duì)小鼠進(jìn)行肌內(nèi)處理。免疫接種7天后測(cè)定抗體滴定度。
B組示出了對(duì)用疫苗以及一次或重復(fù)劑量的I型IFN處理過的小鼠中抗體應(yīng)答的佐劑效果。用與IFN混合的流感疫苗對(duì)小鼠進(jìn)行肌內(nèi)處理，或者用與IFN混合的流感疫苗對(duì)小鼠進(jìn)行肌內(nèi)處理，接著在首次接種后在相同部位再次注射IFN達(dá)兩天。將單獨(dú)的流感疫苗或生理鹽水用作對(duì)比。
C組示出了同時(shí)或者在施用流感疫苗前后不同時(shí)間施用I型IFN的佐劑效果。在施用疫苗前或后2天或1天或者與疫苗同時(shí)，在相同的部位用IFN對(duì)小鼠進(jìn)行肌內(nèi)注射。將單獨(dú)的流感疫苗或生理鹽水用作對(duì)比。
圖12A組示出了對(duì)小鼠鼻內(nèi)施用I型IFN和流感疫苗的抗體應(yīng)答。
將7～8周齡的C57BL/6小鼠麻醉，在小鼠鼻內(nèi)(i.n.)滴注一滴(50μl)含5×104單位I型IFN的流感疫苗(15μg)制劑。14天后，進(jìn)行重復(fù)處理，又過了7天后，抽取血樣，根據(jù)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法檢測(cè)不同流感特異性抗體亞類的存在。將單獨(dú)的流感疫苗或生理鹽水用作對(duì)比。結(jié)果以每組5只小鼠的終點(diǎn)滴定度平均值±SD表示。
B組示出了含IFN佐劑的疫苗在接種了活流感病毒的小鼠中的保護(hù)作用。
用0.2ml含單獨(dú)的或者與I型IFN(5×105U)結(jié)合的流感疫苗(15μg)的溶液或者用生理鹽水(作為對(duì)比)對(duì)7～8周齡的C57BL/6小鼠進(jìn)行肌內(nèi)接種。在第0和14天施用疫苗。開始接種50天后，對(duì)小鼠鼻內(nèi)滴注一滴(50μl)10 LD50活流感病毒(A/Beijing/262/95(A/H1N1))。隨后每天對(duì)全部小鼠稱重。結(jié)果以每組5只小鼠的平均重量表示。指示了每組中全體小鼠中存活的小鼠數(shù)。
圖13用單獨(dú)的或者混合了作為佐劑的I型IFN的FLU(流感)疫苗進(jìn)行肌內(nèi)免疫接種的對(duì)比小鼠和IFN-IR KO小鼠中的FLU特異性抗體同種型分析。
在第0天和14天，用單獨(dú)的FLU疫苗、FLU疫苗+I型IFN或者FLU疫苗+MF59佐劑對(duì)對(duì)比(野生型)小鼠和IFN-IR KO C3H/HeN小鼠進(jìn)行肌內(nèi)注射。第一次接種后13天和第二次接種后19天(分別在第13天和33天)采集血清并分析FLU特異性抗體應(yīng)答。數(shù)據(jù)表示每個(gè)試驗(yàn)組重復(fù)測(cè)定的5份血清的特異性抗體滴定度的平均值±s.e.。
*p＜0.002；**p＜0.05對(duì)于IFN-IR KO小鼠；NS，不顯著。白色條對(duì)比野生型小鼠黑色條IFN-IR KO小鼠圖14當(dāng)與FLU疫苗一起鼻內(nèi)(i.n.)施用時(shí)I型IFN的強(qiáng)烈佐劑效果。
a組用單獨(dú)的或者混合了I型IFN的FLU疫苗進(jìn)行鼻內(nèi)免疫接種的C57/BL6小鼠的FLU特異性HAI滴定度、血清抗體同種型和支氣管-肺泡灌洗(BAL)IgA的分析。在第0天和14天，在小鼠鼻內(nèi)滴注50μl單獨(dú)的或者混合了I型IFN(105U)的FLU疫苗。第一次接種14天后采集血清(左圖)。第二次接種14天后(右圖)，殺死小鼠，取血樣和支氣管-肺泡灌洗液(BAL)進(jìn)行Ig分析。數(shù)據(jù)表示每個(gè)試驗(yàn)組重復(fù)測(cè)定的5份樣品的特異性抗體滴定度的平均值±s.e.。**p＜0.002對(duì)于單獨(dú)的FLU疫苗；NS，不顯著。
白色條單獨(dú)的疫苗黑色條疫苗+IFNb組經(jīng)過下列處理的C57/BL6小鼠的生存時(shí)間兩次鼻內(nèi)施用單獨(dú)的或者混合了I型IFN(105U)的FLU疫苗或者用作為對(duì)比的生理鹽水進(jìn)行免疫接種，38天以后用10 LD50的FLU病毒攻擊。數(shù)據(jù)表示了感染的小鼠的平均重量變化過程(±s.e.)和存活小鼠相對(duì)于動(dòng)物總數(shù)的百分?jǐn)?shù)。每組有5只小鼠。
實(shí)心圓生理鹽水處理的小鼠空心圓用FLU疫苗鼻內(nèi)滴注的小鼠空心方塊用FLU疫苗+IFN鼻內(nèi)滴注的小鼠c組在第0和14天用單獨(dú)的FLU疫苗、FLU疫苗+I型IFN或者FLU疫苗+MF59佐劑將對(duì)比小鼠和IFN-IR KO C3H/HeN小鼠進(jìn)行鼻內(nèi)滴注。第一次接種13天后(上組)和第二次接種19天后(下組)，取血清分析FLU特異性抗體應(yīng)答。數(shù)據(jù)表示每個(gè)試驗(yàn)組重復(fù)測(cè)定的5份樣品的特異性抗體滴定度的平均值±s.e.。*p＜0.004對(duì)于IFN-IRKO小鼠；NS，不顯著。
白色條對(duì)比野生型小鼠黑色條IFN-IR KO小鼠圖15一次免疫接種后用FLU疫苗進(jìn)行肌內(nèi)(系統(tǒng)性的)或鼻內(nèi)(粘膜的)接種的C5 7BL/6小鼠中I型IFN的佐劑效應(yīng)。
a組示出了免疫接種14天后的抗體滴定度和一次肌內(nèi)接種后的小鼠存活率。肌內(nèi)免疫接種是按前述方法進(jìn)行的。在免疫接種38天后進(jìn)行了病毒攻擊。
B組示出了免疫接種14天后的抗體滴定度和一次鼻內(nèi)接種后的小鼠存活率。粘膜免疫接種是按前述方法進(jìn)行的。在免疫接種38天后進(jìn)行了病毒攻擊。
實(shí)心圓生理鹽水處理的小鼠空心三角用FLU疫苗在肌內(nèi)注射或鼻內(nèi)滴注的小鼠空心圓用FLU疫苗+IFN在肌內(nèi)注射的或者用FLU疫苗+IFN鼻內(nèi)滴注的小鼠對(duì)本發(fā)明的詳細(xì)描述適用于本發(fā)明的I型IFN是屬于該族的任意IFN，可作為單獨(dú)的重組分子，或者作為天然的或重組的分子的集合體，或者是共有序列IFN(CIFN)。
就人體應(yīng)用來說，人I型IFN是優(yōu)選的佐劑。該佐劑可以是重組IFN-α或IFN-β或IFN-ω，來自健康捐獻(xiàn)者的受激白細(xì)胞的天然IFN-α(不同的IFN-α亞類或各個(gè)IFN-α亞類的混合物)，或是來自Namalwa細(xì)胞的類淋巴母細(xì)胞IFN-α，或是CIFN，或是通過DNA改組法在體外產(chǎn)生的并賦予生物活性的新IFN分子。
就獸醫(yī)應(yīng)用來說，I型IFN包括天然見于為其制備疫苗的物種或與該物種密切相關(guān)的那些；再一次，這些I型IFN可以是重組體或者從相關(guān)動(dòng)物細(xì)胞天然產(chǎn)生的。這些類型的干擾素具有大致相同的佐劑活性。
達(dá)到最佳佐劑活性所需干擾素的量取決于抗原類別(即，它的免疫原性)，但通常應(yīng)該大于100.000IU/疫苗劑量。在小鼠中，最佳效果是通過注射高劑量的I型IFN(2×105～106IU)獲得的。預(yù)計(jì)人體中最佳劑量在106～6×106IU/疫苗劑量的范圍內(nèi)。聚乙二醇處理過的I型IFN亞類具有在注射后允許IFN的體內(nèi)半壽期更高這一優(yōu)點(diǎn)，它可能有益于實(shí)現(xiàn)更顯著而迅速的免疫應(yīng)答。
由與能靶向樹突細(xì)胞的單克隆抗體融合的重組I型IFNs所代表的融合雜合蛋白(例如，抗-DEC-205或抗-CD11c抗體)作為包含于所述佐劑組合物或含佐劑的疫苗中的佐劑可能特別有效。
除了IFN蛋白的施用以外或者作為施用IFN蛋白的替代方式，所述佐劑還可作為核酸序列給予，為它的正確表達(dá)提供合適的調(diào)節(jié)區(qū)，編碼I型IFN的一員或多員(即，一種含I型IFN編碼基因的質(zhì)粒，受合適的啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)序列的控制，用于在真核細(xì)胞體系中表達(dá))。
佐劑活性涉及能增強(qiáng)抗原特異性免疫應(yīng)答的干擾素的任意部分。
本發(fā)明的組合物應(yīng)當(dāng)優(yōu)選包含抗原和佐劑兩者，它們是在相同的小瓶?jī)?nèi)在生理相容的載體(例如，緩沖到生理pH值的無菌生理鹽水溶液)中摻和的。
在這方面，本發(fā)明含佐劑的疫苗可包含一種或多種來自一種感染劑或其它來源的抗原以及與有效量的生物活性I型IFN結(jié)合的殺死的或減毒的病原體。所述含佐劑的疫苗還可包含全細(xì)胞，以及(特別是)自體樹突細(xì)胞。
用于這類制劑中的抗原可以是任意類別天然或重組純化的抗原，它們可能包括，來自胞內(nèi)或胞外病原體(包括病毒、細(xì)菌、原生動(dòng)物和真菌)的蛋白質(zhì)、肽、脂質(zhì)或碳水化合物抗原，以及和腫瘤結(jié)合的細(xì)胞抗原。
將每個(gè)含佐劑的疫苗劑量中存在的抗原量選定為能誘導(dǎo)接種的受試驗(yàn)者中免疫保護(hù)性應(yīng)答的量。該量將取決于所述特異性抗原和可能存在的其它典型佐劑。通常，每個(gè)劑量將含1～1000μg抗原，優(yōu)選含10～200μg。
抗原可以是任意類別的天然或重組抗原或其部分，它們來自胞內(nèi)或胞外病原體，以及病原體自身，包括病毒[細(xì)小核糖核酸病毒、杯狀病毒、冠形病毒、沙粒病毒、細(xì)小病毒、披膜病毒、黃病毒、冠形病毒、彈狀病毒、線狀病毒、正粘病毒(ortomixovirus)、副粘病毒(paramixoviruses)、本雅病毒(buniaviruses)、反轉(zhuǎn)錄病毒、乳多空病毒、腺病毒、皰疹病毒、痘病病毒、嗜肝DNA病毒]，細(xì)菌[鏈球菌屬(Streptococci)、葡萄球菌屬(Staphylococci)、奈瑟氏球菌屬(Neisseria)、螺旋體屬(Spirochetes)、梭菌屬(Clostridia)、科里氏桿菌屬(Corynebacteria)、利斯特氏菌屬(Listeria)、丹毒絲菌屬(Erysipelothrix)、炭疽(Anthrax)、分枝桿菌屬(Mycobacteria)、腸桿菌科(Ehterobacteriaceae)、弧菌屬(Vibrio)、彎曲桿菌屬(Campyiobacter)、螺桿菌屬(Helicobacter)、嗜血菌屬(Haemophilus)、博德特氏菌屬(Bordetella)、布魯氏菌屬(Brucella)、弗朗西絲氏菌屬(Francisella)、巴斯德氏菌屬(Pasteurella)、耶爾森氏菌屬(Yersinia)、衣原體屬(Chlamydia)、立克次氏體屬(Rickettsiae)以及其它非發(fā)酵革蘭氏陰性菌]，枝原體屬(Mycoplasma)和軍團(tuán)菌屬(Legionella)，原生動(dòng)物[肉足總綱(Sarcodina)、纖毛蟲(Ciliophora)、鞭毛綱(Mastigophora)、孢子綱(Sporozoa)、隱孢殼屬(Cryptosporodium)、肺囊蟲屬(Pneumocystis)]，真菌[球孢子菌屬(Coccidioides)、組織孢漿菌屬(Histoplasma)、芽生菌屬(Blastomycoses)、隱球酵母屬(Cryptoccus)、假絲酵母屬(Candida)、曲霉屬(Aspergillus)、毛霉目(Mucorales)、接合菌綱(Zygomyces)]。
腫瘤相關(guān)的抗原包括，黑素瘤抗原(MART-1、gp100、MAGE抗原)以及本領(lǐng)域已知的其它腫瘤抗原。
本發(fā)明的佐劑組合物或含佐劑的疫苗可利用下列物質(zhì)按常規(guī)方法配制無菌生理相容的載體(例如生理鹽水溶液)，賦形劑，其它佐劑(如果合適的話)，防腐劑，穩(wěn)定劑。它們可呈液體或凍干的形式，供使用前用無菌載體溶解。
另一方面，本發(fā)明提供了一種配制含佐劑的疫苗的方法，該疫苗包含來自病原體的抗原或它們的部分，結(jié)合了有效量生物活性的I型IFN(起佐劑作用)，用來將抗原和佐劑二者同時(shí)送遞到施用部位。IFN的量必須足夠高而在局部起作用達(dá)足夠長(zhǎng)的時(shí)間以便發(fā)揮它的佐劑效果。
這是含佐劑的疫苗的一個(gè)重要方面，既保持抗原和佐劑在注射后以相同的相對(duì)濃度混合，又將它們同時(shí)暴露于處于注射部位的呈遞抗原細(xì)胞4，抗原和佐劑在所述細(xì)胞上發(fā)揮它們的機(jī)能活動(dòng)。
除了與預(yù)防性疫苗的領(lǐng)域相關(guān)的應(yīng)用之外，由于I型IFN不但對(duì)體液免疫而且對(duì)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答有充當(dāng)有效佐劑的能力，本發(fā)明還轉(zhuǎn)向開發(fā)用來治療慢性病(例如，病毒慢性感染)和癌癥的治療疫苗。
在該情況下，這種新型含佐劑的疫苗制劑包含腫瘤相關(guān)的抗原或相關(guān)的病毒抗原(或編碼該抗原的DNA序列)，它與有效量I型IFN結(jié)合而對(duì)患者施用，用來治療癌癥或慢性病毒病。
皮下注射所述佐劑組合物和疫苗或含佐劑的疫苗是優(yōu)選的，這是由于它的使用簡(jiǎn)便。然而，可采用任何其它施用途徑，包括肌內(nèi)、皮內(nèi)和粘膜(例如，鼻內(nèi)和經(jīng)口)途徑。對(duì)于某些病毒感染，鼻內(nèi)施用可代表有價(jià)值的選擇，它導(dǎo)致通過利用很實(shí)際的疫苗送遞感覺模式而誘導(dǎo)有效力的保護(hù)性局部的和/或系統(tǒng)性的免疫。
本發(fā)明還涉及作為強(qiáng)有效的粘膜佐劑的I型IFN。
粘膜佐劑的鑒定是疫苗研究的一個(gè)重要任務(wù)，因?yàn)楸Ｗo(hù)性粘膜免疫的誘導(dǎo)對(duì)于在病原體進(jìn)入部位實(shí)現(xiàn)局部免疫保護(hù)很重要。
當(dāng)I型IFN用作粘膜接種的佐劑時(shí)，可將所述組合物與合適的抗原混合，而且可例如通過在口腔粘膜或鼻粘膜上滴注來施用。已經(jīng)在第一次免疫接種后，粘膜施藥通常增大抗體產(chǎn)生，特別是IgG2a和/或IgA(圖14a和b)。對(duì)粘膜施用本發(fā)明的佐劑組合物與疫苗在體內(nèi)誘導(dǎo)防止病原體攻擊的充分的局部(粘膜免疫)和/或系統(tǒng)保護(hù)。值得注意的是，通過純化在1995年流行的H1N1流感病毒(A/Beijing/262/95(A/H1N1))獲得的可商購(gòu)的疫苗，證實(shí)當(dāng)注入小鼠時(shí)表現(xiàn)為差免疫原性。其實(shí)，穩(wěn)定數(shù)量的小鼠即使在三次疫苗注射后也沒有發(fā)生任何顯著的抗體應(yīng)答。當(dāng)將疫苗與I型IFN一起在肌內(nèi)施用時(shí)，100％的小鼠在一次免疫接種后就出現(xiàn)血清轉(zhuǎn)變，而且在第二次注射后抗體滴定度顯著增大了。
劑量響應(yīng)曲線表明，在IFN劑量和抗體滴定度之間存在線性關(guān)系(圖11)。流感特異性抗體的同種型分析表明，IgG2a抗體亞類增加了，這是小鼠中保護(hù)性Th-1免疫應(yīng)答的一個(gè)典型標(biāo)志(沒有示出)。有趣的是，經(jīng)鼻內(nèi)施用50μl含疫苗和I型IFN的制劑的小鼠顯示系統(tǒng)的和粘膜的抗體應(yīng)答，而單獨(dú)的疫苗卻完全無效(圖12a)。值得注意的是，證實(shí)了用含佐劑的疫苗免疫接種的小鼠的抗體應(yīng)答在體內(nèi)具有抗致死病毒攻擊的保護(hù)作用(圖12b)。更重要的是，已經(jīng)免疫接種一次后，觀察到抗致死劑量的病毒的體內(nèi)保護(hù)作用，不論免疫接種方式如何。此外，還證明受攻擊的動(dòng)物存活率完全與IgG滴定度的增大無關(guān)。其實(shí)，如圖15中所示，單獨(dú)用疫苗免疫接種，雖然導(dǎo)致IgG滴定度的顯著增大，但確實(shí)引起存活率的任何顯著增大。
這些鼻內(nèi)施用所需干擾素的量與皮下途徑所需的量相當(dāng)。例如，從小鼠中的流感疫苗的結(jié)果可推測(cè)，I型IFN的一個(gè)合適劑量可足以激發(fā)相當(dāng)水平的特異性免疫應(yīng)答。然而，在第一個(gè)含IFN佐劑的疫苗劑量后的一天或兩天，施用一個(gè)附加劑量的佐劑改善了免疫應(yīng)答的總體強(qiáng)度。
尤其，在注射以前將I型IFN與相關(guān)的抗原和alum混合可能是有利的(圖6)。
其實(shí)，當(dāng)預(yù)先吸附在alum上時(shí)，在小鼠內(nèi)一次注射IFN使抗原特異性抗體應(yīng)答增強(qiáng)到與3次注射可溶性IFN相似或更大的程度(圖6)。alum預(yù)吸附的加強(qiáng)效果對(duì)于IgG2a產(chǎn)生來說最顯著，說明了Th-1型優(yōu)先響應(yīng)。
因此，長(zhǎng)期存在I型IFN確實(shí)增大了它的佐劑活性。在這方面，聚乙二醇處理過的I型IFN可能由于它們?cè)谧⑸浜蟮母甙雺燮诙哂幸欢ǖ膬?yōu)勢(shì)。此外，特征在于可控、長(zhǎng)期釋放抗原和佐劑兩者的適合人體應(yīng)用的疫苗組合物也是預(yù)期的。這類組合物涉及用來通過緩釋制劑改善治療蛋白的機(jī)能活動(dòng)的常用方法。這些方法使用這樣的制劑，其中，蛋白質(zhì)被包封于由生物可降解的聚合物或脂質(zhì)體制備的微球體中，蛋白質(zhì)從微球體中被緩慢地釋放。
如果需要的話，在施用第一個(gè)疫苗劑量后，可對(duì)受試驗(yàn)者施用加強(qiáng)劑量，這取決于所用抗原的免疫原性和特異性接種方案確定的參數(shù)免疫接種作用范圍。
即使較不顯著，IFN的佐劑效果還可通過下述方法獲得，即，作為分部分的試劑盒，與抗原分開地施用I型IFN，但很靠近抗原注射部位并且同時(shí)施用。皮下注射疫苗是優(yōu)選的(在分部分的試劑盒組合物中也一樣)，這是由于它們的使用簡(jiǎn)便。但是，也可應(yīng)用任何其它施用途徑，包括肌內(nèi)、皮內(nèi)、鼻內(nèi)和經(jīng)口途徑。這些施用方法所需干擾素的量與皮下途徑所需的量相似。
本發(fā)明基于下列意外的主要發(fā)現(xiàn)i)在小鼠內(nèi)同時(shí)注射與適當(dāng)量的I型IFN混合的明確規(guī)定的抗原導(dǎo)致有效地誘導(dǎo)與典型Th-1型免疫應(yīng)答相關(guān)的初次抗體應(yīng)答(圖5、6、9)，它優(yōu)于利用通常可獲得的佐劑觀察到的應(yīng)答(圖7)，但不導(dǎo)致任何毒性；ii)當(dāng)與參比抗原一起注射時(shí)，內(nèi)源性I型IFN是通過佐劑(例如，IFA、CFA、CpG)誘導(dǎo)的Th-1促進(jìn)免疫應(yīng)答的主要介體(圖1～4，8)(所有這些佐劑用于人體時(shí)引起相關(guān)安全性問題)；iii)當(dāng)在小鼠內(nèi)與適當(dāng)量I型IFN一起肌內(nèi)或鼻內(nèi)施用可商購(gòu)的流感疫苗時(shí)，疫苗對(duì)病毒攻擊變成高度免疫原性和保護(hù)性的(圖11，12)。
下文報(bào)導(dǎo)的實(shí)施例中闡明了這些發(fā)現(xiàn)的重要性和細(xì)節(jié)。
實(shí)施例原料和方法小鼠小鼠購(gòu)自Charles River-UK(Margate，Kent，UK)，Charles River-Italy(Calco，Italy)或者來自the Institute for Animal Health的SPF單位(Compton，UK)。C3H/HeJ小鼠購(gòu)自Harlan UKLtd(Blackthorn，UK)。129 SvEv(129)小鼠購(gòu)自the Institute forAnimal Health的SPF單位。缺乏I型IFN受體功能的129背景小鼠(I型IFNR KO)最初購(gòu)自B&K Universal(North Humberside，UK)，放在the Institute for Animal Health的SPF單位保存和喂養(yǎng)。
干擾素按Tovey等采用的方法(Tovey MG，Begon-Lours J和Gresser I，一種大規(guī)模生產(chǎn)強(qiáng)有效的干擾素制劑的方法，實(shí)驗(yàn)生物學(xué)與實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)學(xué)會(huì)會(huì)報(bào)(Proc Soc Exp Biol Med)146809～815，1974)用C243-3細(xì)胞系制備了高滴定度IFN-α/β×107U/mg的蛋白質(zhì)。簡(jiǎn)單地說，通過添加10U/ml處于富含10％ FCS和1mM丁酸鈉的MEM中的IFN而致敏匯合的細(xì)胞。在37℃下培養(yǎng)16小時(shí)后，用處于MEM+0.5％ FCS+5mM茶堿中的新城疫病毒感染C243-3細(xì)胞(感染復(fù)數(shù)為1)。感染18小時(shí)后，收集培養(yǎng)物上清液，在1500rpm下離心10min。在IFN滴定前，將上清液調(diào)節(jié)到pH2.0并在0℃下保持6天。通過抑制水泡性口炎病毒對(duì)Falcon微量培養(yǎng)板中單層培養(yǎng)物中的L細(xì)胞的致細(xì)胞病變效應(yīng)來檢測(cè)IFN。通過離心除去在pH2.0時(shí)處理和對(duì)PBS透析的過程中沉淀的污染蛋白質(zhì)以后，這些IFN制劑的比活是2×106U/mg蛋白質(zhì)。本文中的單位以國(guó)際小鼠參考單位表示。將IFN濃縮并通過硫酸銨沉淀和對(duì)PBS透析而部分純化。在測(cè)試所有IFN制劑對(duì)于抗IFN的L1210細(xì)胞系的任何可能的殘余毒性以前，它們都在4℃下進(jìn)一步經(jīng)歷先后對(duì)0.01M高氯酸和PBS的透析達(dá)24小時(shí)。這些部分純化的IFN制劑滴定度至少是2×107U/mg蛋白質(zhì)并且不含內(nèi)毒素(利用鱟變形細(xì)胞溶解物試驗(yàn)測(cè)定的)。通過利用mAbs對(duì)IFNs的中和試驗(yàn)評(píng)估，證實(shí)它們包含約75％ IFN-β和25％IFN-α，如Belardelli F等在下列文獻(xiàn)中詳細(xì)描述，“利用抗小鼠干擾素的單克隆抗體對(duì)小鼠腹膜巨噬細(xì)胞內(nèi)自發(fā)、誘導(dǎo)的干擾素的表達(dá)的研究”，普通病毒學(xué)雜志(J GenVirol)，682203～2212，1987。通過在偶聯(lián)了抗IFN-β的大鼠單克隆抗體的瓊脂糖柱上的親和層析制備了高滴定度純化的IFN-β(2×109U/mg蛋白質(zhì))(Kawade Y和Watanabe Y，抗小鼠干擾素α和β的大鼠單克隆抗體的表征。關(guān)于干擾素體系的生物學(xué)的第三次國(guó)際TNO會(huì)議會(huì)議錄。In the Biology of the Interferon System，Dordrecht，197～202，1987)。
抗原和佐劑分別從Stratech Scientific Ltd，Luton，UK和Sigma Chemical Co獲得了雞丙種球蛋白(CGG)和卵清蛋白(OVA)。流感疫苗是亞單位X-127單價(jià)疫苗，是從A/Beijing/262/95(H1/N1)流感病毒株制備的，由Chiron Corporation(Emeryville，CA)友好提供。
將抗原溶于PBS并過濾滅菌。利用兩支玻璃注射器和Luer鎖緊套口噬菌體頸圈，將不完全弗氏佐劑(IFA)和完全弗氏佐劑(CFA)(SigmaChemical Co)各自與抗原溶液以1∶1v/v比率混合并乳化，直到形成穩(wěn)定的乳液。將alum(氫氧化鋁凝膠，Sigma Chemical Co)以1∶20 w/v的比率溶于抗原溶液并調(diào)節(jié)pH到6.5。在室溫下保溫1h后，將溶液離心，將離心片重懸浮于先前體積的生理鹽水中。通過RocheDiagnostic Milan，Italy合成了CpG ODN(CpG)。將200μg CpG溶于1ml最終體積含200μg OVA的溶液。用于該研究的CpG是用硫代磷酸酯主鏈(backbone)制備的，它具有如下序列TsGsAsCsTsGsTsGsAsAsCsGsTsTsCsGsAsGsAsTsGsA。將聚肌胞苷酸(poly(IC)(Sigma Chemical Co))以10mg/ml的濃度溶于生理鹽水。就在每次試驗(yàn)以前將冷凍的等分試樣融化，將0.15mg溶于0.15ml體積生理鹽水的poly(I:C)在腹膜內(nèi)注射。將MF59與抗原溶液以1∶1(v/v)比率混合并通過吸移乳化。
用CGG免疫接種的方案所有的免疫接種都是通過皮下注射100μg CGG完成的。當(dāng)單獨(dú)施用時(shí)或者與100μg poly IC(Sigma Chemical Co.Ltd，Dorset，UK)、105U IFN-αβ或105U所示純化過的IFN-β混合施用時(shí)，施用呈溶解的形式(溶于PBS中)的CGG。當(dāng)與Titermax(CytRx Corporation，Norcross，GA)、IFA(Sigma)或CFA(Sigma)一起注射時(shí)，在注射以前用佐劑乳化等體積溶于PBS的CGG。在某些試驗(yàn)中，將I型IFN、Titermax或IFA施用數(shù)次。所有情況下，在初次注射部位對(duì)小鼠皮下注射。當(dāng)測(cè)試記憶反應(yīng)時(shí)，就在用CGG攻擊前將小鼠抽血以確定攻擊前的抗體水平。在CGG攻擊6天后，將相同的小鼠抽血。
用OVA免疫接種的方案除了Poly(I:C)以外，全部佐劑都總是以50μl/小鼠的體積(含有或未含OVA)經(jīng)皮內(nèi)注射。OVA濃度總是10μg/小鼠。應(yīng)用了兩個(gè)不同的免疫接種方案。為了達(dá)到良好的抗體應(yīng)答和增殖反應(yīng)，在第0天用OVA+佐劑注射小鼠，在10天和17天后，單獨(dú)用OVA加強(qiáng)。反之，對(duì)于被選定用于遲發(fā)型超敏反應(yīng)(DTH)測(cè)定的小鼠在第0天以及10和17天都用OVA+佐劑注射小鼠。全部免疫接種試驗(yàn)都包括用單獨(dú)的OVA和作為對(duì)比的生理鹽水處理的前肢。就在隨后的抗原注射以前，從后眶靜脈叢抽取血樣。采集血清，在進(jìn)一步檢測(cè)以前貯存于-20℃。
用流感(FLU)疫苗免疫接種的方案對(duì)于肌內(nèi)(i.m.)免疫接種來說，用最終體積為200μl、包含疫苗(15μg)和生理鹽水、或者疫苗(15μg)和IFN(2×105U)的溶液、或者單獨(dú)的生理鹽水注射小鼠。對(duì)于鼻內(nèi)(i.n.)免疫接種來說，用一滴(50μl)含相同量的疫苗和生理鹽水、或者疫苗和IFN的溶液、或者單獨(dú)的生理鹽水滴注輕度麻醉的小鼠。在初次免疫接種后14天，施用包含相同量的疫苗和IFN的加強(qiáng)劑量。
通過酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法檢測(cè)血清抗體在室溫下的96孔Flexible小平板(Falcon，Becton Dickinson，Oxford，UK)內(nèi)涂布CGG(5μg/ml于碳酸鹽緩沖液中-pH9.6)一夜。在37℃下用含有4％奶粉的PBS封阻平板1小時(shí)，再用PBS-Tween(0.05％)洗滌三次。在室溫下往孔中添加血清在PBS-1％牛奶中的12倍系列稀釋液達(dá)1小時(shí)。洗滌3次后，在室溫下往孔中添加生物素化大鼠抗小鼠抗體[抗小鼠IgM(R6-60.2)、IgG1(A85-1)、IgG2a(R19-15)、IgG2b(12-3)、IgG3(R40-82)或IgE(R35-72)(Becton Dickinson)]達(dá)1小時(shí)。洗滌3次后，在室溫下添加鏈霉抗生物素-HRP(BectonDickinson)達(dá)1小時(shí)。將OPD片(Sigma)用作過氧化物酶底物。在最高滴定度血清的最高稀釋度升到高于背景以前，通過添加50μg 3M HCl終止反應(yīng)。在SPECTRAmax(Molecular Devices，Sunnyvale，CA)上492nm處讀取光密度。結(jié)果以終點(diǎn)滴定度的倒數(shù)表示，它們是利用Excel上設(shè)計(jì)的自動(dòng)化程序測(cè)定的。簡(jiǎn)單地說，對(duì)每種抗體同種型計(jì)算了關(guān)于OD值的正性閾值，以3只對(duì)比小鼠血清(來自未處理的小鼠或者用IFN-α/β或單獨(dú)的poly IC處理的小鼠的血清)的所有稀釋液平均值+3 SD表示。全部稀釋液的背景水平都很低(通常約為0.08)并且在試驗(yàn)之間沒有顯著變化。對(duì)于給定的血清樣品，終點(diǎn)滴定度確定為低于正性閾值的第一次稀釋。由于終點(diǎn)滴定度是任意的單位，所以必須在相同分析中考慮測(cè)定結(jié)果而且在試驗(yàn)之間不能直接比較。為此，在每次試驗(yàn)中同時(shí)檢測(cè)所有的樣品。
為了測(cè)定小鼠血清中存在的CGG特異性抗體的大致濃度，以半定量方法通過與小鼠Ig標(biāo)準(zhǔn)比較而進(jìn)行了酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定。如上述那樣測(cè)定了CGG特異性抗體，不同的是利用與堿性磷酸酶(AP)綴合的同種型特異性多克隆山羊抗小鼠抗體(都來自Southern BiotechnologyAssociates Inc，Birmingham，AL，USA)顯示抗體。為了建立標(biāo)準(zhǔn)，將小平板涂布未標(biāo)記的同種型特異性多克隆山羊抗小鼠抗體(5μg/ml)(Southern Biotechnology)。如上述那樣封阻平板，然后以已知濃度添加純化過的小鼠抗體(小鼠Ig標(biāo)準(zhǔn)組來自SouthernBiotechnology)。洗滌后，利用與AP綴合的同種型特異性山羊抗小鼠抗體揭示標(biāo)準(zhǔn)物。將p-NPP片(Sigma)用作AP底物。通過添加3M NaOH終止酶反應(yīng)。在405nm處讀取OD。應(yīng)用SoftmaxPro(MolecularDevices，Sunnyvale，CA)，我們?yōu)楦魍N型建立了標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算了CGG特異性抗體的量。
為了測(cè)定OVA特異性抗體水平，進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn)的、直接的酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定。簡(jiǎn)單地說，用100μg 1μg/ml(對(duì)于總IgG測(cè)定)或4μg/ml(對(duì)于IgG2a和IgG1測(cè)定)在pH9.6的NaHCO3緩沖液(涂布緩沖液)中稀釋的卵清蛋白溶液(Sigma Chemical Co，St.Louis，MO)涂布96孔平底微量培養(yǎng)板(DYNEX Immulon 4MBX)。在4℃下保溫一夜后，用PBS+0.01％ Tween 20(洗滌溶液)洗滌平板三次，在室溫下用含5％牛血清白蛋白(BSA)(Sigma Chemical Co，St.Louis，MO)的PBS封阻達(dá)2hr。然后在每個(gè)孔中添加100μl預(yù)先稀釋的(以1∶2的比率)血清樣品，在37℃下保溫1小時(shí)30分。洗滌后，在37℃下將平板與100μl過氧化物酶綴合的次級(jí)抗體一起保溫1h。應(yīng)用了下列次級(jí)抗體抗總小鼠IgG(Sigma Chemical Co，St.Louis，MO)，在含5％ BSA的PBS中稀釋1∶1000；抗小鼠IgG2a(Cappel ResearchProducts，Durham，NC)，稀釋1∶200；抗小鼠IgG1(Cappel ResearchProducts，Durham，NC)，稀釋1∶400。在保溫結(jié)束時(shí)，將平板洗滌三次，在每個(gè)孔內(nèi)添加100μl酶底物溶液(4 mg鄰苯二胺，溶于20ml 0.1M含0.001％H2O2的磷酸鹽-檸檬酸鹽緩沖液中)，在暗處放置約20min。用50μl 4N H2SO4終止酶反應(yīng)，在微量培養(yǎng)板自動(dòng)讀數(shù)器上450nm處讀取平板。結(jié)果以每個(gè)試驗(yàn)條件三份血清的終點(diǎn)稀釋平均值表示，其中，終點(diǎn)是以導(dǎo)致吸光度值高于包括于每次檢測(cè)中的三個(gè)負(fù)對(duì)比樣品的平均值±2s.d.的最終血清稀釋確定的。
DC制備和注射DC是利用以前描述的方法[Vremec D等，“從小鼠胸腺和脾純化的樹突細(xì)胞的表面表型對(duì)于樹突細(xì)胞的亞群表達(dá)CD8的研究”，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志(J Exp Med)，17647～58，1992]從脾分離的。簡(jiǎn)單地說，將得自129小鼠或I型IFNR KO小鼠的脾切成小片并消化，即，在攪拌下，在含5％FCS、膠原酶III(1mg/ml，Lorne Laboratories，Reading，UK)和脫氧核糖核酸酶I(0.6mg/ml，Sigma，St Louis，MO)的RPMI中在37℃消化5min，接著在室溫下消化15min。利用Nycodenz(Life Technology Paisley，UK)梯度獲得了富含DC的細(xì)胞群體。然后，在冰上用處于PBS-EDTA-FCS中的抗CD11c-FITC(BectonDickinson，Oxford，UK)標(biāo)記低密度細(xì)胞級(jí)分達(dá)20min。洗滌后，將細(xì)胞過濾(70μm細(xì)胞濾過器，F(xiàn)alcon)并在MoFlow流式細(xì)胞器(Cytomation，F(xiàn)ort Collins，CO)上分選CD11c+細(xì)胞，所得群體是＞98％CD11c+。用PBS洗滌兩次后，在37℃下，將純化后的DC在單獨(dú)的PBS或者在含100μg CGG的PBS中保溫30min。將5～7×105包含或不含CGG的純化過的DC經(jīng)皮下注入I型IFNR KO小鼠±105UIFN-α/β。1天和2天后，對(duì)于接受CGG+DC+IFN-α/β的小鼠另外經(jīng)皮下注射105UIFN-α/β。
T細(xì)胞增殖和細(xì)胞因子檢測(cè)
CGG特異性增殖檢測(cè)。
將DrLNs切割成小片，在室溫和頻繁混合下，在含5％FCS、膠原酶III(1mg/ml)和脫氧核糖核酸酶I(0.6mg/ml)的RPMI中消化20min。然后過濾(70μm)細(xì)胞懸浮物，洗滌，在1500rpm下離心10min。就增殖分析來說，將沒有分離的細(xì)胞(每孔5×105)置于96孔板的一式三份孔中的完全培養(yǎng)基[RPMI 1640，增補(bǔ)了10％熱滅活的FCS(PAALaboratories)，50μM 2-ME(Sigma)，10mM HEPES，5％ NCTC培養(yǎng)基，100U/ml青霉素，100μg/ml鏈霉素和250μg/ml艮他霉素(都來自Life Technologies)]±CGG(20μg/孔)中培養(yǎng)。在培養(yǎng)的第4天，用1μCi[3H]-胸苷使孔脈沖8小時(shí)。然后收獲平板并利用MicroBeta TRILUX計(jì)數(shù)器(Wallac，Turku，F(xiàn)inland)測(cè)定摻入的[3H]-胸苷。對(duì)于細(xì)胞因子檢測(cè)，將DrLN細(xì)胞與anti-ClassII(TIB120)、anti-CD8(3155)和anti-CD11b(M1/70)在冰上保溫15min。洗滌后，應(yīng)用綿羊抗大鼠IgG和抗小鼠IgG磁性Dynabeads(Dynal，Oslo，Norway)通過負(fù)選擇純化CD4+T細(xì)胞。在96孔板的一式三份孔內(nèi)完全培養(yǎng)基中，將2×104純化過的CD4+T細(xì)胞與5×105來自未處理同源小鼠的T-缺失的脾細(xì)胞一起培養(yǎng)。T-缺失的脾細(xì)胞是這樣制備的，即，在37℃下將脾細(xì)胞與大鼠抗小鼠-Thy-1抗體(T24)和豚鼠補(bǔ)體(VHBIO Ltd，Gosford，UK)一起保溫45min。在培養(yǎng)前，在37℃下將T-缺失的脾細(xì)胞預(yù)先保溫±CGG(20μg/孔)達(dá)1小時(shí)，并在3000拉德下輻照。培養(yǎng)3天后，收獲上清液，利用關(guān)于小鼠IFN-γ和來自R&D(Abingdon，Oxon，UK)的IL-4的Quantikine M試劑盒按生產(chǎn)商的指示測(cè)定細(xì)胞因子。
OVA特異性增殖檢測(cè)為了測(cè)定抗原誘導(dǎo)的增殖反應(yīng)，在第一次免疫接種32～35天后殺死小鼠。在平底96孔淺盤中以5×105于0.2ml/孔含不同濃度OVA(0、50、100和200μg/ml)的10％ FCS RPMI培養(yǎng)基中的濃度培養(yǎng)來自每只小鼠脾的單脾細(xì)胞懸浮物的細(xì)胞。在37℃下5％ CO2的濕潤(rùn)培養(yǎng)箱中保溫4天后，添加0.5μCi的3H胸苷(Dupont-NEN，Boston，MA)。進(jìn)一步保溫18小時(shí)后，在助濾器(filtermate)A(Wallac，Turku，F(xiàn)inland)上收獲細(xì)胞并在閃爍計(jì)數(shù)器(Betaplate，Wallac，Turku，F(xiàn)inland)上讀出放射性活度。結(jié)果以一式三份測(cè)試的三只小鼠的平均cpm±SD.表示。
CGG特異性Elispot檢測(cè)用CGG以20μg/ml于pH9.6的碳酸鹽緩沖液中的濃度涂布Multi-Screen-IP無菌Elispot平板(Millipore，Walford，UK)一夜。用PBS洗滌5次后，在37℃下用4％奶的PBS溶液將平板封阻2小時(shí)并用PBS洗滌5次。如上述那樣從DrLNs制備細(xì)胞懸浮物，洗滌，在1500rpm下離心10min，重懸浮于增補(bǔ)了15％ FCS的完全培養(yǎng)基中。將全部樣品一式三份以數(shù)個(gè)不同的細(xì)胞濃度(2×104～5×105個(gè)細(xì)胞/孔)鋪板。在37℃下5％CO2中培養(yǎng)一夜后，再用PBS-Tween(0.05％)徹底洗滌平板。通過在室溫下與綴合了AP的同種型特異性多克隆山羊抗小鼠抗體(Southern Biotechnology)保溫2小時(shí)而揭示CGG特異性抗體。洗滌后，將以1mg/ml在(0.1M Tris/HCl，pH9.5；10％二乙醇胺；0.1M NaCl，5mM MgCl2)中稀釋的BCIP(Sigma)用作AP的底物。通過用自來水洗滌平板而終止反應(yīng)。在顯微鏡下數(shù)斑點(diǎn)。
實(shí)施例1.在用CGG+poly IC免疫接種的小鼠內(nèi)的抗體應(yīng)答I型IFN的重要性首先通過應(yīng)用聚肌胞苷酸(poly IC)，一種合成的雙鏈RNA，在體內(nèi)誘導(dǎo)I型IFN的產(chǎn)生而測(cè)試了I型IFN作為佐劑的能力。通過皮下注射雞丙種球蛋白(CGG)的PBS溶液將C57BL/6(B6)小鼠免疫接種，并檢驗(yàn)了一起注射poly IC的效果。(通過皮下注射100μg雞丙種球蛋白(CGG)的PBS溶液，或者皮下注射與100μg poly IC混合的相同量CGG的PBS溶液，將C57BL/6(B6)小鼠免疫接種)。免疫接種10天后，通過酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法檢測(cè)血清以確定各種同種型的CGG特異性抗體的存在。
圖1A中報(bào)導(dǎo)了相關(guān)結(jié)果。單獨(dú)的CGG免疫原性差，而且響應(yīng)主要局限于IgG1亞類的抗體；檢測(cè)到IgM、IgG2b、IgG2a和IgG3抗體都在很低水平。一起注射poly IC刺激了CGG特異性抗體滴定度的明顯增大，它適用于IgG的所有亞類(圖1A)。這包括IgG1、IgG2b、IgG2a和IgG3抗體的滴定度分別增大3-、4.2-、9-和8.4-倍。
雖然已知poly IC是I型IFN的有效誘導(dǎo)物，但它還誘導(dǎo)其它細(xì)胞因子。因此，重要的是確定polyIC的佐劑活性實(shí)際上是否依賴于I型IFN。為此，我們比較了poly IC在缺乏I型IFN功能受體的小鼠(I型IFNR KO小鼠，它們都基于129背景)中與在對(duì)比(129)小鼠中增強(qiáng)抗體應(yīng)答的能力(免疫接種是按前述那樣進(jìn)行的)。
象在B6小鼠中那樣，poly IC顯著增強(qiáng)了對(duì)比129小鼠中對(duì)CGG的抗體應(yīng)答(圖1B)。反之，poly IC在I型IFNR KO小鼠中大為降低了這種能力。在I型IFNR KO小鼠中觀察到IgM、IgG1和IgG2b滴定度的小幅升高，說明poly IC能不依賴于I型IFN而增強(qiáng)這些同種型的產(chǎn)生。然而，poly IC的大部分效果依賴于I型IFN，因?yàn)樵贗型IFNR KO小鼠中這些抗體的滴定度比在對(duì)比小鼠中低得多。
此外，在I型IFNR KO小鼠中，IgG2a和IgG3抗CGG抗體的產(chǎn)生根本不受poly IC的刺激?？傊?，這些信息表明，誘導(dǎo)I型IFN在宿主中的表達(dá)刺激了對(duì)可溶性蛋白質(zhì)抗原的抗體應(yīng)答的顯著增大，它包括所有IgG亞類的抗體。
實(shí)施例2.用OVA+佐劑免疫接種的小鼠中的抗體應(yīng)答I型IFN的重要性用首次皮內(nèi)注射OVA、OVA+IFA、OVA+CFA、OVA+CpG或OVA+alum來處理小鼠。對(duì)于抗原，應(yīng)用了10μg于50μl中的劑量，將IFA和CFA與抗原以1∶1v/v比率混合并乳化直到獲得穩(wěn)定的乳液，以10μg的量應(yīng)用CpG并與抗原混合，而應(yīng)用的alum量是吸附OVA的足夠量。在首次免疫接種后，用單獨(dú)的OVA進(jìn)行了第二次(第10天)和第三次(第17天)處理。用生理鹽水處理對(duì)比小鼠。結(jié)果表明，單獨(dú)的OVA免疫原性差，激發(fā)很低的抗體應(yīng)答，而佐劑的一起注射導(dǎo)致OVA特異性抗體應(yīng)答的增大(圖2)。在IFA、CFA、或CpG的情況下，這種增強(qiáng)作用特別顯著，而對(duì)于alum則較不顯著。IgG亞類表征說明了，IFA和CFA對(duì)IgG1和IgG2a亞類這兩者(通常分別與Th-2和Th-1型的抗體應(yīng)答相關(guān))起有效的佐劑作用(圖2A)，而CpG對(duì)IgG2a(Th-1型)以及alum對(duì)IgG1(Th-2型)的特異性更大(圖2B)。為了確定佐劑活性是否由I型IFN介導(dǎo)，我們比較了所有這些佐劑在缺乏I型IFN的功能受體的小鼠(I型IFNR KO小鼠C3H/HeJ)內(nèi)增強(qiáng)抗體應(yīng)答的能力。結(jié)果表明，與對(duì)比小鼠相比，I型IFNR KO小鼠內(nèi)的OVA特異性IgG2a和IgG1亞類僅僅稍微增大了(圖2A和2B)。這證實(shí)了I型IFN在增強(qiáng)由典型Th-1促進(jìn)佐劑激發(fā)的抗體應(yīng)答中所起的功能作用。
實(shí)施例3.來自用CGG+poly IC免疫接種的小鼠的T細(xì)胞的體外增殖和IFN-γ產(chǎn)生I型IFN的重要性還估測(cè)了I型IFN對(duì)T細(xì)胞致敏的影響。這最初是通過測(cè)定LN T細(xì)胞在體外受CGG再刺激時(shí)增殖的能力而進(jìn)行的。在免疫接種(如實(shí)施例1中所述)10天后除去導(dǎo)流LNs(DrLNs)并將形成的細(xì)胞懸浮物在存在或不存在CGG時(shí)培養(yǎng)。將poly IC與CGG一起注入對(duì)比(129)小鼠導(dǎo)致比單獨(dú)用CGG免疫接種高得多的CGG特異性體外增殖反應(yīng)(圖3A)；用BrdU進(jìn)行脈沖處理說明了，體外增殖的大部分細(xì)胞都是CD4+(沒有示出數(shù)據(jù))。T細(xì)胞致敏的增強(qiáng)部分地不依賴于I型IFN，因?yàn)镮型IFNRKO小鼠的polyIC處理也導(dǎo)致體外增殖反應(yīng)的一定增大(圖3A)。但是，來自CGG+poly IC注射的I型IFNR KO小鼠的細(xì)胞的增殖比來自CGG+poly IC注射的對(duì)比小鼠的低得多，說明I型IFN實(shí)際上強(qiáng)烈地增強(qiáng)了體內(nèi)T細(xì)胞響應(yīng)。當(dāng)檢驗(yàn)體外再刺激的CD4+T細(xì)胞的細(xì)胞因子產(chǎn)生時(shí)，這也是明顯的(圖3B)。
因此，雖然當(dāng)通過CGG體外刺激時(shí)來自單獨(dú)用CGG免疫接種的小鼠的CD4+DrLN細(xì)胞分泌很少(如果有的話)IFN-γ，但是來自poly IC+CGG注射的小鼠的CD4+細(xì)胞產(chǎn)生的IFN-γ量顯著更高。重要的是，polyIC增強(qiáng)IFNγ-分泌CD4+T細(xì)胞的致敏的程度在對(duì)比小鼠中比I型IFNRKO小鼠中要大得多。反之，在所有的組中(它們并非彼此顯著不同)從CD4+細(xì)胞分泌少量IL-4。因此，I型IFN的體外誘導(dǎo)增強(qiáng)了T細(xì)胞致敏，促進(jìn)IFN γ-分泌CD4+T細(xì)胞的產(chǎn)生。
實(shí)施例4.內(nèi)源性I型IFN在用OVA+佐劑免疫接種的小鼠內(nèi)的體外T細(xì)胞增殖和DTH響應(yīng)中的作用在實(shí)施例2中所述的免疫接種結(jié)束時(shí)，殺死小鼠并取出脾進(jìn)行對(duì)OVA的增殖檢測(cè)。在圖4中，示出了用含100μg OVA的培養(yǎng)基培養(yǎng)的脾細(xì)胞的3H胸苷攝取結(jié)果。在該試驗(yàn)中，來自用OVA、OVA+CFA(圖4A)或者OVA、OVA+CpG、或OVA+alum(圖4B)接種的I型IFN R+/+小鼠的所有脾細(xì)胞與生理鹽水處理的對(duì)比物相比顯示了顯著的增殖(OVA+alum例外)，而在任意I型IFNR KO小鼠處理組內(nèi)沒有檢測(cè)到增殖。在平行試驗(yàn)中，用稍微不同的方案接種了一些正常小鼠和I型IFNR KO小鼠，其中，還在第二次和第三次免疫接種中施用了佐劑，隨后用OVA攻擊腳墊(footpad)以測(cè)定DTH響應(yīng)(圖4C和4D)。與對(duì)比物相比，在I型IFNR KO小鼠中觀察到的缺損性DTH響應(yīng)說明了，佐劑誘導(dǎo)的DTH響應(yīng)由內(nèi)源性I型IFN介導(dǎo)。在這方面，值得一提的是，能誘導(dǎo)DTH的所有佐劑在小鼠內(nèi)注射后也刺激I型IFN產(chǎn)生(沒有示出)。
實(shí)施例5.通過用I型IFN處理來刺激初級(jí)抗體應(yīng)答起初利用部分純化的鼠I型IFN的高滴定度制劑(它包含IFN-α和IFN-β)研究了外源性I型IFN對(duì)抗體應(yīng)答的影響。對(duì)B6小鼠皮下注射100μg單獨(dú)的CGG或相同劑量的CGG+105U IFN-α/β(IFN 1X)。此外，用CGG+IFN-α/β注射的不同組小鼠在1天后接受了單獨(dú)的IFN-α/β(105U)第二次皮下注射(IFN 2X)，或者在1天和2天后接受了IFN-α/β(105U)皮下注射(IFN 3X)。如圖5A中所示，用IFN-α/β處理小鼠強(qiáng)烈地增大了CGG特異性抗體應(yīng)答；在接受3次注射I型IFN的小鼠中效果最顯著，并且關(guān)于IgG的所有亞類都是明顯的。在任意小鼠組內(nèi)都檢測(cè)不出CGG特異性IgE(沒有示出數(shù)據(jù))。用IFN-α/β處理同樣增強(qiáng)了LPS無反應(yīng)的C3H/HeJ小鼠中的抗體應(yīng)答，不考慮內(nèi)毒素污染的可能性(沒有示出數(shù)據(jù))。
利用親和純化的IFN-β進(jìn)行了同樣的試驗(yàn)(圖5B)。在該情況下，一次注射IFN-β足以增強(qiáng)初級(jí)抗體應(yīng)答，不過，至于部分純化的IFN-α/β，最高抗體滴定度是在三次注射IFN-β后達(dá)到的。一次、兩次或三次注射IFN-β后，抗體滴定度分別增大5，6和8倍(對(duì)于IgM)；6.4，8.5和12.8倍(對(duì)于IgG1)；13.3，16和26.6倍(對(duì)于IgG2b)；25.6，32和153.6倍(對(duì)于IgG2a)；16.6，64和117.3倍(對(duì)于IgG3)。與利用部分純化的IFN-α/β的試驗(yàn)一起考慮，這些結(jié)果清楚地表明，在免疫應(yīng)答早期施用I型IFN顯著增大了對(duì)可溶性蛋白質(zhì)抗原的初級(jí)抗體應(yīng)答。
實(shí)施例6.用CGG+預(yù)先吸附在alum上的I型IFN接種的小鼠中的抗體應(yīng)答為了確定延長(zhǎng)I型IFN的半壽期是否增強(qiáng)它作為佐劑的能力，在皮下注射以前將I型IFN-α/βU)與CGG(100μg)和飽和量的alum混合；證實(shí)了這種策略大為增強(qiáng)了IL-12(24)的佐劑活性。意外地，當(dāng)預(yù)先吸附到alum上時(shí)，一次注射I型IFN使CGG特異性抗體應(yīng)答增強(qiáng)到與3次注射可溶性I型IFN相似的或更大的程度(圖6)。
alum預(yù)先吸附的增強(qiáng)效果對(duì)于IgG2a產(chǎn)生來說最為顯著。該結(jié)果啟示，延長(zhǎng)I型IFN的存在確實(shí)增大了它的佐劑活性并且可能具有關(guān)于利用I型IFN為佐劑的實(shí)際意義。
實(shí)施例7.I型IFN和其它佐劑的比較為了進(jìn)一步估測(cè)I型IFN作為佐劑的效率，我們比較了它們與商品化佐劑增強(qiáng)初級(jí)抗體應(yīng)答的能力。用兩種油基佐劑進(jìn)行了初始比較，即，不完全弗氏佐劑(IFA)和Titermax。
將這些佐劑與含有100μg CGG的抗原溶液以1∶1 v/v比率混合并乳化直到形成穩(wěn)定的乳液。然后，將小鼠免疫接種，分析血清中抗CGG抗體的存在。雖然IFA和Titermax刺激了更高水平的IgG1抗體，但I(xiàn)型IFN誘導(dǎo)IgM和IgG2b抗體的能力相當(dāng)于這些佐劑，而且在增大IgG2a和IgG3抗體的產(chǎn)生方面遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于這些佐劑(圖7)。
作為佐劑活性的更嚴(yán)謹(jǐn)?shù)脑囼?yàn)，比較了I型IFN與完全弗氏佐劑(CFA)。人們長(zhǎng)期認(rèn)為CFA是對(duì)小鼠的佐劑活性的“黃金標(biāo)準(zhǔn)”，而且已知它增強(qiáng)所有同種型的抗體的產(chǎn)生。所以，我們比較了免疫接種10天后，用單獨(dú)的CGG、CGG+CFA或CGG+IFN-α/β注射的對(duì)比小鼠(WT 129)和IFN-IR KO小鼠中CGG特異性抗體的滴定度(圖8)。
在對(duì)比小鼠中，用CGG+IFN-α/β或CGG+CFA注射的小鼠內(nèi)的抗體滴定度比用單獨(dú)的CGG免疫接種的那些小鼠中的更高。顯著的是，IFN-α/β的佐劑活性比CFA更有利。其實(shí)，雖然CFA誘導(dǎo)更高滴定度的IgM抗體(僅僅在129背景上)，但I(xiàn)FN-α/β刺激了相似滴定度的IgG1和IgG2b抗體的產(chǎn)生。此外，IFN-α/β比CFA誘導(dǎo)了更高水平的IgG2a和(至少對(duì)129sv背景)IgG3抗體。因此，這些結(jié)果表明，IFN-α/β確實(shí)具有強(qiáng)有效的佐劑活性。
當(dāng)考慮下列情況時(shí)效果特別顯著，即，被比較的響應(yīng)是針對(duì)可溶性蛋白質(zhì)+可溶性IFN-α/β的那些，它們可能被迅速清除，以及針對(duì)CFA的油性乳液，它能長(zhǎng)時(shí)間保留在注射部位。
實(shí)施例8.內(nèi)源性I型IFN在CFA的佐劑活性中與在刺激對(duì)單獨(dú)蛋白質(zhì)的響應(yīng)中的作用CFA和IFA或Titermax的佐劑活性之間一個(gè)值得注意的差異是，只有前者能誘導(dǎo)顯著滴定度的IgG2a或IgG3抗體。因?yàn)檫@是I型IFN享有的性質(zhì)，它引起了這個(gè)問題，即，CFA這樣的能力是否涉及通過該佐劑誘導(dǎo)內(nèi)源性I型IFN。由CFA誘導(dǎo)的I型IFN似乎有可能，假定CFA的關(guān)鍵組分是熱殺死的分枝桿菌，而已知像CpG DNA這樣的細(xì)菌組分可刺激I型IFN的產(chǎn)生。
為了檢驗(yàn)這個(gè)假設(shè)，我們比較了IFN-α/β和CFA在I型IFNR KO小鼠與對(duì)比小鼠中增強(qiáng)對(duì)CGG的抗體應(yīng)答的能力(圖8)。正如所料，IFN-α/β在I型IFNR KO小鼠中完全不能增強(qiáng)對(duì)CGG的響應(yīng)。重要的是，在I型IFNR KO小鼠中還高度缺乏CFA促進(jìn)抗體應(yīng)答的能力。雖然CFA在I型IFNR KO小鼠中仍然誘導(dǎo)高滴定度的IgG1抗體，但與單獨(dú)用CGG免疫接種相比，不再有IgM、IgG2b、IgG2a或IgG3抗體的任何增強(qiáng)。這些結(jié)果闡明了I型IFN在CFA的佐劑活性中的重要作用。
實(shí)施例9.通過I型IFN誘導(dǎo)長(zhǎng)期抗體產(chǎn)生和記憶已經(jīng)證實(shí)了I型IFN增強(qiáng)初級(jí)抗體應(yīng)答，有意義的是確定該應(yīng)答是否是長(zhǎng)久的。最初，通過檢測(cè)一次注射CGG或者CGG+3次IFN-α/β注射(如實(shí)施例5中所述)6個(gè)月后小鼠的血清，我們檢驗(yàn)了長(zhǎng)期抗體產(chǎn)生(圖9A)。單獨(dú)用CGG致敏的小鼠在6個(gè)月后具有極低水平的CGG特異性抗體。
反之，用CGG+IFN-α/β致敏的小鼠在其血清中仍然具有顯著滴定度的CGG特異性抗體。IgG3例外(對(duì)于它來說，滴定度很低并且沒有顯著不同于單獨(dú)用CGG致敏的小鼠中的那些)，所有試驗(yàn)的同種型抗體都存在。因此，在致敏過程中注射I型IFN允許長(zhǎng)期抗體產(chǎn)生。
仍有爭(zhēng)議的是，長(zhǎng)期抗體產(chǎn)生是通過長(zhǎng)壽命漿細(xì)胞保持的還是通過補(bǔ)充來自記憶B細(xì)胞的抗體產(chǎn)生細(xì)胞保持的。因此，有趣的是研究記憶是否也是通過在I型IFN存在下的免疫接種誘導(dǎo)的。為此，我們檢驗(yàn)了6個(gè)月前致敏的小鼠以建立對(duì)CGG的再次應(yīng)答的能力。因此，再次單獨(dú)用CGG(100μg)注射已經(jīng)在6個(gè)月前被注射單獨(dú)的CGG或CGG+3次IFN-α/β注射的小鼠。為了將對(duì)CGG的初次應(yīng)答產(chǎn)生的貢獻(xiàn)減到最小，在攻擊后第6天研究了再次應(yīng)答，將首次用于實(shí)驗(yàn)的未致敏的小鼠用作對(duì)比。比較了再次注射CGG前后同樣的小鼠內(nèi)CGG特異性抗體滴定度(圖9B)。
在6個(gè)月前單獨(dú)用CGG致敏的小鼠中，對(duì)CGG攻擊的響應(yīng)與首次用于實(shí)驗(yàn)的小鼠中的應(yīng)答區(qū)分不開，說明了單獨(dú)用CGG致敏6個(gè)月后對(duì)CGG沒有記憶。然而，在鮮明的對(duì)比中，6個(gè)月前用CGG+IFN-α/β致敏的小鼠確實(shí)建立了對(duì)CGG迅速的再次應(yīng)答。不過，該再次應(yīng)答似乎局限于IgG2b和IgG2a抗體同種型，盡管實(shí)際上高滴定度的IgG1抗體持久存留在這些小鼠中。這些結(jié)果清楚地說明了，在一次注射可溶性蛋白質(zhì)抗原后，I型IFN促進(jìn)了長(zhǎng)壽命記憶的產(chǎn)生。
實(shí)施例10.通過I型IFN刺激樹突細(xì)胞而發(fā)生抗體應(yīng)答和同種型轉(zhuǎn)換的增強(qiáng)雖然I型IFN明顯能顯著增強(qiáng)抗體應(yīng)答的強(qiáng)度和向各種IgG亞類的轉(zhuǎn)換，但還不知它們的體內(nèi)作用機(jī)制。我們?cè)O(shè)計(jì)了一個(gè)采用的轉(zhuǎn)換模型，其中，DC是能響應(yīng)IFN-α/β的僅有細(xì)胞。在這些試驗(yàn)中，將5～7×105來自野生型129小鼠或I型IFNR KO小鼠的高度純化的脾DC和100μg CGG短暫地保溫，然后與或者不與IFN-α/β(105U)一起皮下注入I型IFNR KO受體。接受CGG+DC+IFN-α/β的小鼠如前述那樣進(jìn)一步接受兩次注射IFN-α/β。隨后在免疫接種后第10天測(cè)定CGG特異性抗體滴定度(圖10)。
正如所料，接受CGG+I型IFNR KO DC的小鼠的IFN-α/β處理沒有增強(qiáng)抗體應(yīng)答，因?yàn)檫@些小鼠中沒有能響應(yīng)I型IFN的細(xì)胞。相反，與僅僅注射CGG+野生型DC相比，在接受CGG+野生型DC的小鼠內(nèi)注射IFN-α/β導(dǎo)致對(duì)全部四個(gè)IgG亞類的抗體滴定度的增大。因此，不但由I型IFN刺激DC確實(shí)增強(qiáng)了對(duì)一起注射的蛋白質(zhì)的抗體應(yīng)答，它還足以引起同種型轉(zhuǎn)換。
實(shí)施例11.接種了型IFN為佐劑的流感疫苗的小鼠的抗體應(yīng)答我們用15μg單獨(dú)的或者與2×105UI型IFN結(jié)合的純化過的亞單位流感疫苗經(jīng)肌內(nèi)或鼻內(nèi)注射C57BL/6(B6)小鼠。在免疫接種7天或14天后，通過酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法分析流感特異性抗體的存在。一起注射I型IFN導(dǎo)致對(duì)流感特異性抗體應(yīng)答的強(qiáng)烈劑量依賴性佐劑效果(圖11A)。圖11B示出了，在抗原注射后長(zhǎng)時(shí)間施用I型IFN兩天進(jìn)一步增大了流感特異性抗體應(yīng)答。
值得注意的是，含IFN佐劑的疫苗在所有處理的小鼠中引起相似的應(yīng)答，而單獨(dú)的疫苗即使在反復(fù)免疫接種后也只在有限數(shù)量的小鼠(約30％)中引起抗體應(yīng)答。圖11C示出了，應(yīng)用I型IFN為佐劑在疫苗之前、以后或與疫苗同時(shí)的不同時(shí)間施用時(shí)的不同效果。最佳佐劑效果是在將IFN與疫苗一起共同注射時(shí)觀察到的。圖12a示出了，用含I型IFN佐劑的疫苗進(jìn)行的鼻內(nèi)接種使流感疫苗高度免疫原性。有趣的是，流感特異性抗體同種型的分析顯示了通常與Th-1型免疫應(yīng)答相關(guān)的IgG2a抗體亞類的誘導(dǎo)。值得注意的是，含IFN佐劑的疫苗比單獨(dú)的疫苗導(dǎo)致更強(qiáng)的抗病毒攻擊的保護(hù)作用(圖12B)。
實(shí)施例12.I型IFN是流感疫苗的異常有效的粘膜佐劑在第一組試驗(yàn)中，通過給予2次相隔14天的鼻內(nèi)施用單獨(dú)的或與I型IFN混合的流感疫苗而對(duì)C57BL/6小鼠免疫接種；每次接種兩周后測(cè)定了抗體水平(圖14a)。在第一次接種后在IFN處理過的動(dòng)物中可檢測(cè)到抗體產(chǎn)生(特別是IgG2a)的普遍增多。第二次接種后兩周，與僅僅注射疫苗的動(dòng)物相比，IFN處理過的小鼠中抗體滴定度進(jìn)一步增大了。特別是在此時(shí)間點(diǎn)，與僅僅注射疫苗的小鼠相比，在用與IFN混合的疫苗接種的動(dòng)物中觀察到IgG2a和IgA滴定度的劇增(分別增大1000倍和100倍)。用IFN為佐劑接種的小鼠還比對(duì)比動(dòng)物顯示更高水平的分泌性肺IgA。有趣的是，由攻擊后的存活率數(shù)值和小鼠重量沒有減輕揭示了，經(jīng)鼻內(nèi)施用含IFN佐劑的疫苗的所有小鼠都受到防止流感病毒感染的保護(hù)，而在僅僅用疫苗接種的動(dòng)物中只發(fā)現(xiàn)部分的保護(hù)作用(圖14b)。在一個(gè)對(duì)IFN-IR KO小鼠和對(duì)比C3H/HeN小鼠進(jìn)行的類似免疫接種試驗(yàn)中，證實(shí)了I型IFN在兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)在對(duì)比動(dòng)物內(nèi)誘導(dǎo)IgG2a和IgA這個(gè)方面優(yōu)于MF59，而MF59在兩次免疫接種后誘導(dǎo)IgG1抗體方面更有效(圖14c，底部)。不出所料，在用IFN為佐劑經(jīng)鼻內(nèi)接種的IFN-IR KO動(dòng)物中觀察到對(duì)所有Ig亞類都沒有顯著的抗體應(yīng)答。反之，MF59仍然能在IFN-IR KO小鼠中誘導(dǎo)IgG1抗體，但是，與在對(duì)比動(dòng)物中檢測(cè)的響應(yīng)相比，IgG2a和IgA的誘導(dǎo)基本上被消除了(圖14c)。
實(shí)施例13.病毒攻擊后的小鼠存活率和IgG滴定度的增大沒有緊密的關(guān)聯(lián)如前述那樣用FLU疫苗對(duì)C57BL/6小鼠進(jìn)行一次肌內(nèi)(系統(tǒng)性的)或鼻內(nèi)(粘膜的)免疫而進(jìn)行接種，而且在14天后測(cè)定了IgG滴定度。
從圖15可見，證實(shí)了一次施用含佐劑的疫苗足以引起對(duì)受攻擊的動(dòng)物的完全保護(hù)。
此外，病毒攻擊后小鼠的存活率與IgGs的增大沒有緊密聯(lián)系。實(shí)際上，用不含佐劑的疫苗獲得的IgG滴定度的顯著增大沒有引起存活率的任何顯著增大約10％小鼠在病毒攻擊后存活了。
另一方面，I型IFN佐劑與疫苗結(jié)合的效果，雖然比起單一的疫苗效應(yīng)來導(dǎo)致IgG滴定度的適當(dāng)增大，但是即使在一次免疫接種處理后也導(dǎo)致病毒攻擊后的小鼠存活率驚人的增大(約100％)。
權(quán)利要求
1.I型IFN在制備用來增強(qiáng)在體內(nèi)保護(hù)性免疫接種處理中對(duì)疫苗的Th-1型體液免疫應(yīng)答的無毒佐劑組合物中的應(yīng)用，其中，其中應(yīng)用的IFN劑量大于或等于100.000IU/疫苗劑量。
2.權(quán)利要求1的應(yīng)用，其中，增強(qiáng)的體液免疫應(yīng)答引起選擇性誘導(dǎo)IgG1和/或IgG2a和/或IgG2b和/或IgG3和/或IgA和/或IgM產(chǎn)生。
3.權(quán)利要求1或2的應(yīng)用，其中，所述保護(hù)性免疫接種處理是通過皮下、肌內(nèi)或皮內(nèi)注射或者經(jīng)口或粘膜施用而進(jìn)行的。
4.權(quán)利要求3的應(yīng)用，其中，粘膜施用是鼻內(nèi)或經(jīng)口施用并且導(dǎo)致局部的和/或系統(tǒng)性的保護(hù)性免疫。
5.權(quán)利要求1～4任一項(xiàng)的應(yīng)用，其中，配制所述組合物和疫苗供同時(shí)送遞所述佐劑和疫苗到施用部位。
6.權(quán)利要求1～5任一項(xiàng)的應(yīng)用，其中，所述體內(nèi)保護(hù)作用是在一次免疫接種后實(shí)現(xiàn)的。
7.權(quán)利要求1～5任一項(xiàng)的應(yīng)用，其中，所述體內(nèi)保護(hù)作用是這樣實(shí)現(xiàn)的首先同時(shí)施用疫苗和佐劑組合物，然后在疫苗注射后第1天或者第1天和第2天單獨(dú)施用一個(gè)附加劑量的佐劑組合物。
8.權(quán)利要求1～7任一項(xiàng)的應(yīng)用，其中，所述I型IFN是天然IFN-α、合成的重組I型IFN、重組IFN-α亞類、IFN-β、IFN-ω、或者編碼I型IFN的一員或多員的核酸序列。
9.權(quán)利要求8的應(yīng)用，其中，所述I型IFN是聚乙二醇處理過的I型IFN亞類。
10.權(quán)利要求1～9任一項(xiàng)的應(yīng)用，其中，所述I型IFN劑量在1×106～6×106IU范圍內(nèi)。
11.權(quán)利要求1～10任一項(xiàng)的應(yīng)用，其中，所述I型IFN是與能靶向樹突細(xì)胞的單克隆抗體融合的重組I型IFN。
12.權(quán)利要求1～11任一項(xiàng)的應(yīng)用，其中，所述疫苗包含一種或多種來自一種感染劑或來自其它來源的抗原。
13.權(quán)利要求12的應(yīng)用，其中，所述疫苗包含一種或多種來自腫瘤的抗原。
14.權(quán)利要求11或13的應(yīng)用，其中，所述抗原的量是1～1000μg。
15.權(quán)利要求14的應(yīng)用，其中，所述抗原的量是10～200μg。
16.一種疫苗，它包含作為佐劑、劑量大于或等于100.000IU/疫苗劑量的I型IFN，用于可控、長(zhǎng)期釋放抗原和佐劑。
17.供皮下、肌內(nèi)或皮內(nèi)注射或者經(jīng)口或粘膜施用的權(quán)利要求16的疫苗。
18.權(quán)利要求17的疫苗，其中，粘膜施用是鼻內(nèi)或經(jīng)口施用。
19.權(quán)利要求16～18任一項(xiàng)的疫苗，其中，所述I型IFN是天然IFN-α、合成的重組I型IFN、重組IFN-α亞類、IFN-β、IFN-ω、或者編碼I型IFN的一員或多員的核酸序列。
20.權(quán)利要求16～19任一項(xiàng)的疫苗，其中，所述I型IFN是聚乙二醇處理過的I型IFN亞類。
21.權(quán)利要求16～20任一項(xiàng)的疫苗，其中，所述I型IFN劑量在1×106～6×106IU范圍內(nèi)。
22.權(quán)利要求16～21任一項(xiàng)的疫苗，其中，所述I型IFN是與能靶向樹突細(xì)胞的單克隆抗體融合的重組I型IFN。
23.權(quán)利要求16～22任一項(xiàng)的疫苗，其中，所述疫苗包含一種或多種來自一種感染劑或來自其它來源的抗原。
24.權(quán)利要求16～23任一項(xiàng)的疫苗，其中，所述疫苗包含一種或多種來自腫瘤的抗原。
25.權(quán)利要求16～24任一項(xiàng)的疫苗，其中，所述抗原的量是1～1000μg。
26.權(quán)利要求25的疫苗，其中，所述量是10～200μg。
27.權(quán)利要求16或26任一項(xiàng)的疫苗，其中，所述I型IFN劑量在1×106～6×106IU范圍內(nèi)。
28.權(quán)利要求16～27任一項(xiàng)的疫苗，它進(jìn)一步包含鋁鹽。
29.分部分的試劑盒，它包含含有劑量大于或等于100.000IU的I型IFN的無毒佐劑組合物；以及一種疫苗，它包含至少一種抗原和藥物上可接受的載體，介質(zhì)或助劑；在預(yù)防或治療與所述抗原的存在相關(guān)的疾病中用于分別，同時(shí)或依次使用。
30.制備權(quán)利要求16～28任一項(xiàng)的疫苗的方法，它包括這一步驟，即，將一種抗原和劑量大于或等于100.000IU/疫苗劑量的I型IFN一起配制于可控、長(zhǎng)期釋放組合物中。
全文摘要
本發(fā)明涉及I型IFN在制備用來增強(qiáng)在體內(nèi)保護(hù)性免疫接種處理中對(duì)疫苗的TH－1型體液免疫應(yīng)答的無毒佐劑組合物中的應(yīng)用，其中，每個(gè)疫苗劑量應(yīng)用的IFN劑量大于或等于100.000U/ml。本發(fā)明進(jìn)一步涉及一種分部分的試劑盒，它包括包含I型IFN的無毒佐劑組合物和含有至少一種抗原的疫苗，供預(yù)防或治療與所述抗原的存在相關(guān)的疾病時(shí)分別、同時(shí)或依次使用。
文檔編號(hào)A61K39/00GK1522154SQ02810045
公開日2004年8月18日 申請(qǐng)日期2002年4月16日 優(yōu)先權(quán)日2001年4月17日
發(fā)明者F·貝拉德里, G·施雅凡尼, G·德阿格斯蒂諾, E·普羅埃蒂, D·F·塔夫, A·勒邦, ⒏袼溝倥, F 貝拉德里, 塔夫, 歐材, 薨５ 申請(qǐng)人:高等健康研究院, 愛德華·詹納疫苗研究協(xié)會(huì)