專利名稱：胰島素制劑的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于人用藥特別是治療糖尿病的人用藥物領域。更具體地講，本發(fā)明涉及含有人胰島素分子的制劑，該制劑在使用時能夠更接近地模擬正常人體中所發(fā)現(xiàn)的胰島素的基礎水平。
在糖尿病治療中的主要治療目標是生理控制血液葡萄糖水平。為此可利用許多不同的商品和制劑。為對付進餐時發(fā)生的葡萄糖迅速升高，速效胰島素制品例如HumulinRegular或通常所說的單體胰島素類似物最為合適。
病人的葡萄糖負荷的另一個重要來源是肝臟低水平的基礎葡萄糖輸出，該輸出主要由食后代謝過程如糖原異生和糖原分解所致。在糖尿病患者中，該基礎葡萄糖輸出可在夜間顯著增加并形成高血糖持續(xù)期，尤其是在清晨，會產(chǎn)生所稱的黎明現(xiàn)象(dawnphenomenon)。所述高血糖期已被證明是糖蛋白(glycatedproteins)水平高的重要原因，臨床常常以糖基化血紅蛋白來進行測定。這些衍生的蛋白質(zhì)產(chǎn)物的增加和與糖尿病相關的慢性并發(fā)癥如神經(jīng)病、腎病和視網(wǎng)膜病有連帶關系。
對付所述基礎葡萄糖輸出的理想的胰島素制劑應該是能導致將與肝臟低水平的葡萄糖輸出相一致的胰島素緩慢、恒定地注入血流中的制劑。按照該理想的基礎作用時間，與所述相符的最佳胃腸外用制品是市售牛超長效胰島素，每天僅注射一次，它可將胰島素緩慢、恒定地釋入血流中而不會形成明顯的胰島素峰。
但是牛超長效制劑的主要問題源于這樣一個事實，即牛胰島素在氨基酸順序方面與人胰島素不同。人體可將牛胰島素識別為異蛋白。糖尿素患者長期注射這種致免疫物質(zhì)可以導致胰島素抗體形成。這可以引起胰島素作用時間和效價的改變并產(chǎn)生由于病人的激活的免疫系統(tǒng)而帶來的其它問題。由于這些原因，牛超長效制劑仍不是理想的胃腸外用胰島素制劑。
1980年初，用于將豬胰島素轉(zhuǎn)化成人胰島素的DNA重組技術和新的酶技術的出現(xiàn)均使大量應用人胰島素成為可能。為了解決上述牛超長效制劑的問題，合乎邏輯的措施是將人超長效胰島素晶體及其加工制劑制成胃腸外用制劑商品。人和牛超長效胰島素制品的晶型、晶形、晶體大小、制備方法和制劑組成基本上相同。
但是，多年的臨床經(jīng)驗得出了肯定的結果，即這些產(chǎn)品是不相同的。事實上，臨床報告表明，人超長效制劑作用比牛超長效制劑作用快，而豬超長效制劑的作用時間介于這兩種制劑之間。在臨床實踐中，這使得許多內(nèi)科醫(yī)生和糖尿病研究學者建議對于人超長效制劑應每天注射2次。此外，在皮下注射后約12小時觀察到胰島素吸收入血流的明顯的峰。該現(xiàn)象不但削弱了該制品對抗肝臟的恒定基礎葡萄糖輸出的能力，而且也導致血胰島素增多，這本身可以產(chǎn)生血管擴張(macrovascular)并發(fā)癥。
人和牛超長效胰島素制品在作用時間方面不同的原因尚不完全清楚。牛胰島素抗體的存在不是所述作用時間不同的主要原因。一些研究表明，來自于人超長效制劑的胰島素比牛超長效制劑的在注射部位更快被吸收。在本專利說明書中進一步描述的溶解測定對這個問題做了進一步的探討。基于前述測定的改進，這些溶解試驗表明牛超長效胰島素晶體在稀釋時比類似的人超長效胰島素晶體的確要花費長得多的時間來溶解。牛和人胰島素之間氨基酸順序的差異可能產(chǎn)生包在該晶體中的胰島素六聚體的輕微差異，這導致其隨后的溶劑化速率的差異。在注射進入皮下組織后，該牛胰島素晶體溶解的延遲可能導致其延長的吸收和生物學作用時間(biologicaltimeaction)。
在人胰島素類似物的合成方法中作用時間的延長已被仔細研究過。特別是，已經(jīng)進行了諸如Gly(A21)Arg(B27)Thr-NH(B30)2人胰島素之類的改變(Jorgenesen等人，British Medical Journal 299，415-419(1989))和在Glu(B13)位的改變(Hansen，Biophysical Chemistry 39，107-110(1991))。然而，在所有這些情況中，引入新的氨基酸順序會將該外來分子引入人體中，因此可能同牛胰島素一樣致免疫，甚至致免疫可能更強。顯然，使用天然的人胰島素分子會比引入新的胰島素分子更好?？傊?，尚未見報道為將免疫學上優(yōu)選的人超長效制劑的作用時間延長至與藥物動力學上優(yōu)選的牛超長效制劑的生物學作用時間相同或較其更佳的高富鋅的人超長效制劑，亦未見報道這樣的制劑的生產(chǎn)方法。
許多年以前人們就知道胰島素可成功地與鋅原子共結晶，獲得作用時間比水溶性、無定形、非晶的胰島素長的數(shù)種類穩(wěn)定的晶體。魚蛋白質(zhì)魚精蛋白也已用作胰島素配位劑來延長胰島素的作用時間，但其不均勻性和潛在的致免疫性(immunogenicity)使其對于長期皮下注射使用的藥物不太具有吸引力。
在50年代早期，開發(fā)出一種牛胰島素晶體的新制劑，它在乙酸鹽緩沖液中只含有胰島素和鋅，pH為中性(Hallas-Mφller等人，Science116，394-398(1952))。該長效胰島素，(Lenteinsulin)避開了磷酸根離子，所述磷酸根離子與鋅離子作用強，形成不溶性的磷酸鋅衍生物。僅在乙酸鹽緩沖液中含結晶性胰島素的制劑稱作超長效制劑(Ultralente)。按該方式制備的晶體在本文中稱作超長效胰島素晶體。
盡管在各胰島素六聚體中僅需要2個鋅原子配位以形成合適的超長效晶體，但在各超長效制劑中鋅確是摩爾過量的，而且發(fā)現(xiàn)每天注射一次牛超長效制劑，作用時間是適當?shù)?Schlichtkrull,InsulinCrystals，EjnarMunksgaard出版，哥本哈根(1958))。該文獻報道了同樣的結果(第92頁)，“在該超長效制劑中用豬胰島素代替牛胰島素，作用持續(xù)時間顯然有點縮短。因此，為獲得時間恒定的治療用懸浮液，必須嚴格堅持完全相同的品種或找到不同種胰島素間的固定比例。”同樣，據(jù)報道，糖尿病患者吸收豬超長效胰島素比牛超長效胰島素快(Brange，GalenicsofInsulin，第28頁，Springer-Verlag,柏林(1987))。然而，即使注意到了這些品種差異，但豬胰島素與人胰島素的結構更接近，因而，比牛胰島素致免疫性小，為延長豬超長效制劑的作用時間以使其與牛超長效制劑的相同或更長的可能的制劑改變既未被證實，亦未被提出。事實上，早期報道(Hallas-Mφller，Diabetes5，7-12(1956))提示，鋅濃度在每100胰島素單位0.2mg以上不會有助于進一步延長任何種類的長效(或超長效)胰島素制劑的作用時間。
據(jù)報道，每100胰島素單位約0.09mg的鋅與不溶的牛超長效胰島素晶體緊密結合(每個胰島素六聚體14個鋅原子)，而在上清液中每ml約0.05mg的較低濃度的游離鋅仍未被結合。恰恰在該胰島素制劑的濃度從40U/ml增至100U/ml時，上述兩個濃度被設計以保持恒定(Brange，GalenicsofInsulin，第37頁，Springer-Verlag，柏林(1987))。
在最近的美國專利說明書(US5070186)中有報道說，含高濃度(0.02-0.5M)的另一種二價金屬陽離子鎂的胰島素制劑結果是作用較快的胰島素制品。然而，令人驚訝的是，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，將氯化鋅或乙酸鋅固體或濃水溶液直接加至人超長效制劑中使最終總的鋅濃度為每100胰島素單位約0.5-20mg，可以延遲該晶體的溶解，且可以將其生物學作用時間延長至與牛超長效制劑的一樣慢，或者甚至更慢。還發(fā)現(xiàn)，所述改變導致pH隨之由約pH7.4降至pH6.2。進一步發(fā)現(xiàn)所述改變導致所加的鋅大部分留在上清液中并未與不溶的胰島素晶體結合。貯存一定時間后，它亦未明顯改變制劑中胰島素晶體的外觀形狀或大小或化學穩(wěn)定性。
本發(fā)明涉及包含超長效胰島素晶體的懸浮液的胰島素制劑，在總制劑中，鋅濃度在每100胰島素單位約0.5-20毫克之間。在該制劑中的總鋅的50%以上留在可溶部分，而未與胰島素配合。該胰島素制劑的pH一般在約6.0-7.4之間。該鋅改變的制劑顯示出非常持久的人胰島素制品的特性。
就本發(fā)明的說明書和權利要求書而言，下列術語和縮寫定義如下。
制劑總鋅濃度-該制劑中鋅的全部濃度，不管所述鋅是與胰島素配合還是以可溶的形式存在。
超長效胰島素-含有基本上按照Hallas-Mφller等人，Science116，394-398(1952)中所述方法在乙酸鹽緩沖液中制得的胰島素晶體的制劑。按此方法制得的晶體以后稱為超長效胰島素晶體。
U-胰島素活性的標準國際單位。
Zn-鋅。
用在本公開文件中的所有的氨基酸縮寫均為美國專利商標局所接受的在37C.F.R.§1.822(b)(2)(1990)中規(guī)定的縮寫。
本發(fā)明涉及包含超長效晶體的懸浮液的胰島素制劑，制劑鋅總濃度在每100胰島素單位約0.5-20毫克之間。在該制劑中，總鋅的50%以上留在可溶部分，而未與胰島素配合。該胰島素制劑的pH一般在約6.0-7.4之間。此外，本發(fā)明的胰島素制劑不含象魚精蛋白之類的其它蛋白質(zhì)。該制劑可以含有防腐劑或等滲劑，并且還可以含有與鋅作用不強的緩沖劑。該鋅改變的制劑顯示出非常持久的人胰島素制品的特性。
本發(fā)明制劑可以通過下述方法來制備將鋅加到預先制得的超長效胰島素晶體的懸浮液中，或者在實際的超長效制劑制備操作的結晶步驟后另外加鋅。鋅可以固體形式來加，或者可以溶液形式來加。或者，可將超長效晶體的懸浮液加到固體鋅或鋅溶液中。在本發(fā)明中，可以使用若干不同的鋅鹽。有代表性的鋅鹽的例子有乙酸鋅、溴化鋅、氯化鋅、氟化鋅、碘化鋅和硫酸鋅。技術人員應該知道，還有許多其它的鋅鹽可以用于制備本發(fā)明的鋅改變的超長效胰島素制劑。優(yōu)選使用乙酸鋅或氯化鋅以形成本發(fā)明鋅改變的超長效胰島素制劑，因為這些鹽未給市售的超長效制劑增添新的化學離子。
因此，本發(fā)明涉及在顯著增加人超長效制劑的上清液中鋅的濃度時不明顯改變該超長效晶體本身。人們驚奇地發(fā)現(xiàn)，與未改變的人超長效制劑相比，該富鋅超長效制劑能延遲不溶的胰島素晶體的溶解速率并能延長生物學作用時間。
由于若干原因，防止超長效晶體被顯著改變可能是重要的。第一，超長效制劑給糖尿病患者長期施用40年了，而人超長效制劑本身使用近10年。因此，用這些新的鋅改變的制劑可以進行安全性的記錄，第二，顯著增加與胰島素晶體配位的鋅的濃度可能導致所述晶體聚集。一段時間后，這能在該制劑中成塊，使其不能使用。檢查本發(fā)明所述的鋅改變的人超長效胰島素制劑顯示胰島素晶體無明顯改變或結塊。最后，鋅-胰島素晶體的改變能夠使該胰島素的結構本身發(fā)生改變，這能夠改變其生物學性能乃至其致免疫性。
在制備這些改變的超長效制劑時發(fā)生的pH隨之下降可能也是重要的。增加可溶鋅離子的濃度據(jù)認為增加了胰島素A8(蘇氨酸)和A9(絲氨酸)殘基之間的化學裂解，即便是所述胰島素以不溶的晶體存在(Brange等人，PharmaceuticalResearch9，715-726(1992))。將胰島素制劑的pH稍微降至pH7以下能使所述裂解反應減至最低程度，因此改善了長期穩(wěn)定性。也可能是，所述pH降低可能是過量鋅與胰島素晶體最低限度相互作用的部分原因，這是因為，蛋白質(zhì)與鋅的相互作用被認為在較酸性的pH下會降低(Schlichtkrull，InsulinCrystals，EjnarMunksgaard出版，哥本哈根(1958))。
本發(fā)明所述新的鋅改變的人超長效制劑還具有幾個特性。在初始的人超長效制劑被制備以后很久產(chǎn)生了制劑方法。用該方法，根據(jù)所需的作用時間，甚至在藥房或診所就可以添加各種濃度的鋅以滿足個體病人的需要。還有，這些制劑無需新的賦形劑、配位劑、化學制品或有機溶劑，因此不用關心多年長期使用新的化學個體的未知毒性。最后，終溶液的pH范圍，pH6.0-7.4，足以接近皮下組織的pH(pH7.4)，應不產(chǎn)生刺激作用。
本發(fā)明提供適宜于經(jīng)皮下注射治療糖尿病的人超長效晶體的制劑，這樣的注射能提供胰島素的緩慢吸收，如果需要，每天只需注射一次。該制劑還可以含有防腐劑例如對羥基苯甲酸甲酯，等滲劑例如氯化鈉，鋅總含量為每100胰島素單位約0.5-20mg且pH在約6.0-7.4。本領域技術人員應知道，許多其它的防腐劑和等滲劑適宜用于本發(fā)明中。在優(yōu)選的實施方案中，鋅總濃度為每100胰島素單位約0.5-7mg，pH為約6.2-7.2。另一個優(yōu)選的實施方案是在適量的固體氯化鋅、固體乙酸鋅或這些試劑的濃水溶液被加到預配制的人超長效溶液中時，結果形成所有鋅濃度的pH，即不再進行pH調(diào)節(jié)。
為比較其它文獻和專利文件中所述的鋅和胰島素濃度，表Ⅰ列出了在配合物中等價的鋅和胰島素，而表Ⅱ列出了溶液中等價的鋅。
表Ⅰ鋅/胰島素配合物mEq%μMμMmgμg(微克)Zn/g在無水胰島素Zn/μMZn/μMZn/100Zn/胰島素晶體中的Zn胰島素胰島素六聚體胰島素單位胰島素單位0.120.380.3320.0130.130.3110.905.40.0350.350.892.752.5115.10.112.6687.7546.50.334.4312.712.8770.556668.5192.511557.57517785.3514.2308620200表II溶液中的鋅mEqZn/l%ZnmgZn/mlmMZn/l0.3060.0010.010.1530.6120.0020.020.3061.530.0050.050.7653.060.010.11.536.120.020.23.0615.30.050.57.6530.60.1115.361.20.2230.61530.5576.5306110153612220306下列實施例用來說明本發(fā)明，但不應誤解為是對本發(fā)明的限制。
實施例1鋅改變的人超長效制劑的制備使用濃度均為每ml100胰島素單位(U100)的Humulin超長效制劑(HumulinUltralente)(Lilly，Indianapolis，IN)和超長效(牛)胰島素延時胰島素鋅懸浮液USP[Ultralente(Beef)InsulinExtendedInsuinZincSuspensionUSP](NovoNordisk，Bagsvaerd，丹麥)。這些含鋅總濃度為約0.15mg/ml的制劑或者直接使用，或者用含0.05mg/ml鋅的超長效胰島素(UltralenteInsulin)(Lilly)用無菌稀釋劑稀釋成胰島素濃度為U40。將預稱重的固體氯化鋅樣品(EMScience，CherryHill，NJ)直接加至超長效胰島素的U100或U40溶液中，或者，將各種量的氯化鋅(100mg/ml水)或乙酸鋅(J.T.Baker，Phillipsburg，NJ，200mg/ml水)的濃溶液(未調(diào)節(jié)pH)加至Humulin超長效制劑的U100制劑中。鋅總濃度或者從計算的該胰島素中的鋅濃度、稀釋劑和試劑結合來估計，或者通過原子吸收光譜實驗測定。
實施例2鋅改變的人超長效制劑的pH現(xiàn)通用的超長效藥用制劑的pH為約pH7.4。鋅改變的超長效制劑按實施例1中所述制備并測定其pH值。結果見下表Ⅲ。
表Ⅲα總計最終mg胰島素濃度加鋅的方法所用的鋅試劑Zn/mlmgZn/100最終樣品(U/ml)制劑U胰島素pH140無無0.090.237.38240固體氯化物0.250.637.30340固體氯化物0.591.487.03440固體氯化物1.092.736.80540固體氯化物2.406.006.75640固體氯化物7.3118.286.347100無無0.150.157.378100固體氯化物2.602.606.849100固體氯化物7.407.406.4110100固體氯化物12.2012.206.211197水溶液氯化物1.591.646.801294水溶液氯化物2.923.116.731393水溶液氯化物3.814.106.631491水溶液氯化物4.555.006.591583水溶液氯化物8.189.866.411691水溶液乙酸鹽5.606.156.751783水溶液乙酸鹽10.0912.166.51a估計值顯然，當加入鋅試劑時，這些制劑的pH略有下降。與氯化鋅相比，用乙酸鋅制備的樣品顯示出pH下降較小。在本文所述的其它實施例中，除實施例3B外，對用該方法制備的溶液均未另外進行pH調(diào)節(jié)。
還發(fā)現(xiàn)，在加入這些鋅試劑后，將微量的氫氧化鈉溶液加到這些鋅強化的制劑中能夠?qū)H升高一點。然而通過加入大量的氫氧化鈉將該制劑調(diào)節(jié)至pH7.4會立即生成塊狀沉淀，估計可能是氫氧化鋅類的東西，這使得該制劑不能用于另外的目的。另一方面，在制備鋅強化的超長效制劑后加入酸性溶液象鹽酸或乙酸以降低pH，不會造成任何沉淀，但對該上清液的HPLC分析表明在酸化過程中，少量、額外百分數(shù)的超長效晶體已溶解了。按實施例3B，在使胰島素的溶解降至最低或者消除時，用稀乙酸酸化處理最好。因此，由于可對這些鋅強化的超長效懸浮劑進行令人滿意的小幅度的pH調(diào)節(jié)，因此本發(fā)明不應被限制在當加入特定的鋅試劑時所形成的這個唯一的pH。
實施例3在鋅改變的人超長效制劑中的鋅濃度A.按實施例2的樣品8制備3種鋅強化的人超長效制劑。據(jù)估計，這三種懸浮劑的鋅總濃度均為每100胰島素單位0.7-2.5mg。將這三個懸浮劑的各1ml和未改變的Humulin超長效胰島素制劑于25℃用手回蕩30分鐘，然后于5℃貯存20小時。然后將各懸浮液推過0.2微米Acrodisc 過濾器(Gelman Science，Ann Arbor，MI)。濾液用9ml 0.1N HCl稀釋。將留在該過濾器上的不溶的晶體用緩慢通過各過濾器的10ml 0.1N HCl再溶解。將在這些溶液中的鋅濃度用原子吸收測定并計算回到原制劑上清液或胰島素晶體中的鋅含量。由這些試驗得到的數(shù)據(jù)列在表Ⅳ中。
表Ⅳmg/mlmg/ml樣品結合的鋅游離的鋅上清液中總鋅的百分數(shù)10.120.0736.8%20.190.6376.8%30.181.3087.8%40.202.6092.9%
該試驗表明，所加鋅多余部分的大多數(shù)留在了上清液中，且既未與胰島素晶體配合，亦未與其以共價鍵結合，B.按實施例2的樣品8制備含約2.5mg/ml鋅的制劑20ml。將該懸浮液(pH6.81)的一半留下來不調(diào)pH，而將另一半通過加入少量的稀乙酸調(diào)節(jié)pH至6.15。將該懸浮液于5℃貯存。如上所述，在不同的時間測定上清液和不溶的晶體中的鋅濃度。由這些試驗得到的數(shù)據(jù)列在下表Ⅴ中。
表Ⅴmg/mlmg/ml天數(shù)(在5℃)結合的鋅游離的鋅上清液中總鋅的百分數(shù)00.272.1889.0%20.262.7591.4%40.372.1485.3%樣品70.392.5086.5%在pH6.81100.352.5087.7%150.422.2584.3%210.362.7588.4%280.353.2590.3%00.292.1488.1%20.282.1888.6%40.252.1289.4%樣品70.402.5086.2%在pH6.15100.303.0090.9%150.332.5088.3%210.352.5087.7%280.332.7589.3%
該試驗表明，用稀乙酸調(diào)節(jié)pH不改變鋅在上清液和不溶的胰島素晶體之間的分布。還表明，在貯存期間，鋅分布無明顯改變。在這兩個制劑中，大部分鋅均留在了上清液部分中。
實施例4鋅改變的人超長效制劑的穩(wěn)定性。
A.將按實施例2所述制備的各種鋅強化的人超長效制劑在43X放大倍數(shù)下進行顯微鏡檢查。所有的懸浮劑均顯示出典型的在未改變的制劑中所發(fā)現(xiàn)的菱形超長效晶體。在鋅改變的懸浮劑中的晶體的大小、形狀和完整性實際上與未改變的懸浮劑的不能區(qū)別。未檢測到在這些制劑中存在顯著量的外來的、不溶的非晶體顆粒。
該制劑還顯示出與未改變的超長效制劑相同的回蕩形式。回蕩后，該結晶性懸浮劑還顯示出在晶體達到完全沉淀的時間和晶體的近似堆積體積兩方面均與未改變的超長效制劑相同的沉降特征。
B.制備含約7.5mg/ml鋅的人超長效胰島素的鋅強化的制劑(與實施例2的樣品9類似)。用未改變的超長效制劑(實施例2的樣品7)作對照。將這兩個樣品均在5℃貯存約1年。這時，將該胰島素晶體再溶于稀鹽酸并用反相高效液相層析(HPLC)系統(tǒng)評價其純度。在40℃的條件下使用含有150埃孔徑顆粒的4.6×250mmZorbaxC-8柱。在含約pH2的0.225M硫酸銨的乙腈的梯度洗脫中，在流速為0.7ml/分鐘時洗脫出胰島素。
1年后，未改變的超長效胰島素的純度為96.4%，有幾個未鑒定峰，各在0.2%范圍內(nèi)，A21-脫酰胺胰島素峰為約1%。含7.5mg/ml鋅的超長效制劑1年后顯示出胰島素總純度為96.8%，有幾個未鑒定峰在0.1-0.2%范圍內(nèi)；A21-脫酰胺胰島素峰為約1%。一個新的在胰島素之前洗脫出的未知峰為0.3%，該峰在未改變的超長效樣品中未見到。
這些試驗表明，鋅改變的制劑在超長效晶體的大小和形狀方面保持其穩(wěn)定性。還有，在5℃貯存一年后，在該超長效制劑中高濃度的鋅不顯著改變胰島素分子的化學純度。
實施例5復合溶解測定這個測定法是Graham和Pomeroy較早發(fā)表在J.Pharmacol.36，427-430(1983)上的測定法的改進方法，這里引入該文獻方法作參考。它利用胰島素晶體在用非結合鋅的緩沖劑顯著稀釋后的溶解速率作為預測該結晶性制劑在皮下注射進入動物體內(nèi)后的溶解速率的方法。這是因為對于胰島素懸浮劑而言，產(chǎn)生生物學響應的限速步驟主要是注射后不溶的胰島素的溶解速率。因此可以預計，與人超長效制劑相比在該測定中溶解更慢的胰島素制劑在生物模型中作用同樣會更慢。
按與實施例2中樣品8相類似的方法制備3種含0.35、0.7和2.5mg/ml鋅的鋅強化的人超長效制劑。將這些懸浮液的0.5ml部分和未改變的U100人和牛超長效制劑的0.5ml部分各加至在80ml玻璃杯中于25℃攪拌著的50ml 0.1M Tris(三羥甲基氨基甲烷，Mallinckrodt，巴黎，KY)pH7.5緩沖劑中。在3小時和8小時時，將攪拌的懸浮液等分試樣移出并使其通過0.2微米Acrodisc 過濾器。濾液中胰島素的量用反相HPLC定量測定。胰島素最大含量通過未過濾的酸化的等分試樣的HPLC來測定。在溶解測定的開始基本沒有溶解的胰島素。由這些試驗得到的數(shù)據(jù)列在下表Ⅵ中。
表Ⅵmg/ml溶解胰島素的最大百分數(shù)溶解胰島素的最大百分數(shù)超長效制劑種類估計的鋅濃度(3小時)(8小時)人0.1516.3%44.7%人0.354.5%10.7%人0.702.4%6.3%人2.501.1%3.2%牛0.153.2%6.2%該試驗表明，未改變的人超長效制劑比未改變的牛超長效制劑再溶解快得多。還表明，將鋅加至人超長制劑中達到每100胰島素單位0.7mg的水平時使該胰島素晶體以與未改變的牛超長效制劑大約相同的速率溶解。給人超長效制劑加鋅至每100胰島素單位約2.5mg的水平時，可使其得到比未改變的牛超長效胰島素甚至更慢的溶解速率。
實施例6連續(xù)流動溶解測定這個測定法是較早由Brange在GalenicsofInsulin，第46頁，Springer-Verlag，柏林(1987)和Graham和Pomeroy在J.Pharm.Pharmacol.36，427-430(1983)中所報道的流通試驗的改進方法，這里引入這兩篇文獻方法作為參考。將未改變的人和牛超長效胰島素和每100胰島素單位含約0.7mg鋅的人超長效制劑樣品(如實施例5所述)的2ml等分試樣各用48ml0.1MTrispH7.5緩沖劑溶解。使各自的全部50ml懸浮液立即通過0.2微米Acrodisc 過濾器并用5ml水洗滌。然后將各過濾器放置于FPLC系統(tǒng)(Pharmacia，Piscataway，NJ)的洗脫液管線上。將新鮮的0.1M Tris pH7.5緩沖劑以每分鐘2ml的流速泵過各過濾器。在洗脫胰島素的2個多小時中，在214nm波長處連續(xù)光譜監(jiān)測通過所述過濾器的洗脫液的吸收。洗脫液的各部分還用反相HPLC檢測以確定人或牛胰島素的存在。
牛超長效晶體中的胰島素僅非常緩慢地溶于該新鮮的Tris緩沖劑中。牛胰島素的洗脫通過HPLC分析洗脫液部分來確定。在未改變的人超長效晶體中的胰島素顯示快的溶解速率，在約35分鐘時出峰，并且在整個試驗中保持比較強的溶解。含0.7mg/ml鋅的人超長效制劑顯示出與未改變的人超長效制劑樣品非常相似的響應，但與該牛制劑不同。這表明，在該測定中先期的過濾步驟從該制劑中除去了所有未結合的鋅，留下的晶體的表現(xiàn)恰同未改變的人超長效晶體一樣。該數(shù)據(jù)也顯著地表明了人和牛胰島素晶體的溶解速率的固有差異。由這些試驗得出的數(shù)據(jù)列在下表Ⅶ中。
表Ⅶ相對吸收人超長效制劑時間(分鐘)牛超長效制劑人超長效制劑0.7mg/mlZn00002.512.53.512.559.08.011.5108.023.019.0157.838.031.7207.952.045.0258.059.060.0307.463.072.0358.164.079.5408.061.079.0458.357.573.0507.852.068.0558.245.560.0608.540.052.2658.536.045.5708.831.539.5759.029.536.3809.726.025.0909.623.022.110010.420.222.111011.018.524.312011.216.624.013012.015.121.6
實施例7超長效制劑的兔檢定將按實施例2樣品1-6中所示制備的牛超長效(U40)和U40人超長效制劑在普通兔模型上試驗。用在本實施例中的兔子是新西蘭白兔(NewZealandWhites)，多為雌性，均重2.7-4kg，0.5-4歲，在給樣品前禁食16小時。將該胰島素懸浮液各以每公斤0.2單位的劑量給10只兔子在頸后皮下注射。在不同的時間從邊緣耳靜脈取100μl體積的血，將其與900μl體積的抗凝劑(氟化EDTA-鈉)混合并對葡萄糖含量進行分析。將葡萄糖值標準化，以反映在注射樣品前測定的原血液葡萄糖的百分數(shù)。由這些試驗得到的數(shù)據(jù)列在表Ⅷ中。
表Ⅷmg/ml%原血液葡萄糖注射后小時數(shù)樣品超長效制劑種類估計的鋅濃度12341人0.0960.665.289.090.42人0.2556.767.891.491.43人0.5960.458.978.185.54人1.0781.878.695.295.65人2.4092.880.980.388.66人7.3196.084.180.985.97牛0.1560.168.796.795.7在該兔模型中，作用時間曲線比在人中的短得多。該作用時間壓縮導致該模型無法顯示未改變的人和牛超長效制劑之間的明顯差別(樣品1與樣品7)。盡管有這項限制，該試驗還是顯示出在將足夠量的鋅加到人超長效胰島素制劑中時，人超長效胰島素的生物作用被顯著改變。如樣品4-6中所示，強生物響應的開始被延遲超過1小時，最低在2-4小時之間。血液葡萄糖中的最大下降也被消除，從樣品1-3中的約40%(1小時最低點)降到樣品4-6中的僅約20%(2-4小時最低點)。因此，含有足夠鋅的制劑清楚地顯示出比未改變的人或牛超長效制劑慢得多的延長了的作用時間。
權利要求
1.人胰島素制劑，它包含超長效胰島素晶體的懸浮液，在該制劑中，鋅總濃度在每100胰島素單位約0.5-20毫克之間。
2.權利要求1的胰島素制劑，其中，該制劑還包含防腐劑。
3.權利要求2的胰島素制劑，其中，該制劑還包含等滲劑。
4.權利要求3的胰島素制劑，其中，該制劑還包含緩沖劑。
5.權利要求4的胰島素制劑，其中，該制劑包括總制劑鋅濃度在每100胰島素單位約0.5-7毫克之間。
6.制備如權利要求1至5中任一權項所述的胰島素制劑的方法，它包括將鋅與超長效胰島素晶體混合。
7.權利要求6的方法，其中所用的鋅是選自下列的鋅鹽乙酸鋅、溴化鋅、氯化鋅、碘化鋅、氟化鋅和硫酸鋅。
8.如權利要求1至5中任一權項所述的藥用制劑，它用于經(jīng)皮下注射治療病人的糖尿病。
全文摘要
本發(fā)明涉及胰島素制劑，它包含超長效晶體的懸浮液且總制劑鋅濃度在每100胰島素單位約0.5—20毫克，在該制劑中的總鋅的50％以上留在可溶部分中，而不是與胰島素配合。該胰島素制劑的pH一般在pH6.0—7.4之間。此外，本發(fā)明胰島素制劑不含象魚精蛋白這類的其它蛋白質(zhì)。該鋅改變的制劑顯示出非常持久的人胰島素制品的特性。
文檔編號A61K38/28GK1109364SQ9410908
公開日1995年10月4日 申請日期1994年8月10日 優(yōu)先權日1993年8月13日
發(fā)明者J·A·霍夫曼 申請人:伊萊利利公司