專利名稱：含有表沒食子兒茶素沒食子酸酯與索拉非尼的抗腫瘤藥物組合物及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)藥及基因工程領(lǐng)域，涉及表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)與索拉非尼(SORA)組合及其在制備抗腫瘤藥劑中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
索拉非尼(sorafenib)是拜耳和ONYX公司共同研制的一種多靶點的生物靶向新藥，臨床前研究和臨床試驗提示索拉非尼有廣泛的抗腫瘤作用。美國FDA已于2005年12月 20日批準(zhǔn)了索拉非尼用于治療晚期腎細胞癌，這是近十多年來世界上被批準(zhǔn)的治療晚期腎癌的第一個新藥，是晚期腎癌治療的重大進展。2006年11月30日索拉非尼也在中國上市。 索拉菲尼的CAS編號為284461-73-0，分子式為C21H16C1F3N4O3，分子量為464. 83，化學(xué)名為4- {4- [3- (4-氯-3-三氟甲基-苯基)-酰脲]-苯氧基}-吡啶-2-羧酸甲胺-4-甲苯磺酸鹽。索拉非尼是首個雙芳基尿素類口服多激酶抑制劑，即酪氨酸激酶抑制劑、血管生成抑制劑和血管內(nèi)皮生長因子抑制劑。它具有雙重抗腫瘤作用，一方面通過抑制Raf/MEK/ ERK信號傳導(dǎo)通路直接抑制腫瘤生長，另一方面通過抑制幾種與新生血管生成和腫瘤發(fā)展有關(guān)的酪氨酸激酶受體的活性，包括血管內(nèi)皮生長因子受體-2 (VEGFR-2)，VEGFR-3，血小板衍生的生長因子受體-β (PDGFR-β )和c-KIT原癌基因，阻斷腫瘤新生血管生成，間接抑制腫瘤細胞的生長，從而起到抗腫瘤作用。索拉非尼是本類化合物中第1個進入臨床試驗的藥物，可在抑制Raf活性的劑量下，顯著抑制腫瘤細胞增殖。索拉非尼對晚期肝癌也具有極佳的治療效果。索拉非尼用于治療晚期肝癌的三期臨床試驗已經(jīng)完成，目前已在美國FDA和歐盟藥監(jiān)局進入了快速審批程序。同時，索拉非尼也可用于轉(zhuǎn)移性黑色素瘤、非小細胞肺癌等癌癥的治療。索拉非尼最常見的不良反應(yīng)包括手足綜合征、疲乏、腹瀉、皮疹、高血壓、脫發(fā)、皮膚瘙癢和惡心或食欲下降。惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程是由多因素誘導(dǎo)和多基因參與的。索拉非尼具有獨特的多靶點的抗腫瘤作用，是基于對腫瘤發(fā)生的分子生物學(xué)機理認識的基礎(chǔ)上研制成功的新藥。索拉非尼的臨床試驗結(jié)果顯示，索拉非尼與化療藥物不同，其作用主要為抑制腫瘤細胞的生長和血管的形成，而非細胞毒效應(yīng)，因此毒副反應(yīng)較輕，耐受性較好。多靶點抑制劑在治療方面優(yōu)于單靶點抑制劑，索拉非尼具有潛在廣譜的抗腫瘤作用。如何進一步提高索拉非尼的療效(如與其他藥物聯(lián)用)無疑也是目前臨床試驗急待研究解決的問題。雷帕霉素是一種mTOR通路抑制劑，有一定的抗腫瘤的作用。已有的臨床前研究表明，在肝癌治療中將雷帕霉素與索拉非尼聯(lián)合使用能夠極大的提高索拉非尼的療效，但是這兩種化合物聯(lián)合使用時的毒副作用較強。所以如何在增強索拉非尼抗腫瘤活性的同時，保持較低的毒副作用也是需要考慮的問題。茶葉(tehcamellia sinensis)是深受人們喜愛的飲品之一。全世界每年生產(chǎn)大約250萬噸，其中20%為綠茶、78%為紅茶、洲為烏龍茶。茶葉的種類雖然很多，但以綠茶為人矚目。大量的體外研究及動物實驗證明綠茶提取物有多種生物活性和藥理效應(yīng)，如防癌抗癌、抗血管生成、抗突變、抗氧化、抗衰老、抗菌、抗炎、降血脂、抗血小板聚集等等，其中與癌癥的關(guān)系是研究最為廣泛、也是最復(fù)雜的有意義的重要課題。綠茶中的主要成分為茶多酚，占茶葉干重的30%左右，茶多酚中大部分為兒茶素， 表沒食子兒茶素沒食子酸酯〔(-)_印igallocatechin gallate, (EGCG)〕含量最高，占兒茶素的80%左右。EGCG分子式為C22H18O11,分子量為458. 4。它是一種高效廣譜無毒副作用的生物抗氧化劑，俗稱沒食子兒茶素沒食子酸酯。沒食子酸酯能有效清除引發(fā)多種疾病和衰老的體內(nèi)自由基和過氧化物，提高人體免疫力，延緩衰老，具有優(yōu)異的抗病毒、降血脂、保鮮、美容等效能，在醫(yī)藥、保健、食品、日化等行業(yè)有廣泛的用途。但是綠茶提取物畢竟不是細胞毒類藥物，在體外對腫瘤細胞的直接殺傷作用不是很強。綠茶提取物及其主要成分不會也不能取代現(xiàn)有的抗腫瘤藥物，其獨特價值在于作為腫瘤化療中的生化調(diào)節(jié)劑，可增強現(xiàn)有抗腫瘤藥物的抗腫瘤活性，降低抗腫瘤藥物的毒性。到目前為止，還沒有EGCG與索拉非尼聯(lián)合使用的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種新的抗腫瘤藥物。本發(fā)明提供了一種抑制腫瘤細胞增殖的組合物，該組合物含有表沒食子兒茶素沒食子酸酯和索拉非尼，兩者的摩爾比為200 1-4 :1。較好的，表沒食子兒茶素沒食子酸酯和索拉非尼的摩爾比為160:1 8:1。更好的，摩爾比為120:1 8:1，或者80:1 13:1,40 1，60 :1，100 :1，32 :1，20 :1，26 :1，39 :1，52 :1 等。索拉菲尼的CAS編號為觀4461-73-0，分子式為C21H16C1F3N4O3,分子量為 464. 83,化學(xué)名為4- {4-[3- (4-氯-3-三氟甲基-苯基)-酰脲]-苯氧基}-吡啶-2-羧酸甲胺-4-甲苯磺酸鹽。源自德國拜耳公司。表沒食子兒茶素沒食子酸酯〔(-)_印igallocatechin gallate, (EGCG)〕的分子式為C22H18O11,分子量為458. 4。EGCG購自Sigma公司，貨號5(^99，英文全稱()-cis-2 -(3,4, 5-Trihydroxyphenyl)-3, 4-dihydro-l(2H)-benzopyran-3, 5, 7-triol 3-gallate, ( )-cis-3, 3 ' , 4 ' , 5, 5 ' , 7-Hexahydroxy-flavane-3-gallate, EGCG ;CAS 號 989-51-5。MDL 號MFCD00075940。本發(fā)明中，EGCG與臨床常用的抗肝癌藥物sorafenib在腫瘤細胞株中均具有一定的協(xié)同效應(yīng)。本發(fā)明中，將EGCG與索拉非尼的組合物用于腫瘤細胞(例如，肝癌細胞株 SK-H印1)，結(jié)果顯示，與僅使用索拉非尼相比，抑制腫瘤細胞增殖的效果明顯增強。EGCG和索拉非尼聯(lián)用，明顯降低了索拉非尼的使用量，其降低效果隨著EGCG用量的增加而更加明
Mo本發(fā)明中，將EGCG和索拉非尼的組合物用于裸鼠移植瘤模型，結(jié)果顯示，與僅使用索拉非尼相比，本發(fā)明的EGCG與索拉非尼組合物對裸鼠移植瘤生長的抑制效果顯著增強，并且效果優(yōu)于雷帕霉素與索拉非尼組合物。同時，檢測以體重變化為指標(biāo)的給藥后藥物的毒性效應(yīng)顯示，EGCG和索拉非尼聯(lián)合使用時對裸鼠體重沒有明顯影響，而雷帕霉素和索拉非尼聯(lián)合使用則引起的裸鼠體重的降低。并且EGCG和索拉非尼聯(lián)合使用時對裸鼠的肝臟和腎臟基本沒有毒性，而雷帕霉素和索拉非尼聯(lián)合使用則對裸鼠的肝臟和腎臟有較高毒性。EGCG和索拉非尼聯(lián)用，與單獨使用EGCG或者索拉非尼相比，在抑制腫瘤細胞生長方面具有明顯的增效作用，而且增效作用具有EGCG和索拉非尼濃度梯度效應(yīng)。本發(fā)明的實施例列舉T EGCG和索拉非尼含量比為20 1，100 1，200 1等。實驗表明，在兩者含量為 200:1-13:1的范圍都是有效果的。本發(fā)明中還提供了一種殺傷腫瘤細胞的方法，即在腫瘤細胞中加入EGCG和索拉非尼組合物，EGCG和索拉非尼的摩爾比為200 1-13:1。本發(fā)明中，所述的腫瘤細胞可以是HepG2、SK-hep-1、YYl、L02、或者PLC細胞。本發(fā)明的組合物，當(dāng)在治療上進行施用(給藥)時，可提供不同的效果。通常，可將這些物質(zhì)配制于無毒的、惰性的和藥學(xué)上可接受的水性載體介質(zhì)中，其中PH通常約為7-8， 盡管PH值可隨被配制物質(zhì)的性質(zhì)以及待治療的病癥而有所變化。配制好的藥物組合物可以通過常規(guī)途徑進行給藥，其中包括(但并不限于)肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、或局部給藥。以本發(fā)明的EGCG與索拉非尼的組合物為例，可以將其與合適的藥學(xué)上可接受的載體聯(lián)用。這類藥物組合物含有治療有效量的蛋白質(zhì)和藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。這類載體包括(但并不限于)鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。藥物制劑應(yīng)與給藥方式相匹配。本發(fā)明的EGCG和索拉非尼可以被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規(guī)方法進行制備。諸如片劑和膠囊之類的藥物組合物， 可通過常規(guī)方法進行制備。藥物組合物如針劑、溶液、片劑和膠囊宜在無菌條件下制造。此外，本發(fā)明的EGCG與索拉非尼的組合物還可與其他治療劑一起使用。本發(fā)明中，EGCG與索拉非尼的組合物可以是針劑或者片劑。當(dāng)本發(fā)明的EGCG與索拉非尼的組合物被用作藥物時，可將治療有效劑量的該藥物施用于哺乳動物，其中該治療有效劑量通常至少約60毫克索拉非尼+50毫克EGCG/千克體重。當(dāng)然，具體劑量還應(yīng)考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫(yī)師技能范圍之內(nèi)的。本發(fā)明提供了一種新的組合物，該組合物含EGCG和索拉非尼。該組合物可用于制備抗腫瘤藥物。EGCG和索拉非尼聯(lián)用，用于制備抗腫瘤藥物，可以大大增強索拉非尼的抗腫瘤效果，同時相對減少了索拉非尼的用量及藥物成本。由于EGCG是天然的茶葉提取物，而茶葉又是全世界三分之二的人口經(jīng)常飲用的飲料。不僅資源豐富，價格低廉，經(jīng)過了千年以上的飲用，幾乎沒有毒副作用。EGCG作為索拉非尼的輔助藥物使用，為一種新的高效價廉抗腫瘤藥物的配伍方案，提高了腫瘤的抑制率，降低了腫瘤患者的治療成本。


圖1是SK-Ifepl細胞中EGCG與CBP、MITOC、SORA、DAU有協(xié)同作用。其中，橫坐標(biāo) fa是藥物作用效應(yīng)。圖2是H印;3B細胞和SMMC7721細胞中EGCG與SORA有協(xié)同作用。其中，橫坐標(biāo)fa 是藥物作用效應(yīng)。圖 3 是 EGCG 增效 SORA。
圖4是EGCG降低SORA用量。圖5是EGCG與SORA聯(lián)合使用對裸鼠體重?zé)o影響。圖6是EGCG與SORA聯(lián)合使用使腫瘤體積減小。圖7是EGCG與SORA聯(lián)合使用使瘤體重量減少。圖8是圖7相應(yīng)的柱狀圖。
具體實施例方式實施例1 EGCG在十種肝癌細胞系中與十種抗肝癌藥物有協(xié)同效應(yīng)
我們在十種肝癌細胞系中固定EGCG的濃度，分別與四種抗肝癌藥物聯(lián)合用藥。使用金氏公式Q值來評價聯(lián)用效果。Q=Ea+b/ a+Eb-EaXm3)，Ea+b為合并用藥抑制率，Ea和 Eb分別為A藥和B藥的抑制率。分子代表實際測量的兩藥合并抑制率，分母是期待合并抑制率。Q=O. 85-1. 15范圍表示單純相加，Q=L 15-2范圍表示有增強，Q>2表示明顯增強， Q<0. 55-0. 85表示有拮抗效應(yīng)，Q<0. 55表示明顯拮抗。由表1可知，EGCG與四種抗肝癌藥物在特定的細胞株中均有一定的協(xié)同效果，說明EGCG在特定的細胞株中可以增強現(xiàn)有抗肝癌藥物的抗腫瘤活性。下述細胞均來源于ATCC，均為人肝癌細胞。Carboplatin> Mitomycin C、sorafenib、Daunorubicin 分別是卡鉬、絲裂霉素 C、 索拉非尼柔紅霉素。這四種藥物的抗癌機理和作用性質(zhì)有所不同=Carboplatin是DNA合成抑制劑，Daunorubicin是DNA、RNA合成抑制劑，Mitomycin C是葉酸拮抗劑，sorafenib 是多激酶抑制劑。表1 EGCG與抗肝癌藥物的聯(lián)合用藥效果
權(quán)利要求
1.一種抑制腫瘤細胞增殖的組合物，其特征在于，該組合物含有表沒食子兒茶素沒食子酸酯和索拉非尼，兩者的摩爾比為200 :1 4 :1。
2.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，表沒食子兒茶素沒食子酸酯和索拉非尼的摩爾比為160:1 8:1。
3.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，表沒食子兒茶素沒食子酸酯和索拉非尼的摩爾比為120:1 8:1。
4.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，表沒食子兒茶素沒食子酸酯和索拉非尼的摩爾比為80:1 13:1。
5.權(quán)利要求1所述的組合物在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
6.如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征是，所述的腫瘤是肝癌。
7.一種抑制腫瘤細胞增長的方法，其特征在于，在腫瘤細胞培養(yǎng)液中加入權(quán)利要求1 所述組合物。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述的腫瘤細胞是H印G2、SK-hep-UYYU L02、或者PLC細胞。
全文摘要
本發(fā)明屬于醫(yī)藥和基因工程領(lǐng)域，提供了一種抑制腫瘤細胞增殖的組合物。該組合物含有表沒食子兒茶素沒食子酸酯和索拉非尼，兩者的摩爾比為200:1～4:1。本發(fā)明組合物中EGCG和索拉非尼聯(lián)用，一方面抑制腫瘤細胞增殖的效果比單獨使用效果的疊加更明顯；另一方面，兩者聯(lián)用對裸鼠肝臟和腎臟則基本沒有毒性，增強了索拉非尼的抗腫瘤效果。本發(fā)明組合物中的EGCG來自于天然的茶葉提取物，不僅資源豐富，價格低廉，且經(jīng)過常年飲用證實，幾乎沒有毒副作用，因此所述的EGCG和索拉非尼聯(lián)用，增強了抗腫瘤效果，減少了藥物毒性及藥物成本。
文檔編號A61K31/353GK102526046SQ20101058725
公開日2012年7月4日 申請日期2010年12月14日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月14日
發(fā)明者余龍, 劉祖龍, 唐麗莎, 張明君, 朱恒銳 申請人:復(fù)旦大學(xué)