專利名稱：哌嗪二酮類化合物的制作方法
背景技術(shù)：
腫瘤可通過下述幾種不同的治療方法進行治療，包括外科手術(shù)、放射療法、化學(xué)療法或者上述治療方法的任意聯(lián)合應(yīng)用。其中，化學(xué)療法對于治療不能手術(shù)的或者轉(zhuǎn)移形式的癌的治療是不可或缺的方法?？紤]到按照細(xì)胞類型、形態(tài)學(xué)特征、生長速率以及其它細(xì)胞特性等方面得出的腫瘤的多樣性，美國國家癌癥學(xué)會(NCI)建立了一種“針對疾病的”(“disease-oriented”)方法用于抗腫瘤活性的篩選(Boyd，M.R.，1989)，在“腫瘤學(xué)實踐原理”(Principle of Practice of Oncology，Devita，J.T.，Hellman，S.，and Rosenberg，S.A.(Eds.)Vol.3，PPO Update，No.10)。這種體外篩選系統(tǒng)基于包含人類主要腫瘤(例如，白血病，肺癌，結(jié)腸癌，中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤，黑色素瘤，卵巢癌，腎癌，前列腺癌，或者乳腺癌等)的約60種細(xì)胞系的人腫瘤細(xì)胞系實驗板(panel)，并用作篩選化合物抗腫瘤活性的工具。
令人感興趣的是通過下述四種機制中的一種或多種發(fā)揮作用的抗腫瘤化合物(1)抑制細(xì)胞周期的G2/M轉(zhuǎn)化過程(progression)，這最終將誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡(Yeung et al.(1999)Biochem.Biophys.Res.Com.263398-404)；(2)干擾微管蛋白的聚合/解聚過程，這將抑制細(xì)胞的有絲分裂，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡(Panda et al.(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9410560-10564)；(3)抑制內(nèi)皮細(xì)胞增生和血管生成作用(Witte et al.(1998)Cancer Metastasis Rev.17155-161；Prewett et al.(1999)Cancer Res.595209-5218)；或者(4)調(diào)節(jié)Ras蛋白-依賴性信號傳導(dǎo)通路(Hernandez-Alcoceba et al.(2000)Cell Mol.Life Sci.5765-76；Buolamwini(1999)Cur.Opin.Che.Biol.3500-509)。
發(fā)明簡述本發(fā)明部分基于哌嗪二酮類化合物具有抗腫瘤活性的發(fā)現(xiàn)，該活性是通過NCI篩選系統(tǒng)確定的，其通過上述四種機制中的一種或多種而發(fā)揮作用。
本發(fā)明的一個方面涉及具有下述通式的哌嗪二酮類化合物 其中， 和 各自獨立地是一個單鍵或一個雙鍵；當(dāng) 是單鍵時，A是H或者CH(RaRb)，當(dāng) 是雙鍵時，A是C(RaRb)；Z是R3O-(Ar)-B，當(dāng) 是單鍵時，B是CH(Rc)，當(dāng) 是雙鍵時，B是C(Rc)；Ar是雜芳基；R3是H、烷基、芳基、雜芳基、C(O)Rd、C(O)ORd、C(O)NRdRe或SO2Rd；B和R3O可取代在Ar的任意合適的位置上。R1和R2各自獨立地為H、C(O)Rd、C(O)ORd、C(O)NRdRe、或者SO2Rd；每一Ra、Rb、Rc、Rd和Re可分別為H、烷基、芳基、雜芳基、環(huán)基(cyclyl)或者雜環(huán)基(heterocyclyl)；Ra和Rb可任選地連接為環(huán)基或者雜環(huán)基；同樣，R1和Ra或者R1和Rb可任選地連接為環(huán)基或者雜環(huán)基。
關(guān)于上述通式，本發(fā)明的哌嗪二酮類化合物的一個亞類具有 和 都是雙鍵的特征。在這些化合物中，Ar是在2位與B相連的吡啶基，Rc是H，R3O是與吡啶基的5位相連的芳基烷氧基，R1和R2都為H，Ra和Rb中的一個是芳基或者雜芳基，另一個是H。本發(fā)明的哌嗪二酮類化合物的另一個亞類具有 和 都是單鍵的特征。在這些化合物中，Ar是在2位與B相連的吡啶基，Rc是H，R3O是與吡啶基的5位相連的芳基烷氧基，R1和R2都為H，Ra和Rb中的一個是H、芳基或者雜芳基，另一個是H。
本文提到的烷基、芳基、雜芳基、環(huán)基和雜環(huán)基包括取代的和未取代的基團。術(shù)語”取代”是指一個或多個取代基(可以是相同的或者不同的)，每一個取代基取代一個氫原子。取代基的例子包括，但不局限于鹵素、羥基、氨基、烷氨基、芳氨基、二烷氨基、二芳氨基、氰基、硝基、巰基、羰基、脲基、氨基甲酰基、羧基、硫脲基、氰硫基、磺胺基、C1～C6烷基、C1～C6鏈烯基、C1～C6烷氧基、芳基、雜芳基、環(huán)基以及雜環(huán)基，其中的烷基、鏈烯基、烷氧基、芳基、雜芳基、環(huán)基以及雜環(huán)基可任選地被C1～C6烷基、芳基、雜芳基、鹵素、羥基、氨基、巰基、氰基或硝基取代。術(shù)語“芳基”是指至少具有一個芳環(huán)的烴環(huán)系統(tǒng)。芳基基團的例子包括，但不限于苯基、萘基和芘基。術(shù)語“雜芳基”是指具有至少一個芳環(huán)的烴環(huán)系統(tǒng)，所述芳環(huán)含有至少一個雜原子例如O、N或S。雜芳基基團的例子包括，但不限于呋喃基、芴基、吡咯基、噻吩基、噁唑基、咪唑基、噻唑基、吡啶基、嘧啶基、喹唑啉基以及吲哚基。
本發(fā)明的另一方面涉及包含藥學(xué)上可接受的載體和有效量的至少一種上述哌嗪二酮類化合物的藥物組合物。
本發(fā)明的再一方面涉及治療腫瘤(例如白血病，肺癌，結(jié)腸癌，中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤，黑色素瘤，卵巢癌，腎癌，前列腺癌，或者乳腺癌)的方法。所述方法包括給與所述需要治療的病人有效量的具有下述通式的哌嗪二酮類化合物 其中， 和 各自獨立地是一個單鍵或一個雙鍵；當(dāng) 是單鍵時，A是H或者CH(RaRb)，當(dāng) 是雙鍵時，A是C(RaRb)；當(dāng) 是單鍵時，Z是CH(RcRd)，或當(dāng) 是雙鍵時，Z是C(RcRd)；R1和R2各自獨立地為H、C(O)Re、C(O)ORe、C(O)NReRf、或者SO2Re；Ra、Rb、Rc、Rd、Re和Rf各自獨立地為H、烷基、芳基、雜芳基、環(huán)基或者雜環(huán)基，條件是Rc和Rd中的一個是芳基或者雜芳基；如果 是雙鍵， 為單鍵，Rc和Rd中的一個為H，而另一個為雜芳基；Ra和Rb可任選地連接為環(huán)基或者雜環(huán)基；同樣，R1和Ra或者R1和Rb可任選地連接為環(huán)基或者雜環(huán)基。
關(guān)于上述通式，上面描述的哌嗪二酮類化合物的一個亞類具有 和 都是雙鍵的特征。在這些化合物中，Rc和Rd中的一個為2-吡啶基，另一個為H，R1和R2都為H，Ra和Rb中的一個為芳基或者雜芳基，另一個是H。2-吡啶基可進一步被5-芳基烷氧基所取代。上面描述的哌嗪二酮類化合物的另一個亞類具有 和 都是單鍵的特征。在這些化合物中，Rc和Rd中的一個為2-吡啶基，另一個為H，R1和R2都為H，Ra和Rb中的一個是H、芳基或者雜芳基，另一個是H。
七種典型的哌嗪二酮類化合物為3-[(5-芐氧基吡啶-2-基)亞甲基]-6-苯基亞甲基哌嗪-2，5-二酮、3-[(5-芐氧基吡啶-2-基)亞甲基]-6-對-羥基苯基亞甲基哌嗪-2，5-二酮、3-[(5-芐氧基吡啶-2-基)亞甲基]-6-對-氟苯基亞甲基哌嗪-2，5-二酮、3-[(5-芐氧基吡啶-2-基)亞甲基]-6-對-氯苯基亞甲基哌嗪-2，5-二酮、3-[(5-芐氧基吡啶-2-基)亞甲基]-6-對-苯基甲氧基苯基亞甲基哌嗪-2，5-二酮、3-[(5-芐氧基吡啶-2-基)亞甲基]-6-[(噻吩-2-基)亞甲基]哌嗪-2，5-二酮、以及3，6-二[(5-芐氧基吡啶-2-基)甲基]哌嗪-2，5-二酮。它們的結(jié)構(gòu)如下所示 以及
上面所述的哌嗪二酮類化合物包括化合物本身，同時還包括它們的可應(yīng)用的鹽及前體藥物。這些鹽，例如，可通過哌嗪二酮類化合物上帶正電荷的取代基(例如，氨基)與陰離子來形成。合適的陰離子包括，但不限于氯離子，溴離子，碘離子，硫酸根，硝酸根，磷酸根，檸檬酸根，甲磺酸根，三氟乙酸根，以及乙酸根。同樣地，哌嗪二酮類化合物上帶負(fù)電荷的取代基(例如，羧基)可與陽離子形成鹽。合適的陽離子包括，但不限于鈉離子，鉀離子，鎂離子，鈣例子，以及諸如四甲基銨離子等銨陽離子。前體藥物的例子包括酯類以及其它藥學(xué)上可接受的衍生物，當(dāng)給與個體后，所述衍生物能提供上述的哌嗪二酮類化合物。
本發(fā)明還涉及包含上述用于腫瘤治療的一種或多種哌嗪二酮類化合物的組合物，以及上述組合物在制備用于上述用途的藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明的其他特性或者優(yōu)點將可從下面幾個實施例的具體描述中清楚地看出，同樣，也在所附的權(quán)利要求中得到了明顯的反應(yīng)。
本發(fā)明詳細(xì)描述上述的哌嗪二酮類化合物可通過公知技術(shù)中的方法制備，也可通過本文公開的合成路線制備。例如，可通過哌嗪-2，5-二酮化合物與雜芳基甲醛反應(yīng)生成中間體雜芳基-亞甲基-哌嗪-2，5-二酮。然后，此中間體可被還原為雜芳基-甲基-哌嗪-2，5-二酮(本發(fā)明的一個化合物)，或者與酮或另一甲醛化合物反應(yīng)，接下來進行堿化處理，可得到哌嗪二酮異構(gòu)體的混合物，這些異構(gòu)體是cis-、trans-或者E-、Z-雙鍵異構(gòu)體形式。所需的異構(gòu)產(chǎn)物可通過高效液相色譜法(HPLC)來與其他物質(zhì)進行分離。如果需要，可通過進一步修飾的方法在雜芳基的環(huán)上引入適當(dāng)?shù)墓倌芑鶊F。或者，可通過將產(chǎn)物與還原劑反應(yīng)生成所需的還原產(chǎn)物。
下面所示為十七種哌嗪二酮類化合物合成方案的流程。 化合物1-17的合成細(xì)節(jié)分別在實施例1-17里面進行描述。若要制備其它哌嗪二酮類化合物，則吡啶基(見上述流程)可以被芳基或者另一雜芳基(例如，呋喃基，吡咯基，咪唑基，嘧啶基，或者吲哚基)所取代，哌嗪二酮環(huán)上的兩個乙酰基(Ac)中的一個(亦參見上流程)可以被另一取代基(例如，羰基，脲基，氨甲?；蛘唪然?所取代。
需要注意的是哌嗪二酮類化合物至少含有兩個雙鍵，并可進一步包含一個或者多個不對稱中心。因而，他們可能表現(xiàn)為外消旋物和外消旋混合物、光學(xué)異構(gòu)對映體、單獨的非對映異構(gòu)體、非對映異構(gòu)體混合物、以及cis-或trans-、E-或者Z-雙鍵異構(gòu)體形式。所有這些異構(gòu)體形式都已考慮在其中。
本發(fā)明還涉及含有效量的至少一種本發(fā)明所述的哌嗪二酮類化合物和藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物。進一步地，本發(fā)明還包含一種給與需要進行腫瘤治療的個體有效量的一種或者多種“發(fā)明簡述”部分描述的哌嗪二酮類化合物的方法。這些哌嗪二酮類化合物可以通過上面描述的一種或多種機理發(fā)揮作用?！坝行Я俊笔侵笇κ苤委熣咂鸬街委熜Ч璧幕衔锪俊游锖腿怂脛┝康南嗷リP(guān)系(基于每平方米體表面積的毫克數(shù))在Freireichet al.，(1966)Cancer Chemother Rep 50219中有描述。機體表面積可以從病人的身高和體重進行近似計算。例如，參見Scientific Tables，GeigyPharmaceuticals，Ardley，N.Y.，1970，537。哌嗪二酮類化合物的有效量在大約0.1mg/kg到大約50mg/kg的范圍內(nèi)。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知，有效量也將根據(jù)所治療腫瘤的類型、給藥途徑、賦形劑的使用以及與其它抗腫瘤劑或放射療法等聯(lián)合應(yīng)用的可能性等而發(fā)生變化。
在本發(fā)明方法的應(yīng)用中，含有哌嗪二酮類化合物的組合物可通過口服給藥、腸胃外給藥、吸入噴霧、局部給藥、直腸給藥、經(jīng)鼻給藥、口腔給藥、陰道給藥或者通過植入蓄積給藥。本處所用術(shù)語“腸胃外給藥”包括皮下、皮內(nèi)、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、動脈內(nèi)、滑膜腔內(nèi)、胸骨內(nèi)、鞘內(nèi)、病灶內(nèi)、顱內(nèi)注射或輸注技術(shù)。
可注射用的無菌組合物，例如，可注射用的無菌水質(zhì)或油質(zhì)懸浮液可采用本領(lǐng)域公知的技術(shù)用合適的分散劑或者潤濕劑(例如，Tween 80)及懸浮劑制備而成。這種可注射的無菌制劑也可以是采用無毒的、腸胃外可接受的稀釋劑或溶劑制成的無菌注射溶液或者懸浮液，例如，采用1，3-丁二醇制成的溶液?？晒┦褂玫目山邮艿馁x形劑和溶劑包括甘露糖醇、水、林格氏液(Ringer’s solution)、以及等滲氯化鈉溶液。另外，無菌固定油類可作為溶劑或者混懸介質(zhì)而常規(guī)使用(例如，合成的甘油一酯或者甘油二酯)。脂肪酸，例如油酸及其甘油酯衍生物，在制備注射劑中很有用處，藥學(xué)上可接受的天然油類也是如此，例如橄欖油或者蓖麻油，尤其是它們的聚氧乙基化形式。這些油溶液或者懸浮液也可包含長鏈醇稀釋劑或分散劑，或者羧甲基纖維素或類似的分散劑。其它在制備藥學(xué)上可接受的固態(tài)、液態(tài)或者其它劑型中常規(guī)使用的常用表面活性劑諸如吐溫類(Tweens)、司盤類(Spans)或者其它類似的乳化劑或者生物利用度增強劑也可用于本發(fā)明制劑的目的。
用于口服給藥的組合物可以是口服可接受的任何劑型，這些劑型包括，但不限于膠囊劑、片劑、乳劑，以及水性懸浮液、分散液和溶液。對于口服用的片劑，常規(guī)使用的載體包括乳糖和玉米淀粉。潤滑劑，例如硬脂酸鎂，通常也要加入。對于膠囊形式的口服劑型來說，可用的稀釋劑包括乳糖以及干玉米淀粉。當(dāng)水性懸浮液或者乳液用于口服給藥時，活性成分可懸浮或者溶解在與乳化劑或者懸浮劑合用的油相中。如果需要，也可加入甜味劑，調(diào)味劑，或者著色劑。鼻內(nèi)氣溶膠或者吸入劑組合物可按照藥物制劑領(lǐng)域公知的技術(shù)進行制備，其可被制成鹽水溶液，其中使用苯甲醇或者其它合適的防腐劑，增加生物利用度的吸收促進劑，碳氟化合物和/或其它本領(lǐng)域公知的加溶劑或者分散劑。含哌嗪二酮類化合物的組合物也以直腸給藥的栓劑形式給藥。
藥物組合物中的載體必須是“可接受的”，即與制劑中的活性成分是可共存的(優(yōu)選能夠使活性成分穩(wěn)定)并且對受治療者是無毒的。例如加溶劑，如環(huán)糊精，其可與哌嗪二酮類化合物形成溶解度更大的特定復(fù)合物，或一種或幾種加溶劑，它們可被用于傳送(delivery)哌嗪二酮類化合物的藥物賦形劑。其它載體的例子包括膠態(tài)二氧化硅、硬脂酸鎂、纖維素、十二烷基硫酸鈉、以及D&C yellow # 10。
哌嗪二酮類化合物可通過下述的一種或者多種體外測定法初步篩選它們的治癌效果。
一種測定方法是基于NCI篩選系統(tǒng)，其包括大約60種人類主要腫瘤的細(xì)胞系。參見Monks，et al.(1991)JNCI，J.Natl.Cancer Inst.83757-766；Alley，et al.(1988)Cancer Res.48589-601；Shoemaker，et al.(1988)Prog.Clin.Biol.Res.276265-286；以及Stinson，et al.(1989)Proc.Am.Assoc.Cancer Res.30613。簡單地說，根據(jù)特定的細(xì)胞類型和預(yù)期的靶細(xì)胞密度(根據(jù)細(xì)胞生長特性，5,000-40,000細(xì)胞/孔)將細(xì)胞稀釋為細(xì)胞懸浮液，將細(xì)胞懸液(100μL)加入到96-孔微量測定培養(yǎng)板中。先將其在37℃溫育24小時，然后將其兩次稀釋到所需的試驗濃度，并在零時向微量測定培養(yǎng)板每孔中加入100μL。通常，以5級10倍稀釋來檢測受試化合物。在一個常規(guī)檢測中，受試化合物的最高濃度為10-4M。在5％ CO2和100％濕度下溫育細(xì)胞48小時。利用硫代羅丹明B(sulforhodamine B)檢測法對細(xì)胞進行測定，所述硫代羅丹明B檢測法參見Rubinstein，et al.(1990，JNCI，J.Natl.Cancer Inst.821113-1118)以及Skehan，et al.(1990，JNCI，J.Natl.Cancer Inst.821107-1112)。用讀板儀閱讀光密度，微型計算機將光密度轉(zhuǎn)化為特定的濃度參數(shù)。NCI再命名IC50值，這是導(dǎo)致50％生長抑制的濃度，GI50值，用以強調(diào)對細(xì)胞在零時的數(shù)量進行校正；因此，GI50值衡量了受試化合物抑制生長的能力。參見Boyd，et al.(1992)In Cytotoxic Anticancer DrugsModels and Concepts forDrug Discovery and Development；Vleriote，F(xiàn).A.；Corbett，T.H.；Baker，L.H.(Eds.)；Kluwer AcademicHingham，MA，pp 11-34。
在另一種測定中，測定了哌嗪二酮類化合物對PC-3細(xì)胞(一種前列腺癌的細(xì)胞系)的細(xì)胞毒性。更明確地說，細(xì)胞與受試化合物在無血清培養(yǎng)基中溫育24小時。細(xì)胞毒作用可通過Boyd的MTT(溴化-3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑鎓鹽)檢測法進行測定。MTT檢測法參見Principle ofPractice of Oncology，Devita，J.T.，Hellman，S.，and Rosenberg，S.A.(Eds.)Vol.3，PPO Update，No.10，1989)。
另一種體外測定方法可用于評價哌嗪二酮類化合物阻滯細(xì)胞周期進程的效果。更明確地說，受試的哌嗪二酮類化合物以濃度依賴性的方式加入到PC-3細(xì)胞中，用propidium iodide染色，進行流式細(xì)胞計數(shù)評估(flowcytometric assessment)。然后測定處于sub-G0/G1、G0/G1、S以及G2/M期的細(xì)胞數(shù)。另外，哌嗪二酮類化合物對Ras活性的作用也可檢測，以確定其對Ras蛋白依賴性信號傳導(dǎo)通路的調(diào)節(jié)作用。
哌嗪二酮類化合物的抗腫瘤活性可通過一種體內(nèi)動物模型進一步檢測。利用SCID小鼠作為模型，將PC-3細(xì)胞皮下注射到該小鼠體內(nèi)，使小鼠生長出前列腺腫瘤。測定治療后哌嗪二酮類化合物的抗腫瘤活性。另外，哌嗪二酮類化合物的抗腫瘤活性也可利用體內(nèi)抗血管生成試驗進行評價。例如，可用裸鼠檢測哌嗪二酮類化合物對bFGF-誘導(dǎo)的血管生成的作用。將帶有bFGF或者血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的基質(zhì)凝膠(matrigel)通過皮下注射到小鼠體內(nèi)，并同時腹腔注射哌嗪二酮類化合物。幾天溫育(incubation)后，將基質(zhì)凝膠切下，用來進行血管生成的檢測。
盡管未作進一步詳細(xì)闡述，但可以確信，上述描述已經(jīng)足夠使本發(fā)明予以實現(xiàn)。因而，下述具體的實施例僅僅用來對本發(fā)明作進一步說明，而不是用于將本發(fā)明囿于實施例所公開的內(nèi)容。本文所引用的所有出版物均全文收納于此作為參考。
實施例13-[(5-芐氧基吡啶-2-基)亞甲基]-6-苯亞甲基哌嗪-2，5-二酮(化合物1)的合成將1，4-二乙酰基-哌嗪-2，5-二酮(8.6克)加入到含有5-芐氧基吡啶-2-基-甲醛(4.0克)的5.6mL三乙胺和40mL二甲基甲酰胺的溶液中。將混合物在室溫攪拌16小時，然后冰浴冷卻，得到黃色的沉淀。收集所得沉淀，用乙酸乙酯洗滌，得到5.4g(77％)1-乙?；?3-[(5-芐氧基吡啶-2-基-亞甲基)哌嗪-2，5-二酮(化合物A)。
熔點189-191℃。
1HNMR(400MHz，DMSO)δ2.52(s，3H)，δ4.54(s，3H)，δ4.33(s，2H)，δ5.25(s，2H)，δ6.85(s，1H)，δ7.384～δ7.488(m，5H，芳香族)，δ7.499(d，J＝8.8，1H)，δ7.689(d，J＝8.8，1H)，δ8.533(s，1H)，以及δ12.147(s，1H)。
將化合物A(3.51克)加入到含有等摩爾數(shù)苯甲醛和4當(dāng)量三乙胺的二甲基甲酰胺溶液40mL中，將所得溶液在60℃回流16小時后冰浴冷卻，得到黃色沉淀。然后收集沉淀，用乙酸乙酯洗滌，得到3.3g(83％)目的產(chǎn)物3-[(5-芐氧基吡啶-2-基)亞甲基]-6-苯基亞甲基哌嗪-2，5-二酮(化合物1)的異構(gòu)體的混合物。
熔點223-225℃。
1HNMR(400MHz，DMSO)δ5.243(s，2H)，δ6.695(s，1H)，δ6.812(s，1H)，δ7.346～δ7.634(m，12H，芳香族)，δ8.528(s，1H)，δ10.245(s，1H)，以及δ12.289(s，1H)。
實施例23-[(5-芐氧基吡啶-2-基)亞甲基]-6-對-羥基苯基亞甲基哌嗪-2，5-二酮(化合物2)的合成將實施例1中得到的化合物A(3.51g)加入到含有1.5g 4-羥基苯甲醛和4當(dāng)量三乙胺的二甲基甲酰胺溶液40mL中，將所得溶液在130℃回流16小時后冰浴冷卻，得到黃色沉淀。然后收集沉淀，用乙酸乙酯洗滌，得到3.3g(83％)目的產(chǎn)物3-[(5-芐氧基吡啶-2-基)亞甲基]-6-對-羥基苯基亞甲基哌嗪-2，5-二酮(化合物2)。
熔點260-263℃。
1HNMR(400MHz，DMSO)δ5.244(s，2H)，δ6.669(s，1H)，δ6.753(s，1H)，δ6.798(s，1H，芳香族)，δ6.819(s，1H，芳香族)，δ7.347～δ7.647(m，9H，芳香族)，δ9.821(s，1H)，δ10.064(s，1H)，以及δ12.216(s，1H)。
實施例33-[(5-芐氧基吡啶-2-基)亞甲基]-6-對-甲氧基苯基亞甲基哌嗪-2，5-二酮(化合物3)的合成將實施例1中得到的化合物A(3.51g)加入到含有1.4克4-甲氧基苯甲醛和4當(dāng)量三乙胺的二甲基甲酰胺溶液40mL中，將所得溶液在130℃回流16小時后冰浴冷卻，得到黃色沉淀。然后收集沉淀，用乙酸乙酯洗滌，得到3.3g(83％)目的產(chǎn)物3-[(5-芐氧基吡啶-2-基)亞甲基]-6-對-甲氧基苯基亞甲基哌嗪-2，5-二酮(化合物3)。
熔點238-240℃。
1HNMR(400MHz，DMSO)δ5.244(s，2H)，δ6.669(s，1H)，δ6.753(s，1H)，δ6.798(s，1H，芳香族)，δ6.819(s，1H，芳香族)，δ7.347～δ7.647(m，9H，芳香族)，δ9.821(s，1H)，δ10.064(s，1H)，以及δ12.216(s，1H)。
實施例43-[(5-芐氧基吡啶-2-基)亞甲基]-6-對-氟苯基亞甲基哌嗪-2，5-二酮(化合物4)的合成將實施例1中得到的化合物A(3.51g)加入到含有1.3克4-氟苯甲醛和4當(dāng)量三乙胺的二甲基甲酰胺溶液40mL中，將所得溶液在130℃回流16小時后冰浴冷卻，得到黃色沉淀。然后收集沉淀，用乙酸乙酯洗滌，得到3.12g(75％)目的產(chǎn)物3-[(5-芐氧基吡啶-2-基)亞甲基]-6-對-氟苯基亞甲基哌嗪-2，5-二酮(化合物4)。
熔點242-244℃。
1HNMR(400MHz，DMSO)δ5.237(s，2H)，δ6.688(s，1H)，δ6.794(s，1H)，δ7.209～δ7.624(m，11H，芳香族)，δ8.520(s，1H)，δ10.348(s，1H)，以及δ12.279(s，1H)。
實施例53-[(5-芐氧基吡啶-2-基)亞甲基]-6-對-氯苯基亞甲基哌嗪-2，5-二酮(化合物5)的合成將實施例1中得到的化合物A(3.51g)加入到含有1.3克4-氯苯甲醛和4當(dāng)量三乙胺的二甲基甲酰胺溶液40mL中，將所得溶液在130℃回流16小時后冰浴冷卻，得到黃色沉淀。然后收集沉淀，用乙酸乙酯洗滌，得到3.45克(80％)目的產(chǎn)物3-[(5-芐氧基吡啶-2-基)亞甲基]-6-對-氯苯基亞甲基哌嗪-2，5-二酮(化合物5)。
熔點250-251℃。
實施例63-[(5-芐氧基吡啶-2-基)亞甲基]-6-對-芐氧基苯基亞甲基哌嗪-2，5-二酮(化合物6)的合成將實施例1中得到的化合物A(3.51g)加入到含有1.45克4-芐氧基苯甲醛和4當(dāng)量三乙胺的二甲基甲酰胺溶液40mL中，將所得溶液在130℃回流16小時后冰浴冷卻，得到黃色沉淀。然后收集沉淀，用乙酸乙酯洗滌，用二甲基甲酰胺重結(jié)晶，得到3.45g(80％)目的產(chǎn)物3-[(5-芐氧基吡啶-2-基)亞甲基]-6-對-芐氧基苯基亞甲基哌嗪-2，5-二酮(化合物6)。
熔點253-255℃。
1HNMR(400MHz，DMSO)δ5.142(s，2H)，δ5.235(s，2H)，δ6.672(s，1H)，δ6.777(s，1H)，δ7.041～δ7.639(m，16H，芳香族)，δ8.520(s，1H)，δ10.180(s，1H)，以及δ12.235(s，1H)。
實施例73-[(5-芐氧基吡啶-2-基)亞甲基]-6-[(呋喃-2-基)亞甲基]哌嗪-2，5-二酮(化合物7)的合成將實施例1中得到的化合物A(2.8g)加入到含有2mL糠醛和4當(dāng)量三乙胺的二甲基甲酰胺溶液40mL中，將所得溶液在60℃回流48小時后冰浴冷卻，得到黃色沉淀。然后收集沉淀，用乙酸乙酯洗滌，用二甲基甲酰胺重結(jié)晶，得到2.5g(80％)目的產(chǎn)物3-[(5-芐氧基吡啶-2-基)亞甲基]-6-[(呋喃-2-基)亞甲基]哌嗪-2，5-二酮(化合物7)。
熔點256-257℃。
1HNMR(400MHz，DMSO)δ5.245(s，2H)，δ6.656(d，J＝1.6，1H)，δ6.664(d，J＝1.6，1H)，δ6.685(s，1H)，δ6.720(s，1H)，δ7.349～δ7.942(m，8H，芳香族)，δ8.527(s，1H)，δ9.515(s，1H)，以及δ12.312(s，1H)。
實施例83-[(5-芐氧基吡啶-2-基)亞甲基]-6-[(噻吩-2-基)亞甲基]哌嗪-2，5-二酮(化合物8)的合成將實施例1中得到的化合物A(2.8g)加入到含有2mL噻吩-2-甲醛(thiophene-2-carbaldehyde)和4當(dāng)量三乙胺的二甲基甲酰胺溶液40mL中，將所得溶液在60℃回流2天后冰浴冷卻，得到黃色沉淀。然后收集沉淀，用乙酸乙酯洗滌，用二甲基甲酰胺重結(jié)晶，得到1.9g(59％)目的產(chǎn)物3-[(5-芐氧基吡啶-2-基)亞甲基]-6-[(噻吩-2-基)亞甲基]哌嗪-2，5-二酮(化合物8)。
熔點215-217℃。
1HNMR(400MHz，DMSO)δ5.245(s，2H)，δ6.716(s，1H)，δ6.974(s，1H)，δ7.186(s，1H)，δ7.384～δ7.746(m，9H，芳香族)，δ8.525(s，1H)，δ9.753(s，1H)，以及δ12.288(s，1H)。
實施例93-[(5-芐氧基吡啶-2-)亞甲基]-6-[(2-吡啶)亞甲基]哌嗪-2，5-二酮(化合物9)的合成將實施例1中得到的化合物A(2.8g)加入到含有2mL吡啶-2-甲醛和4當(dāng)量三乙胺的二甲基甲酰胺溶液40mL中，將所得溶液在60℃回流2天后冰浴冷卻，得到黃色沉淀。然后收集沉淀，用乙酸乙酯洗滌，用二甲基甲酰胺重結(jié)晶，得到2.7g(85％)目的產(chǎn)物3-[(5-芐氧基吡啶-2-基)亞甲基]-6-[(2-吡啶基)亞甲基]哌嗪-2，5-二酮(化合物9)。
熔點248-250℃。
1HNMR(400MHz，DMSO)δ5.246(s，2H)，δ6.709(s，1H)，δ6.788(s，1H)，δ7.349～δ7.661(m，8H，芳香族)，δ7.923(d，J＝8，1H，芳香族)，δ8.473(d，J＝3.6，1H)，δ8.533(d，J＝2.8，1H)，δ8.680(d，J＝2，1H)，δ10.667(s，1H)，以及δ12.324(s，1H)。
實施例103，6-二[(5-芐氧基吡啶-2-基)亞甲基]-哌嗪-2，5-二酮(化合物10)的合成將實施例1中得到的化合物A(0.31g)加入到含有等摩爾數(shù)5-芐氧基吡啶-2-基-甲醛和4當(dāng)量三乙胺的二甲基甲酰胺溶液40mL中，將所得溶液在130℃回流過夜后冰浴冷卻，得到黃色沉淀。然后收集沉淀，用乙酸乙酯洗滌，得到0.36g(80％)目的產(chǎn)物3，6-二[(5-芐氧基吡啶-2-基)亞甲基]-哌嗪-2，5-二酮(化合物10)。
熔點283-28℃。
1HNMR(400MHz，DMSO)δ5.145(s，4H)，δ6.780(s，2H)，δ7.240～δ7.394(m，14H，芳香族)，δ8.381(s，2H)，δ10.145(s，1H)，以及δ12.58(s，1H)。
實施例113-[(5-芐氧基吡啶-2-基)亞甲基]-6-(2-氧-3-二氫亞吲哚基)哌嗪-2，5-二酮(化合物11)的合成將實施例1中得到的化合物A(2.8g)加入到含有1.5g靛紅(isatine)和4當(dāng)量三乙胺的二甲基甲酰胺溶液40mL中，將所得溶液在130℃回流2小時后冰浴冷卻，得到黃色沉淀。然后收集沉淀，用乙酸乙酯洗滌，得到3.04g(87％)目的產(chǎn)物3-[(5-芐氧基吡啶-2-基)亞甲基]-6-(2-氧-3-二氫亞吲哚基)哌嗪-2，5-二酮(化合物11)。
熔點＞300℃。
實施例121-乙?；?3-[(5-芐氧基吡啶-2-)甲基]哌嗪-2，5-二酮(化合物12)的合成將3.51克1，4-二乙?；哙?2，5-二酮和過量鋅粉在100mL醋酸和10mL水中的混懸液攪拌，并回流5-10分鐘，然后冷卻，過濾混合物，收集得到的固體成分，用水洗滌，得到2.0g目的產(chǎn)物1-乙?；?3-[(5-芐氧基吡啶-2-基)甲基]哌嗪-2，5-二酮(化合物12)。
熔點215-216℃。
實施例133，6-二[(5-芐氧基吡啶-2-基)甲基]哌嗪-2，5-二酮(化合物13)的合成將3，6-二[(5-芐氧基吡啶-2-基)亞甲基]哌嗪-2，5-二酮(0.2g)和過量鋅粉在10mL醋酸和10mL水中的混懸液攪拌，并回流5-10分鐘，趁熱過濾，加入水以溶解乙酸鋅。將濾液濃縮并過濾。收集所得固體成分，用水洗滌，得到80mg(40％)目的產(chǎn)物3，6-二[(5-芐氧基吡啶-2-基)甲基]哌嗪-2，5-二酮(化合物13)。
熔點228-231℃。
實施例143-[(5-乙酰氧基吡啶-2-基)亞甲基]-6-(苯基亞甲基)哌嗪-2，5-二酮(化合物14)的合成將3-[(5-芐氧基吡啶-2-基)亞甲基]-6-(苯基亞甲基)哌嗪-2，5-二酮(化合物1，0.5g，1.26mmol)和NaOH(0.5g，12.5mnol)溶解于100mL甲醇中，將所得混合物在鈀/炭(0.5g)存在、于1大氣壓下進行氫化。用TLC進行監(jiān)測，當(dāng)反應(yīng)完成后，濾去催化劑，濾液真空干燥，所得殘渣中加入50mL水，將所得水溶液調(diào)至pH＝7，收集所形成的沉淀，得到0.27g 3-[(5-羥基吡啶-2-基)亞甲基]-6-(苯基亞甲基)哌嗪-2，5-二酮(化合物B)(70％產(chǎn)率)。
1HNMR(400MHz，CDCl3)δ6.758(s，1H)，δ7.087(s，1H)，δ7.290～δ7.580(m，7H，芳香族)，δ8.328(s，1H)，以及δ12.289(s，1H)。
將化合物B(0.05g，0.16mmole)在50mL乙酸酐中的溶液于150℃回流24小時，然后真空干燥、移去未反應(yīng)的乙酸酐以及生成的乙酸，得到剩余物。將所得剩余物經(jīng)過硅膠柱層析分離，展開劑為CH2Cl2∶MeOH＝9∶1，得到0.051g(90％)化合物14的異構(gòu)體混合物?；旌衔镏饕獮閆Z異構(gòu)體。
1HNMR(400MHz，CDCl3)δ2.377(s，3H)，δ6.786(s，1H)，δ7.107(s，1H)，δ7.368～δ8.496(m，7H，芳香族)，δ8.224(s，1H)，以及δ12.498(s，1H)。
實施例153-[(5-苯甲酰氧基吡啶-2-基)亞甲基]-6-(苯基亞甲基)哌嗪-2，5-二酮(化合物15)的合成將含有化合物B(0.05g，0.16mmole；從實施例14中得到)、苯甲酰氯(15mL，0.16mmole)和50mL氯仿的反應(yīng)混合液在150℃加熱2小時，然后真空除去氯仿，得到剩余物。將所得剩余物經(jīng)過硅膠柱層析分離，展開劑為CH2Cl2，得到0.007g(10％)化合物15。
1HNMR(400MHz，CDCl3)δ6.786(s，3H)，δ7.107(s，1H)，δ7.368～δ8.496(m，13H，芳香族)，以及δ8.223(s，1H)。
實施例163-[(5-(4-甲苯磺?；?吡啶-2-基)亞甲基]-6-(苯基亞甲基)哌嗪-2，5-二酮(化合物16)的合成將含有化合物B(0.05g，0.16mmole；從實施例14中得到)、甲苯磺酰氯(0.03g，0.16mmole)和50mL甲苯的反應(yīng)混合液在150℃加熱2小時，然后真空除去甲苯，得到剩余物。將所得剩余物經(jīng)過硅膠柱層析分離，展開劑為CH2C12，得到0.007g(10％)化合物16。
1HNMR(400MHz，CDCl3)δ2.503(s，3H)，δ6.751(s，1H)，δ7.102(s，1H)，δ7.343～δ8.159(m，12H，芳香族)，δ8.223(s，1H)，以及δ12.315(s，1H)。
實施例173-[(5-(4-氯苯基氨基甲酰)吡啶-2-基)亞甲基]-6-(苯基亞甲基)哌嗪-2，5-二酮(化合物17)的合成將含有化合物B(0.05g，0.16mmole；從實施例14中得到)、異氰酸-4-氯苯酯(0.024g，0.16mmole)和50mL氯仿的反應(yīng)混合液在100℃加熱24小時，然后真空除去氯仿，得到剩余物。將所得剩余物經(jīng)過硅膠柱層析分離，展開劑為CH2Cl2，得到0.01g(15％)化合物17。
實施例18抗腫瘤活性的篩選(NCI細(xì)胞系)用含有60種不同NCI人類腫瘤細(xì)胞系的實驗板(panel)來進行一系列哌嗪二酮類化合物的細(xì)胞毒活性的測定。
發(fā)現(xiàn)所有受試化合物都有活性。效力最小的化合物在其中4種細(xì)胞系上表現(xiàn)出GI50＜10-4M。效力最強的化合物在所有60種細(xì)胞系上表現(xiàn)出GI50＜10-4M，在其中的9種細(xì)胞系上表現(xiàn)出GI50＜10-8M。
實施例19抗腫瘤活性的篩選(前列腺細(xì)胞系)在PC-3細(xì)胞上檢測了一系列哌嗪二酮類化合物以及紫杉醇(taxol，一種公知的抗腫瘤制劑)的細(xì)胞毒活性。在每種化合物存在下于無血清培養(yǎng)基中將細(xì)胞溫育24小時。細(xì)胞毒作用可通過MTT法進行檢測。所有受試化合物都有活性。出人意料的是，效力最強的哌嗪二酮類化合物的EC50值大約為0.3microM，強度比紫杉醇大30倍以上。
實施例20體外檢測法(抑制細(xì)胞周期的G2/M進程)在哌嗪二酮類化合物存在下，將PC-3細(xì)胞于無血清培養(yǎng)基中溫育，然后分別在第6、12、18和24小時收集細(xì)胞，固定，用二碘化丙錠(propidiumiodide)染色?；诹魇郊?xì)胞計數(shù)評估確定細(xì)胞周期的階段。受試化合物誘導(dǎo)了細(xì)胞周期的阻滯，其表現(xiàn)為大量細(xì)胞處于G2/M期。另外，哌嗪二酮類化合物對Ras的活性有顯著的調(diào)節(jié)作用。
實施例21體外檢測法(干擾管蛋白/微管蛋白的聚合)在不同濃度哌嗪二酮類化合物存在下，于37℃溶液(0.1M MES，1mMEGTA，0.5mM MgCl2，0.1mM EDTA，2.5M甘油)中將管蛋白/微管蛋白溫育，然后，加入GTP以誘導(dǎo)管蛋白/微管蛋白的聚合作用。在多個不同的時間點測定光密度值(OD)以確定聚合作用的程度。受試化合物可在10-6～10-5M的濃度下抑制聚合作用。
實施例22體內(nèi)檢測法(抑制腫瘤的擴展)將PC-3細(xì)胞皮下注射到SCID小鼠體內(nèi)，使小鼠生長出體積大于800mm3的腫瘤。當(dāng)利用哌嗪二酮類化合物經(jīng)過14-28天的治療后，腫瘤的體積可顯著減小。
實施例23體內(nèi)檢測法(調(diào)節(jié)血管生成活性)小鼠皮下植入帶有bFGF或者血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的基址凝膠栓(matrigel plug)(0.5mL/20g小鼠)6天后，可在栓子中檢測出明顯的血管生成效應(yīng)。腹腔注射哌嗪二酮類化合物幾乎完全抑制這種血管生成效應(yīng)。
其它具體實施例本發(fā)明說明書所公開的所有特征可以任意組合。說明書中公開的每一特征都可以被具有相同、等效或者相似目的的特征所取代。因此，除非特別說明，所公開的每一特征僅是一系列等效或者相似特征中的一個例子。
本領(lǐng)域技術(shù)人員可從上述描述中很容易確定本發(fā)明的必要技術(shù)特征，在不脫離此精神的范圍的基礎(chǔ)上可對本發(fā)明進行多種變化及修改，使其適應(yīng)于不同的用途及情況。例如，也可制備與本發(fā)明的哌嗪二酮類化合物結(jié)構(gòu)類似的化合物并篩選其抗腫瘤活性，使其用于本發(fā)明的目的。因而，其他的實施方式也在本發(fā)明權(quán)利要求的保護范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.具有下述通式的化合物 其中 和 各自獨立地是一個單鍵或一個雙鍵；當(dāng) 是單鍵時，A是H或者CH(RaRb)，當(dāng) 是雙鍵時，A是C(RaRb)；Z是R3O-(Ar)-B，當(dāng) 是單鍵時，B是CH(Rc)，當(dāng) 是雙鍵時，B是C(Rc)；Ar是雜芳基；R3是H、烷基、芳基、雜芳基、C(O)Rd、C(O)ORd、C(O)NRdRe或SO2Rd；R1和R2各自獨立地H、C(O)Rd、C(O)ORd、C(O)NRdRe或SO2Rd；以及Ra、Rb、Rc、Rd和Re各自獨立地H、烷基、芳基、雜芳基、環(huán)基或者雜環(huán)基；其中，Ra和Rb可任選地連接為環(huán)基或者雜環(huán)基；同樣，R1和Ra或者R1和Rb可任選地連接為環(huán)基或者雜環(huán)基。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其中 為雙鍵。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的化合物，其中 為雙鍵。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的化合物，其中Rc為H。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的化合物，其中Ar是吡啶基。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的化合物，其中Ar是在2位與B相連的吡啶基。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的化合物，其中R3O與吡啶基的5位相連。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的化合物，其中R3O是芳基烷氧基。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的化合物，其中R1和R2都是H。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的化合物，其中Ra和Rb中的一個是芳基或雜芳基，另一個是H。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的化合物，其中R3O是芐氧基。
12.根據(jù)權(quán)利要求9所述的化合物，其中Ra和Rb連接起來是雜環(huán)基。
13.根據(jù)權(quán)利要求3所述的化合物，其中R3O是芳基烷氧基。
14.根據(jù)權(quán)利要求3所述的化合物，其中R1和R2都是H。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的化合物，其中Rc是H。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的化合物，其中Ar是吡啶基。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的化合物，其中Ar是在2位與B相連的吡啶基。
18.根據(jù)權(quán)利要求3所述的化合物，其中Ra和Rb中的一個是芳基或雜芳基，另一個是H。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的化合物，其中Ar是在2位與B相連的吡啶基，Rc是H。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的化合物，其中R3O是與吡啶基的5位相連的芳基烷氧基。
21.根據(jù)權(quán)利要求3所述的化合物，其中Ra和Rb連接起來是雜環(huán)基。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的化合物，其中Rc是H。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的化合物，其中Ar是吡啶基。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的化合物，其中Ar是在2位與B相連的吡啶基。
25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的化合物，其中R3O是與吡啶基的5位相連的芳基烷氧基。
26.根據(jù)權(quán)利要求2所述的化合物，其中 是單鍵。
27.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其中 是單鍵。
28.根據(jù)權(quán)利要求20所述的化合物，其中 是雙鍵。
29.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其中的化合物為
30.根據(jù)權(quán)利要求29所述的化合物，其中的化合物為
31.根據(jù)權(quán)利要求29所述的化合物，其中的化合物為
32.治療腫瘤的一種方法，包括給與需要治療的個體有效量的具有下述通式的化合物 其中 和 各自獨立地是一個單鍵或一個雙鍵；當(dāng) 是單鍵時，A是H或者CH(RaRb)，當(dāng) 是雙鍵時，A是C(RaRb)；當(dāng) 是單鍵時，Z是CH(RcRd)，當(dāng) 是雙鍵時，Z是C(RcRd)；R1和R2各自獨立地為H、C(O)Re、C(O)ORe、C(O)NReRf或SO2Re；以及Ra、Rb、Rc、Rd、Re和Rf各自獨立地為H、烷基、芳基、雜芳基、環(huán)基或者雜環(huán)基，條件是Rc和Rd中的一個是芳基或者雜芳基；其中，當(dāng) 是雙鍵、 是單鍵、且Rc和Rd中的一個是H時，Rc和Rd中的另一個是雜芳基；Ra和Rb可任選地連接為環(huán)基或者雜環(huán)基；同樣，R1和Ra或者R1和Rb可任選地連接為環(huán)基或者雜環(huán)基。
33.根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中 是雙鍵。
34.根據(jù)權(quán)利要求33所述的方法，其中 是雙鍵。
35.根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法，其中Rc和Rd中的一個是雜芳基。
36.根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法，其中Rc和Rd中的一個是2-吡啶基，另一個是H。
37.根據(jù)權(quán)利要求36所述的方法，其中所述的2-吡啶基在5位被芳基烷氧基取代。
38.根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法，其中R1和R2都是H。
39.根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法，其中Ra和Rb中的一個是芳基或者雜芳基，另一個是H。
40.根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法，其中Ra和Rb連接為雜環(huán)基。
41.根據(jù)權(quán)利要求33所述的方法，其中 是單鍵。
42.根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中 是單鍵。
43.根據(jù)權(quán)利要求42所述的方法，其中 是雙鍵。
44.根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中所述化合物為
45.根據(jù)權(quán)利要求44所述的方法，其中所述化合物為
46.根據(jù)權(quán)利要求44所述的方法，其中所述化合物為
全文摘要
具有通式(I)的哌嗪二酮類化合物，其中和各自獨立地是一個單鍵或一個雙鍵；當(dāng)是單鍵時，A是H或者CH(R
文檔編號A61KGK1441789SQ01812521
公開日2003年9月10日 申請日期2001年5月8日 優(yōu)先權(quán)日2000年5月9日
發(fā)明者鄧哲明, 王惠珀, 艾里克·I·C·李, 李昂, 顧記華, 陳惠婷, 范揚彬, 陳雅蘭 申請人:怡發(fā)科技股份有限公司