專利名稱：上皮細(xì)胞間粘接增強(qiáng)劑和使用該增強(qiáng)劑的過敏的改善、治療或預(yù)防劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種上皮細(xì)胞間粘接增強(qiáng)劑和使用該增強(qiáng)劑的過敏的改善、治療或預(yù)防劑。特別是涉及一種可以增強(qiáng)作為對(duì)過敏原的屏蔽功能之一的上皮細(xì)胞的細(xì)胞間粘接(上皮細(xì)胞間粘接)，改善、治療并預(yù)防過敏的上皮細(xì)胞間粘接增強(qiáng)劑以及使用該增強(qiáng)劑的過敏的改善、治療或預(yù)防劑。
背景技術(shù)：
過敏是由于免疫系統(tǒng)對(duì)異物產(chǎn)生異常反應(yīng)而引起的。人體與外界異物進(jìn)行接觸的器官主要有表皮、呼吸器官以及消化器官。其中，尤其以消化器官，因?yàn)槠渚哂歇?dú)特的免疫體系并為影響全身免疫系統(tǒng)的免疫器官，近年來倍受關(guān)注。
合而產(chǎn)生的炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)有作用的合成類固醇內(nèi)服藥，但是合成類固醇內(nèi)服藥具報(bào)道有誘發(fā)感染癥、導(dǎo)致動(dòng)脈硬化病變、副腎機(jī)能不全、消化道紊亂和女性月經(jīng)異常等副作用。確認(rèn)有重度的副作用的情況下，應(yīng)該考慮采用其他的治療方法或者使用復(fù)合治療。近年來，不僅是合成類固醇內(nèi)服藥，還有很多有關(guān)通過結(jié)合改善腸道的負(fù)責(zé)免疫的細(xì)胞的平衡以及免疫細(xì)胞活性化的方法而可以得到一定的治療效果的報(bào)道。以往，作為過敏預(yù)防方法，主流方法是基于得過敏癥的兒童腸內(nèi)的雙歧桿菌比健康」L童少的事實(shí)，改善腸內(nèi)細(xì)菌叢構(gòu)成平衡的方法。以調(diào)整腸內(nèi)細(xì)菌叢構(gòu)成平衡來改善或預(yù)防過敏的想法為基礎(chǔ)的方法，在日本特開平8-157379 (專利文獻(xiàn)I)中記載了使用含有低聚果糖的過敏預(yù)防劑的方法。在日本特開2003-201239 (專利文獻(xiàn)2)中，記載有含有低聚果糖的免疫活化食品。另外，日本專利第4162147號(hào)(專利文獻(xiàn)3)、日本特開2008-280354 (專利文獻(xiàn)4)中記載了抑制過敏的方法。專利文獻(xiàn)I中記載了，針對(duì)缺鎂而誘發(fā)的過敏，攝取含有鎂源、低聚果糖以及難消化性糖醇的組合物的方法。該方法通過使腸內(nèi)細(xì)菌利用低聚果糖生產(chǎn)有機(jī)酸，利用該有機(jī)酸和難消化性糖醇的作用促進(jìn)鎂的吸收，從而預(yù)防過敏的誘發(fā)，該方法能夠治療由缺鎂誘發(fā)的過敏，但是該方法無法治療由其他原因引起的過敏，限制了治療對(duì)象。專利文獻(xiàn)2中記載了，通過攝取低聚果糖誘導(dǎo)派爾集合淋巴小結(jié)(Peyer patch)產(chǎn)生IgA，活化腸道免疫的方法。但是該方法的有效量很大，難以每天攝取。專利文獻(xiàn)3記載了，低聚果糖中的I-蔗果三糖為最大組成比例的第I組合物的過敏抑制劑；專利文獻(xiàn)4中記載了，含有低聚果糖中的I-蔗果三糖為最大組成比例的第I組合物的過敏抑制低聚糖。將這些過敏抑制劑和過敏抑制低聚糖與專利文獻(xiàn)I 2記載的過敏癥狀的效果相比，過敏抑制效果比較高。然而，Clinical effects ofkestose，aprebiotic oligosaccharide, on the treatment of atopic dermatitis ininfants (非專利文獻(xiàn)I)中也記載了，通過乳幼兒攝取1_鹿果三糖的試驗(yàn)結(jié)果顯示，過敏癥狀的改善與雙歧桿菌的增殖沒有很強(qiáng)的相關(guān)性。
近年來，發(fā)現(xiàn)成為過敏原的物質(zhì)中普遍具有的半胱氨酸/絲氨酸蛋白酶活性可以分解上皮細(xì)胞間的緊密連接蛋白，進(jìn)而降低上皮細(xì)胞間的粘接(非專利文獻(xiàn)2和3)。所以，嘗試了基于以下構(gòu)思的方法通過修復(fù)上皮細(xì)胞間的緊密連接蛋白并促進(jìn)其形成，以增強(qiáng)上皮細(xì)胞間粘接、抑制過敏原侵入體內(nèi)的方法，來改善、治療或預(yù)防過敏。至今，很多研究借助使用了腸道上皮細(xì)胞的模型，探索可增強(qiáng)上皮細(xì)胞間粘接的物質(zhì)。舉例來說，如來自魚類的精子或酵母的核酸(專利文獻(xiàn)5)、來自纖維素酶制劑的肽(專利文獻(xiàn)6)、單唾液酸神經(jīng)節(jié)苷酯3 (專利文獻(xiàn)7)、來自乳酸菌的脂膜酸(專利文獻(xiàn)8)、乳清蛋白質(zhì)(專利文獻(xiàn)9)等。以上這些物質(zhì)都已證實(shí)是通過促進(jìn)上皮細(xì)胞間緊密連接蛋白的形成從而起到抑制過敏效果的。然而，專利文獻(xiàn)5 8中記載的物質(zhì)的生產(chǎn)工序繁瑣，并且難以進(jìn)行工業(yè)化大量生產(chǎn)。并且，專利文獻(xiàn)9記載的物質(zhì)，雖然容易生產(chǎn)，但不得不攝取大量以達(dá)到治療效果，難以每日進(jìn)行攝取。由于以上理由，通過上述物質(zhì)改善、治療或預(yù)防過敏的制劑還未能實(shí)現(xiàn)。
現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)I :日本特開平8-157379號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)2 :日本特開2003-201239號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)3 :日本專利第4162147號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)4 日本特開2008-280354號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)5 :日本專利第4050799號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)6 :日本特開2002-275196號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)7 日本專利第4034364號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)8 :日本特開2008-212006號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)9 日本專利第4330088號(hào)公報(bào)非專利文獻(xiàn)非專利文獻(xiàn)I :Shibata R, et. a I. , Clin. Exp. Allergy, 2009Sep, 39(9),P1397-1403非專利文獻(xiàn)2 ffan H. et. al.，J. Clin. Invest. 1999，104，P123-133非專利文獻(xiàn)3 :Runswick S, et. al. , J. Allergy Clin. Tmmnol. , 2003, 111,P704-713發(fā)明的概要發(fā)明需要解決的課題本發(fā)明是基于通過增強(qiáng)上皮細(xì)胞間粘接，抑制過敏原侵入體內(nèi)的方法，來改善、治療或預(yù)防過敏的構(gòu)思的發(fā)明。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，2價(jià)金屬陽離子和特定低聚糖的組合物與2價(jià)金屬陽離子相比，可以進(jìn)一步增強(qiáng)上皮細(xì)胞間的粘接，從而完成了以下發(fā)明。即，本發(fā)明的目的是提供含有特定低聚糖與2價(jià)金屬陽離子的組合物，盡管通常低聚糖作為食品、2價(jià)金屬陽離子作為在生物體內(nèi)存在且在生理濃度范圍內(nèi)對(duì)生物體沒有毒的物質(zhì)而為人們所熟悉，但本發(fā)明的組合物與合成類固醇內(nèi)服藥相比，可以非常安全及有效的改善、治療或預(yù)防過敏，或?qū)植康难装Y反應(yīng)起效果。解決課題的手段
(I)上皮細(xì)胞中的細(xì)胞間粘接增強(qiáng)劑，其以I-蔗果三糖和/或蔗果四糖以及2價(jià)金屬陽離子為有效成分。(2)根據(jù)(I)所述的增強(qiáng)劑，其以I-蔗果三糖和2價(jià)金屬陽離子為有效成分。(3)根據(jù)(2)所述的增強(qiáng)劑，其中，I-蔗果三糖是純度為95重量％以上的含有I-蔗果三糖的低聚糖，相對(duì)于所述含有I-蔗果三糖的低聚糖10重量份，2價(jià)金屬陽離子為I重量份以上。(4)根據(jù)(I)至(3)中任一項(xiàng)所述的增強(qiáng)劑，其中，2價(jià)金屬陽離子為鈣離子。(5)根據(jù)(I)至(4)中任一項(xiàng)所述的增強(qiáng)劑，其中，上皮細(xì)胞為腸道上皮細(xì)胞。(6)過敏的改善、治療或預(yù)防劑，其使用了(I)至(5)中任一項(xiàng)所述的增強(qiáng)劑。發(fā)明的效果 通過使用本發(fā)明中的上皮細(xì)胞間粘接增強(qiáng)劑和使用了該增強(qiáng)劑的過敏的改善、治療或預(yù)防劑，可以抑制導(dǎo)致過敏原侵入體內(nèi)的原因，即上皮細(xì)胞間緊密連接蛋白的破壞，此夕卜，還可以通過修復(fù)上皮細(xì)胞間緊密連接蛋白或促進(jìn)其形成，從而增強(qiáng)上皮細(xì)胞間的粘接，有效地改善、治療和預(yù)防過敏癥狀。


圖I表示實(shí)施例I中，通過添加I-鹿果三糖或鹿果四糖,TEER經(jīng)時(shí)變化的測量結(jié)
果O圖2表示實(shí)施例2中，通過添加I-蔗果三糖，TEER經(jīng)時(shí)變化的測量結(jié)果。圖3表示實(shí)施例3中，通過添加I-蔗果三糖，TEER經(jīng)時(shí)變化的測量結(jié)果。圖4表示實(shí)施例4中，通過添加I-蔗果三糖，TEER經(jīng)時(shí)變化的測量結(jié)果。圖5表示實(shí)施例4中，通過添加I-蔗果三糖，TEER經(jīng)時(shí)變化的測量結(jié)果。圖6表示實(shí)施例5中，通過添加I-蔗果三糖或蔗糖或蔗果四糖導(dǎo)致物質(zhì)滲透量發(fā)生變化的測量結(jié)果。圖7表示實(shí)施例6中，通過添加I-蔗果三糖，TEER經(jīng)時(shí)變化的測量結(jié)果。
具體實(shí)施例方式以下是有關(guān)本發(fā)明中的上皮細(xì)胞間粘接增強(qiáng)劑和使用該增強(qiáng)劑的過敏的改善、治療或預(yù)防劑的詳細(xì)說明。本發(fā)明中的上皮細(xì)胞間粘接增強(qiáng)劑是位于上皮細(xì)胞中的細(xì)胞間粘接增強(qiáng)劑，其有效成分為I-蔗果三糖和/或蔗果四糖、以及2價(jià)金屬陽離子、或者為I-蔗果三糖以及2價(jià)金屬陽離子。通過上述內(nèi)容可知，成為過敏原的物質(zhì)普遍具有的半胱氨酸/絲氨酸蛋白酶活性可以分解上皮細(xì)胞間的緊密連接蛋白，從而降低上皮細(xì)胞間的粘接(非專利文獻(xiàn)2和3)。本發(fā)明中的上皮細(xì)胞間粘接增強(qiáng)劑可以修復(fù)上皮細(xì)胞間緊密連接蛋白或促進(jìn)其形成，其結(jié)果為增強(qiáng)上皮細(xì)胞間的粘接能，可以抑制過敏原侵入體內(nèi)，本發(fā)明中的上皮細(xì)胞間粘接增強(qiáng)劑和使用該增強(qiáng)劑的過敏的改善、治療或預(yù)防劑可以改善、治療和預(yù)防過敏。本發(fā)明中，作為上皮細(xì)胞，可以例舉出例如，吸收性上皮細(xì)胞、角質(zhì)化上皮細(xì)胞、濕分層屏障上皮細(xì)胞(wet-stratified barrier epithelium)、被覆上皮細(xì)胞(lining印ithelium)、外分泌上皮細(xì)胞、內(nèi)分泌上皮細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)分泌上皮細(xì)胞、收縮性上皮細(xì)胞等。具體來說，例如小腸上皮細(xì)胞、大腸上皮細(xì)胞、十二指腸上皮細(xì)胞等腸道上皮細(xì)胞、胃粘膜上皮細(xì)胞、食道上皮細(xì)胞、角膜上皮細(xì)胞、結(jié)膜上皮細(xì)胞、羊膜上皮細(xì)胞、皮膚上皮細(xì)胞、腭上皮細(xì)胞等。作為2價(jià)金屬陽離子，只要是在生物體內(nèi)存在的、在生理濃度范圍內(nèi)對(duì)生物體沒有毒性的2價(jià)金屬陽離子即可，可以例舉出例如，鈣離子、鎂離子、鋇離子、鐵離子、銅離子、鋅離子等2價(jià)離子。本實(shí)施例中使用鈣離子作為適合的2價(jià)金屬陽離子。以往的研究顯示，通過進(jìn)行鈣離子的細(xì)胞外脫離和添加的所謂鈣開關(guān)作用，細(xì)胞間粘接具有可塑性(Sarah L. D. et. al. , B. B. A.，2008，1778，P2318-2324; Geogina C. et.al.，J. Membrane Biol.(《膜生物學(xué)雜志》)，2010，237，P115-123)。近年來的研究顯示除鈣離子以外的2價(jià)金屬陽離子，如鎂離子、鋅離子等2價(jià)金屬陽離子在其生理濃度范圍內(nèi)對(duì)細(xì)胞間粘接的形成起正面影響(Sarah L. D. et. al.，B. B. A.，2008，1778，P2318-2324;GeoginaC. et. al. , J. Membrane Biol.(《膜生物學(xué)雜志》)，2010，237，P115-123)，這啟示了，作為它們的共同的細(xì)胞機(jī)制，存在發(fā)揮與鈣離子相同作用的2價(jià)金屬離子的細(xì)胞機(jī)制。所以，本發(fā) 明中說明的I-蔗果三糖和/或蔗果四糖與鈣離子、或I-蔗果三糖與鈣離子可促進(jìn)細(xì)胞間粘接的形成，與I-蔗果三糖和/或蔗果四糖與2價(jià)金屬陽離子、或I-蔗果三糖與2價(jià)金屬陽離子可促進(jìn)細(xì)胞間粘接的形成是同義的。本發(fā)明中可以使用的低聚糖可以為，例如，除蔗糖外的低聚果糖，如I-蔗果三糖、鹿果四糖、果糖基鹿果四糖(fructosyl-nystose)等。在本實(shí)施例中使用I-鹿果三糖、鹿果四糖作為適合的低聚糖。I-蔗果三糖是由I分子葡萄糖殘基和2分子果糖殘基構(gòu)成的果糖三糖類。可在本發(fā)明中利用的I-蔗果三糖的優(yōu)選形態(tài)為，例如，以蔗糖為原料進(jìn)行酶反應(yīng)調(diào)制后，使用色層分離法除去單糖、蔗糖而提高純度，再通過結(jié)晶法制作得到的I-蔗果三糖純度為95重量％以上的含有I-蔗果三糖的低聚糖。這樣的含有I-蔗果三糖的低聚糖是具有易溶解、難消化性質(zhì)的低能量物質(zhì)。此外，具有IgA生成增強(qiáng)作用、IgE生成抑制作用(專利文獻(xiàn)3和4)。上述以蔗糖為原料進(jìn)行酶反應(yīng)的調(diào)制方法記載于日本特開昭58-201980號(hào)公報(bào)、使用色層分離法除去單糖、蔗糖提高純度的方法記載于日本特愿平11-34787 (日本特開2000-232878號(hào)公報(bào))、結(jié)晶法記載于日本特愿平2-224312(日本特開平4-235192號(hào)公報(bào))，可以分別使用這些記載的方法。日本特愿平11-34787、日本特愿平2-224312、日本特愿2005-371005 (引用文獻(xiàn)3)和日本特愿2008-166463 (引用文獻(xiàn)4)的內(nèi)容包含在本說明書中。本發(fā)明中的I-蔗果三糖的每日攝取量優(yōu)選為O. 015g/kg體重以上，乳幼兒的情況下，以每10重量份的I-蔗果三糖對(duì)I重量份的2價(jià)金屬離子進(jìn)行換算，I-蔗果三糖的每日攝取量優(yōu)選為約2. 5g。此外，本發(fā)明中的上皮細(xì)胞間粘接可以通過修復(fù)上皮細(xì)胞間緊密連接蛋白、或促進(jìn)上皮細(xì)胞間緊密連接蛋白的形成來實(shí)現(xiàn)。本發(fā)明中所謂的“增強(qiáng)”可以置換為“活化”、“促進(jìn)”、“強(qiáng)化”、“增進(jìn)”等使用。作為過敏，可以例舉出例如，特異反應(yīng)性、過敏性鼻炎、過敏性結(jié)膜炎、過敏性腸胃炎、支氣管哮喘、小兒哮喘、蕁麻疹、動(dòng)物過敏、食物過敏、金屬過敏、藥物過敏、過敏癥等。本發(fā)明中優(yōu)選以特異反應(yīng)性、過敏性鼻炎、過敏性結(jié)膜炎、食物過敏為對(duì)象。本發(fā)明中涉及的上皮細(xì)胞間粘接增強(qiáng)劑和使用該增強(qiáng)劑的過敏的改善、治療或預(yù)防劑的制劑方法，可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法。并且給藥形式也可以根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員的要求適當(dāng)選擇使用，這樣的給藥形式可以例舉出例如，調(diào)制口服制劑時(shí)的片劑、顆粒劑、散劑、膠囊劑、包衣劑(coating agent)、液體劑、混懸劑等形式，調(diào)制非口服制劑時(shí)的吸入劑、注射劑、點(diǎn)滴劑、栓劑、涂敷劑、噴霧劑、貼劑等形式；優(yōu)選對(duì)皮膚發(fā)癢部位或皮膚發(fā)疹部位進(jìn)行涂敷，或?qū)Ρ腔蜓鄣恼衬みM(jìn)行給藥。此外，給藥量可以根據(jù)醫(yī)藥組合物的制劑形式、給藥方法、使用目的以及所適用的給藥對(duì)象的年齡、體重、癥狀進(jìn)行適當(dāng)設(shè)定。以下，對(duì)本發(fā)明中涉及的上皮細(xì)胞間粘接增強(qiáng)劑和使用該增強(qiáng)劑的過敏的改善、治療或預(yù)防劑，以實(shí)施例為基礎(chǔ)進(jìn)行說明。本發(fā)明的技術(shù)范圍不局限于這些實(shí)施例中所示的特征。實(shí)施例
“實(shí)施例I :確認(rèn)I-蔗果三糖對(duì)細(xì)胞外缺鈣而導(dǎo)致的上皮細(xì)胞間粘接降低具有促進(jìn)恢復(fù)的效果的試驗(yàn)”實(shí)施例I中，通過使用了培養(yǎng)細(xì)胞的試驗(yàn)，對(duì)I-蔗果三糖對(duì)細(xì)胞外缺鈣而導(dǎo)致的上皮細(xì)胞間粘接降低具有促進(jìn)恢復(fù)的效果進(jìn)行了確認(rèn)。本實(shí)施例I中使用的含有I-蔗果三糖的低聚糖的組成為，I-蔗果三糖為98重量％、蔗果四糖為I重量％、蔗糖為I重量％的低聚糖，即I-蔗果三糖的純度為98重量％的低聚糖。并且，使用上皮細(xì)胞間電阻(TEER)作為培養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞間粘接強(qiáng)度的指標(biāo)。該測定方法利用的原理為，當(dāng)上皮細(xì)胞間粘接越強(qiáng)，培養(yǎng)細(xì)胞的上層培養(yǎng)基與下層培養(yǎng)基的電阻值越大的性質(zhì)，該方法還用于以上皮細(xì)胞為模型的試驗(yàn)等。結(jié)腸上皮癌細(xì)胞Caco-2細(xì)胞在含有10%FBS的DMEM培養(yǎng)基(GIBCO)上進(jìn)行連續(xù)傳代培養(yǎng)，冷凍保存第48代培養(yǎng)細(xì)胞，以備在接下來的試驗(yàn)中使用。將Caco-2細(xì)胞接種于Transwell雙層細(xì)胞培養(yǎng)板(Corning Life Science)的上層，在含有10%FBS的DMEM培養(yǎng)基的存在下，置于5%C02、37°C的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)直至Transwell雙層細(xì)胞培養(yǎng)板的上層和下層間的電阻(TEER)達(dá)到400 500Ω · cm2。將含有10%FBS的DMEM培養(yǎng)基更換為缺鈣的DMEM培養(yǎng)基，對(duì)培養(yǎng)至TranswelI雙層細(xì)胞培養(yǎng)板的TEER達(dá)到400 500 Ω · cm2后的Caco-2細(xì)胞培養(yǎng)2小時(shí)。之后，向含鈣的DMEM培養(yǎng)基的上層以I重量％的濃度添加含I-蔗果三糖的低聚糖、或蔗果四糖，每隔30分鐘進(jìn)行TEER經(jīng)時(shí)測定，TEER的測定進(jìn)行至培養(yǎng)22小時(shí)后(1%蔗果三糖組、1%蔗果四糖組、n=3)。作為對(duì)照組，制作只在缺鈣的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)的組(陰性對(duì)照組，n=3)和只在缺鈣的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)2小時(shí)后更換為含有鈣的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)的組(陽性對(duì)照組，n=3)，進(jìn)行TEER經(jīng)時(shí)變化的比較。以下，圖I表示實(shí)施例I中TEER比的測定結(jié)果。陰性對(duì)照組中幾乎沒有見到TEER的恢復(fù)，但是1%蔗果三糖組、1%蔗果四糖組及陽性對(duì)照組中，與陰性對(duì)照組相比，均見到了明顯的TEER恢復(fù)。同時(shí)，與陽性對(duì)照組相比，1%蔗果三糖組和1%蔗果四糖組也見到了明顯的促進(jìn)TEER恢復(fù)的效果。具體來說，由缺鈣的DMEM培養(yǎng)基更換為含鈣的DMEM培養(yǎng)基30分鐘后的1%蔗果三糖組中，與陽性對(duì)照組相比，見到了平均2.4倍的恢復(fù)促進(jìn)效果。此外，與1%蔗果四糖組相比，1%蔗果三糖組顯示有更強(qiáng)的恢復(fù)促進(jìn)的傾向。由此確認(rèn)了，I-蔗果三糖對(duì)降低的上皮細(xì)胞間粘接具有強(qiáng)烈的恢復(fù)促進(jìn)作用?！皩?shí)施例2 :確認(rèn)I-蔗果三糖對(duì)細(xì)胞外缺鈣而導(dǎo)致的上皮細(xì)胞間粘接降低具有促進(jìn)恢復(fù)的效果是依賴于鈣的試驗(yàn)”實(shí)施例2中，通過使用培養(yǎng)細(xì)胞的試驗(yàn)，確認(rèn)I-蔗果三糖的促進(jìn)從由細(xì)胞外缺鈣而導(dǎo)致的上皮細(xì)胞間粘接降低中恢復(fù)的效果依賴于鈣。使用的含有I-蔗果三糖的低聚糖的純度與實(shí)施例I相同，在與實(shí)施例I相同的培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)條件下進(jìn)行。將含有10%FBS的DMEM培養(yǎng)基更換為缺鈣的DMEM培養(yǎng)基，對(duì)培養(yǎng)至TranswelI雙層細(xì)胞培養(yǎng)板的TEER達(dá)到400 500 Ω · cm2后的Caco-2細(xì)胞培養(yǎng)2小時(shí)。之后，向含有鈣的DMEM培養(yǎng)基中在上層以I重量％的濃度添加含I-蔗果三糖的低聚糖，每隔30分鐘進(jìn)行TEER經(jīng)時(shí)測定，培養(yǎng)并進(jìn)行TEER的測定，直至3小時(shí)后(韓( + )1%蔗果三糖組、n=3)。此夕卜，制作如下的組直接在缺鈣的培養(yǎng)基上層以I重量％的濃度添加含I-蔗果三糖的低聚 糖，培養(yǎng)并進(jìn)行TEER的測定，直至3小時(shí)后(韓(_)1%蔗果三糖組、n=3)。作為對(duì)照組，制作只在缺鈣的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)的組(陰性對(duì)照組，n=3)和只在缺鈣的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)2小時(shí)后更換為含有鈣的DMEM培養(yǎng)基的組(陽性對(duì)照組，n=3)組成，進(jìn)行TEER經(jīng)時(shí)變化的比較。以下，圖2表示實(shí)施例2中TEER比的測定結(jié)果。陰性對(duì)照組和鈣(_)1%蔗果三糖組中幾乎沒有見到TEER的恢復(fù)。但是，與實(shí)施例I相同，鈣(+ ) 1%蔗果三糖組和陽性對(duì)照組均見到了明顯的TEER恢復(fù)；鈣(+ ) 1%蔗果三糖組中，與陽性對(duì)照組相比，與實(shí)施例I相同，也見到了明顯的TEER恢復(fù)促進(jìn)效果。由此確認(rèn)了，如果在細(xì)胞外沒有鈣存在的情況下，I-蔗果三糖不會(huì)顯示TEER恢復(fù)的效果，I-蔗果三糖對(duì)降低的上皮細(xì)胞間粘接的恢復(fù)促進(jìn)效果依賴于細(xì)胞外的鈣?！皩?shí)施例3 :確認(rèn)I-蔗果三糖對(duì)細(xì)胞外缺鈣而導(dǎo)致的上皮細(xì)胞間粘接降低具有促進(jìn)恢復(fù)的效果是依賴于濃度的試驗(yàn)”實(shí)施例3中，通過使用培養(yǎng)細(xì)胞的試驗(yàn)，確認(rèn)I-蔗果三糖對(duì)細(xì)胞外缺鈣而導(dǎo)致的上皮細(xì)胞間粘接降低具有促進(jìn)恢復(fù)的效果是依賴于濃度的。使用的含有I-蔗果三糖的低聚糖的純度與實(shí)施例I相同，在與實(shí)施例I相同的培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)條件下進(jìn)行。將含有10%FBS的DMEM培養(yǎng)基更換為缺鈣的DMEM培養(yǎng)基，對(duì)培養(yǎng)至TranswelI雙層細(xì)胞培養(yǎng)板的TEER達(dá)到400 500 Ω · cm2后的Caco-2細(xì)胞培養(yǎng)2小時(shí)。之后，向含有鈣的DMEM培養(yǎng)基的上層以I重量％或O. I重量％的濃度添加含I-蔗果三糖的低聚糖，每隔30分鐘進(jìn)行TEER經(jīng)時(shí)測定，培養(yǎng)并進(jìn)行TEER的測定，直至3. 5小時(shí)后(1%蔗果三糖組、O. 1%蔗果三糖組、n=3)。作為對(duì)照組，制作只在缺鈣的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)的組(陰性對(duì)照組，n=3)和只在缺鈣的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)2小時(shí)后更換為含有鈣的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)的組(陽性對(duì)照組，n=3)組成，進(jìn)行TEER經(jīng)時(shí)變化的比較。以下，圖3表示實(shí)施例3中TEER比的測定結(jié)果。與實(shí)施例I相同，陰性對(duì)照組中幾乎沒有見到TEER的恢復(fù)。但是，1%蔗果三糖組、O. 1%蔗果三糖組及陽性對(duì)照組中，與陰性對(duì)照組相比，均見到了明顯的TEER恢復(fù)。此外，1%蔗果三糖組與O. 1%蔗果三糖組相比，顯示了更強(qiáng)的TEER恢復(fù)促進(jìn)效果的傾向。通過以上確認(rèn)了，I-蔗果三糖對(duì)降低的上皮細(xì)胞間粘接的恢復(fù)促進(jìn)效果是依賴于濃度的。
“實(shí)施例4 :調(diào)查事先投藥I-蔗果三糖，對(duì)由于細(xì)胞外缺鈣而導(dǎo)致的上皮細(xì)胞間粘接降低起抑制效果的試驗(yàn)”實(shí)施例4中，通過使用培養(yǎng)細(xì)胞的試驗(yàn)，確認(rèn)了事先投藥I-蔗果三糖是否可以抑制由于細(xì)胞外缺鈣而導(dǎo)致的上皮細(xì)胞間粘接的降低。使用的含有I-蔗果三糖的低聚糖的純度與實(shí)施例I相同，在與實(shí)施例I相同的培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)條件下進(jìn)行。對(duì)于培養(yǎng)至Transwell雙層細(xì)胞培養(yǎng)板的 TEER達(dá)到400 500 Ω .cm2后的Caco-2細(xì)胞，將含有10%FBS的DMEM培養(yǎng)基更換為含鈣的DMEM培養(yǎng)基，在上層以I重量％的濃度添加含I-蔗果三糖的低聚糖，在I小時(shí)或6小時(shí)后更換為缺鈣的培養(yǎng)基，每隔30分鐘進(jìn)行TEER經(jīng)時(shí)測定，測定3回(I小時(shí)鈣(+ ) 1%蔗果三糖組、6小時(shí)鈣(+ ) 1%蔗果三糖組、n=3)。作為對(duì)照組，制作在含鈣的DMEM培養(yǎng)基上培養(yǎng)I小時(shí)或6小時(shí)后，在缺鈣的DMEM培養(yǎng)基上培養(yǎng)的組(I小時(shí)鈣(+ )陰性對(duì)照組、6小時(shí)鈣(+ )陰性對(duì)照組、n=3 )，和只在含鈣的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)的組(陽性對(duì)照組，n=3)組成，進(jìn)行TEER經(jīng)時(shí)變化的比較。以下，圖4、圖5表示實(shí)施例4中TEER比的測定結(jié)果。圖4表示I小時(shí)鈣( + )1%蔗果三糖組、I小時(shí)鈣(+ )陰性對(duì)照組和陽性對(duì)照組的比較結(jié)果。確認(rèn)了 I小時(shí)鈣(+ ) 1%蔗果三糖組在即將更換為缺鈣DEME培養(yǎng)基之前的TEER測定中，與I小時(shí)鈣(+ )陰性對(duì)照組和陽性對(duì)照組相比，TEER顯著地增加。此外，確認(rèn)了在更換為缺鈣的DMEM培養(yǎng)基并除去了I-蔗果三糖的狀態(tài)下，與I小時(shí)鈣(+ )陰性對(duì)照組相比，I小時(shí)鈣( + )1%蔗果三糖組的TEER降低有被抑制的傾向。其次，圖5表示6小時(shí)鈣(+ ) 1%蔗果三糖組、6小時(shí)鈣(+ )陰性對(duì)照組和陽性對(duì)照組的比較結(jié)果。與圖4相同，確認(rèn)了 6小時(shí)鈣( + )1%蔗果三糖組在即將更換為缺鈣DEME培養(yǎng)基之前的TEER測定中，與6小時(shí)鈣(+ )陰性對(duì)照組和陽性對(duì)照組相比，TEER顯著地增加。同樣，確認(rèn)了在更換為缺鈣的DMEM培養(yǎng)基并除去了含有I-蔗果三糖的低聚糖狀態(tài)下，與6小時(shí)鈣(+ )陰性對(duì)照組相比，6小時(shí)鈣(+ ) 1%蔗果三糖組的TEER降低有被抑制的傾向。由以上結(jié)果得出，事先投藥I-蔗果三糖可以預(yù)防上皮細(xì)胞間粘接降低，并確認(rèn)I-蔗果三糖在其存在的情況下，可以起到上皮細(xì)胞間粘接促進(jìn)作用?！皩?shí)施例5 :確認(rèn)抵抗細(xì)胞外缺鈣引起的細(xì)胞膜透性亢進(jìn)的物質(zhì)的透過抑制效果的試驗(yàn)”實(shí)施例5中，通過包括與其他低聚果糖的比較并使用培養(yǎng)細(xì)胞的試驗(yàn)，確認(rèn)了I-蔗果三糖細(xì)胞顯示的對(duì)抵抗細(xì)胞外缺鈣引起的細(xì)胞膜透性亢進(jìn)的物質(zhì)的透過抑制效果。使用的含有I-蔗果三糖的低聚糖的純度與實(shí)施例I相同，在與實(shí)施例I相同的培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)條件下進(jìn)行。將含有10%FBS的DMEM培養(yǎng)基更換為缺鈣無色HBSS培養(yǎng)基(GIBC0)，對(duì)培養(yǎng)至Transwell雙層細(xì)胞培養(yǎng)板的TEER達(dá)到400 500 Ω ·ο 2后的Caco-2細(xì)胞培養(yǎng)2小時(shí)后，在缺鈣無色HBSS培養(yǎng)基(GIBCO)上層以I重量％的濃度添加含1_蔗果三糖的低聚糖、或蔗糖、或蔗果四糖，同時(shí)在上層以100 μ M的濃度添加作為細(xì)胞間透過物質(zhì)的熒光黃(LuciferYellow) (MP Biomedical公司)，培養(yǎng)3小時(shí)后，回收下層的HBSS培養(yǎng)基，通過熒光酶標(biāo)儀對(duì)從上層滲透至下層的熒光黃(Lucifer Yellow)的殘留濃度進(jìn)行測定(1%蔗果三糖組、1%蔗糖組、1%蔗果四糖組、n=3)。作為對(duì)照組，制作只在缺鈣的HBSS培養(yǎng)基培養(yǎng)的組(陰性對(duì)照組、n=3)和只在缺鈣的HBSS培養(yǎng)基中培養(yǎng)2小時(shí)后更換為含鈣的HBSS培養(yǎng)基的組(陽性對(duì)照組、n=3)組成,進(jìn)行細(xì)胞間透過物質(zhì)量的比較。以下，圖6表示實(shí)施例5中熒光黃(Lucifer Yellow)在下層殘留濃度的測定結(jié)果。與陰性對(duì)照組相比，1%蔗果三糖組、1%蔗果四糖組和陽性對(duì)照組中的殘留濃度都明顯的較低。此外，與陽性對(duì)照組相比，1%蔗果三糖組和1%蔗果四糖組顯示更少的殘留濃度，1%蔗果三糖組的殘留濃度最低。由以上結(jié)果得出，I-蔗果三糖通過促進(jìn)上皮細(xì)胞間粘接，可以抑制成為過敏原的蛋白質(zhì)等的透過性?！皩?shí)施例6 :確認(rèn)對(duì)由炎癥性細(xì)胞因子IL-I β引起的上皮細(xì)胞間粘接降低的抑制效果的試驗(yàn)”實(shí)施例6中，通過使用培養(yǎng)細(xì)胞的試驗(yàn)，確認(rèn)了 I-蔗果三糖具有抑制由炎癥性細(xì)胞因子引起的上皮細(xì)胞間粘接降低的效果。使用的含有I-蔗果三糖的低聚糖的純度與實(shí)施例I相同，在與實(shí)施例I相同的培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)條件下進(jìn)行。向DMEM培養(yǎng)基上層以I重量％的濃度添加含1_蔗果三糖的低聚糖，對(duì)培養(yǎng)至Transwell雙層細(xì)胞培養(yǎng)板的TEER達(dá)到400 500 Ω · cm2后的Caco-2細(xì)胞培養(yǎng)24小時(shí)后，以10ng/mL的濃度向下層添加炎癥性細(xì)胞因子IL-I β ,48小時(shí)后進(jìn)行TEER測定，計(jì)算出與最初TEER的測定值的比(1%蔗果三糖( + )、IL-1 β ( + )組、n=3)。作為對(duì)照組，制作只添加IL-I β的組(1%鹿果二糖(-)、IL_1 β ( + )組、η=3),以及未添加含I-鹿果二糖的低聚糖和IL-I β的組(1%蔗果三糖(_)、IL-10 (_)組、n=3)，進(jìn)行TEER比的比較。以下，圖7表示實(shí)施例6中TEER比的測定結(jié)果。與1%蔗果三糖(_)、IL-I β (-)組的TEER比的平均值O. 914、標(biāo)準(zhǔn)偏差O. 031相比較，1%蔗果三糖(_)、IL-I β ( + )組的TEER比的平均值為O. 585、標(biāo)準(zhǔn)偏差為O. 002，1%蔗果三糖( + )、IL-I β ( + )組的TEER比的平均值為O. 849、標(biāo)準(zhǔn)偏差為O. 0003。由此結(jié)果可以得出，通過添加含有I-蔗果三糖的低聚糖可以抑制大約26%由IL-I β降低的TEER。由以上結(jié)果得出，I-蔗果三糖具有可以抑制局部炎癥反應(yīng)所導(dǎo)致的上皮細(xì)胞間粘接降低的效果。用于產(chǎn)業(yè)的可能性本發(fā)明通過對(duì)作為過敏原因的上皮細(xì)胞間緊密連接蛋白進(jìn)行修復(fù)或促進(jìn)其形成，可以有助于改善、治療并預(yù)防過敏。
權(quán)利要求
1.上皮細(xì)胞的細(xì)胞間粘接增強(qiáng)劑，其以I-蔗果三糖和/或蔗果四糖、以及2價(jià)金屬陽離子為有效成分。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的增強(qiáng)劑，其以I-蔗果三糖以及2價(jià)金屬陽離子為有效成分。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的增強(qiáng)劑，其中，I-蔗果三糖是純度為95重量％以上的含有I-蔗果三糖的低聚糖，相對(duì)于所述含有I-蔗果三糖的低聚糖10重量份，2價(jià)金屬陽離子為I重量份以上。
4.根據(jù)權(quán)利要求I至3中任一項(xiàng)所述的增強(qiáng)劑，其中，2價(jià)金屬陽離子為鈣離子。
5.根據(jù)權(quán)利要求I至4中任一項(xiàng)所述的增強(qiáng)劑，其中，上皮細(xì)胞為腸道上皮細(xì)胞。
6.過敏的改善、治療或預(yù)防劑，其使用了權(quán)利要求I至5中任一項(xiàng)所述的增強(qiáng)劑。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種含特定的低聚糖和2價(jià)金屬陽離子的組合物，盡管組合物中的成分通常作為食品或作為在生物體內(nèi)存在且在生理濃度范圍內(nèi)對(duì)生物體沒有毒的離子而為人們所熟悉，但該組合物可以有效的改善、治療或預(yù)防過敏或局部炎癥反應(yīng)，并且與合成口服類固醇藥劑相比具有安全有效的特點(diǎn)。一種上皮細(xì)胞的細(xì)胞間粘接增強(qiáng)劑，以1-蔗果三糖和／或蔗果四糖以及2價(jià)金屬陽離子為有效成分。該增強(qiáng)劑可阻止導(dǎo)致過敏原侵入體內(nèi)的原因，即上皮細(xì)胞間緊密連接蛋白的破壞，還可以修復(fù)上皮細(xì)胞間緊密連接蛋白或促進(jìn)其形成，從而增強(qiáng)上皮細(xì)胞間的粘接，達(dá)到有效地改善、治療和預(yù)防過敏癥狀。
文檔編號(hào)A61P37/08GK102791274SQ201180010498
公開日2012年11月21日 申請(qǐng)日期2011年2月22日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月22日
發(fā)明者古賀泰裕, 小笠一雄, 槙島聰, 鈴木義充, 鈴木雅之, 飯塚叔子 申請(qǐng)人:日本尼奇制藥株式會(huì)社, 有限會(huì)社東海醫(yī)學(xué)檢查研究所, 物產(chǎn)食品科技股份有限公司