專利名稱：魚病多聯(lián)抗獨(dú)特型單克隆抗體疫苗制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域近年隨著我國(guó)海水養(yǎng)殖漁業(yè)的迅猛發(fā)展，魚病特別是細(xì)菌性引起的魚病每年均造成養(yǎng)殖海魚大量死亡，已嚴(yán)重影響了海水養(yǎng)殖魚業(yè)的發(fā)展。對(duì)魚病的預(yù)防，國(guó)內(nèi)外迄今還停留在較經(jīng)典的滅活疫苗階段。國(guó)際上已有8項(xiàng)魚類弧菌滅活疫苗及其制備方法獲得日本、美國(guó)專利。我國(guó)中科院南海海洋研究所1995年也成功制備了海魚創(chuàng)傷弧菌滅活疫苗。此外未見其它海魚病菌成功制備的報(bào)道。在醫(yī)學(xué)上，疫苗的成功應(yīng)用已有200多年的歷史，隨著醫(yī)學(xué)科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，疫苗的形成也不斷更新，有減毒及滅活疫苗、亞單位疫苗、合成肽疫苗、抗獨(dú)特型抗體疫苗及新近發(fā)展起來(lái)的核酸疫苗?？躬?dú)特型抗體有和病原體的抗原決定簇相類似的結(jié)構(gòu)，它是一種模擬抗原，能誘導(dǎo)自體或異體產(chǎn)生抵抗病原體的抗體，使機(jī)體得到部分或全部的保護(hù)作用。這一點(diǎn)已被大量的試驗(yàn)所證實(shí)?？躬?dú)特型抗體疫苗還有以下獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)1．它能模擬抗原，但不含有毒抗原的成分，無(wú)毒無(wú)害，使用安全可靠；2．抗獨(dú)特型抗體不存在種系差別，使用時(shí)無(wú)須考慮種系問(wèn)題。經(jīng)國(guó)際互聯(lián)網(wǎng)終端查新檢索，迄今國(guó)內(nèi)外均未見抗獨(dú)特型抗體疫苗應(yīng)用于養(yǎng)殖魚的報(bào)道。
本發(fā)明的目的是利用生物技術(shù)，生產(chǎn)多種魚病菌抗獨(dú)特型單克隆抗體，篩選出β型抗獨(dú)特型單克隆抗體，并且模擬病菌誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗病菌的抗體，使機(jī)體得到部分或全部保護(hù)作用。以上抗獨(dú)特型單克隆抗體可制成魚病抗獨(dú)特型抗體疫苗，對(duì)養(yǎng)殖魚起到很好的免疫保護(hù)作用，不污染環(huán)境，不會(huì)通過(guò)食物鏈對(duì)人類造成損害。
本發(fā)明的技術(shù)方案鰻弧菌、創(chuàng)傷弧菌、溶藻弧菌、遲緩愛德弧菌菌株(均由青島海洋大學(xué)提供)，進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，再將培養(yǎng)后的菌液腹腔注射免疫小鼠Ba／b／c小鼠，取免疫后小鼠脾細(xì)胞和SP2／0骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合，將細(xì)胞融合的細(xì)胞懸液進(jìn)行培養(yǎng)，用酶聯(lián)免疫反應(yīng)法(ELISA法)檢測(cè)陽(yáng)性克隆，將確定為陽(yáng)性的孔以有限稀釋法，進(jìn)行克隆化，再將陽(yáng)性克隆的雜交瘤細(xì)胞株擴(kuò)增培養(yǎng)，腹腔注射接種到Ba／b／c小鼠制備出腹水型單抗，將以上腹水型單抗以ELISA法進(jìn)行效價(jià)，亞類及交叉試驗(yàn)，挑選效價(jià)較高的單克隆抗體，對(duì)海魚進(jìn)行保護(hù)試驗(yàn)，挑選對(duì)海魚有較高保護(hù)率的單抗進(jìn)行純化，以每只小鼠10～100μg的量，腹腔注射免疫小鼠。然后進(jìn)行細(xì)胞融合，篩選出能穩(wěn)定分泌抗獨(dú)特型單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，將細(xì)胞株擴(kuò)增培養(yǎng)，調(diào)整為1×106／ml，以每只小鼠0．5ml量，腹腔注射接種到Ba／b／c小鼠，制備腹水型抗獨(dú)特型單克隆抗體，采用ELISA法，對(duì)以上單抗進(jìn)行亞類、效價(jià)及β型抗獨(dú)特型單克隆抗體鑒定。結(jié)果顯示，鰻弧菌抗獨(dú)特型單抗中有4株單抗1D1、1E10、1H5、1H12，創(chuàng)傷弧菌抗獨(dú)特型單抗中有2株單抗1C9、4A5，溶藻弧菌抗獨(dú)特型單抗中有2株單抗2F4、1B2，遲緩愛德華菌抗獨(dú)特型單抗中有2株單抗1E5、1E11，均能特異性地與抗原(病菌)競(jìng)爭(zhēng)與ab1(腹水型單克隆抗體)結(jié)合。用這些單抗免疫小鼠，可從小鼠血液中檢測(cè)到抗病菌的抗體，說(shuō)明以上單抗為β型抗獨(dú)特型單克隆抗體。用以上單抗與不完全弗氏佐劑(1∶1～1∶2)混和，腹腔注射免疫海魚，對(duì)照組用生理鹽水取代單抗。免疫一個(gè)月后，用致死量病菌腹腔注射感染海魚，觀察疫苗對(duì)海魚的保護(hù)作用。結(jié)果顯示，鰻弧菌抗獨(dú)特型單抗中有三株單抗1E10、1D1、1H12對(duì)海魚的保護(hù)率分別為88．7％、82．5％和81．2％；遲緩愛德華菌抗獨(dú)特型單抗中有2株單抗1E11和1E5對(duì)海魚的保護(hù)率分別為60％和20．8％；溶藻弧菌抗獨(dú)特型單抗中有2株單抗1B2和2F4對(duì)海魚的保護(hù)率分別為90％和50％。挑選出保護(hù)率較高的抗獨(dú)特型單抗以一定比例配制成魚病多聯(lián)抗獨(dú)特型單抗疫苗制劑。
具體實(shí)施例方式(一)材料1．菌種鰻弧菌、外傷弧菌、溶藻弧菌、遲緩愛德華氏菌的標(biāo)準(zhǔn)菌株由青島海洋大學(xué)生命學(xué)院提供。以上菌種用作免疫原產(chǎn)生單克隆抗體。
溶藻弧菌、副溶血弧菌、創(chuàng)傷弧菌、河弧菌、弗尼斯弧菌、霍利斯弧菌、擬態(tài)弧菌、少女弧菌、麥?zhǔn)匣【臉?biāo)準(zhǔn)菌株購(gòu)自北京生物制品公司。腸毒性大腸桿菌、腸侵襲性大腸桿菌、腸出血性大腸桿菌、志賀氏菌屬的福氏志賀氏菌、絕氏志賀氏菌、痢疾志賀氏菌、宋氏志賀氏菌，購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品鑒定所。以上菌種用作單克隆抗體交叉試驗(yàn)。
2．細(xì)胞胞SP2／0小鼠骨髓瘤細(xì)胞株，由第四軍醫(yī)大學(xué)細(xì)胞工程研究中心惠贈(zèng)。
(二)實(shí)驗(yàn)方法1．免疫原細(xì)菌的制備及滅活鰻弧菌、溶藻弧菌、創(chuàng)傷弧菌、遲緩愛德華氏菌以平板劃線培養(yǎng)于細(xì)菌培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)箱中過(guò)夜，無(wú)菌生理鹽水洗脫菌苔，3000rpm離心20分鐘，棄上清，加入1％的甲醛固定過(guò)夜。3000rpm離心20分鐘，棄上清，加無(wú)菌生理鹽水，比濁記數(shù)后，4℃冰箱保存，以備用作免疫原菌液。
2．Ba／b／c小鼠的免疫8周齡的Ba／b／c雌性小鼠10只，將以上滅活的細(xì)菌菌液(1×108個(gè)／ml)以0．5ml／只的量，腹腔注射免疫小鼠，于第一次免疫后第7、14、28天分別追加免疫，第31天取脾細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合。
3．細(xì)胞融合(1)免疫脾細(xì)胞的制備①取免疫小鼠脾臟，放入盛有5ml不完全培養(yǎng)液的平皿中，置于200目的不銹鋼銅網(wǎng)上。用注射器內(nèi)芯研磨脾臟，并用平皿內(nèi)不完全培養(yǎng)液輕輕沖洗鋼網(wǎng)，使脾細(xì)胞全部通過(guò)網(wǎng)孔擠壓到溶液中。
②將脾細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)入50ml離心管中，加不完全培養(yǎng)液至30ml，混勻，1000rpm離心5分鐘，棄去上清。
③用不完全培養(yǎng)液將沉淀細(xì)胞再離心洗滌一次(重復(fù)步驟②)，將細(xì)胞垂懸至10ml，混勻，用細(xì)胞記數(shù)板記數(shù)。
(2)SP2／0骨髓瘤細(xì)胞懸液的制備①將4瓶擴(kuò)增培養(yǎng)的骨髓瘤細(xì)胞收集到50ml離心管內(nèi)。
②1000rpm離心5分鐘，棄去上清。
③再加入30ml不完全培養(yǎng)液，重復(fù)步驟②再離心洗滌一次，然后將細(xì)胞垂懸至10ml，混勻，記數(shù)。
(3)細(xì)胞融合①分別吸取含1×108個(gè)脾細(xì)胞和懸液和含2-3×107個(gè)骨髓瘤細(xì)胞的懸液，加入一支50ml離心管中，補(bǔ)加不完全培養(yǎng)液至30ml，充分混勻。
②1000rpm離心7分鐘，棄去上清。
③加50％的融合劑PEG 0．7ml。
④加入25ml不完全培養(yǎng)液，使PEG稀釋而失去促融作用。
⑤800rpm離心7分鐘，棄去上清。
⑥加入20ml HAT培養(yǎng)液，輕輕吹吸沉淀細(xì)胞，使其垂懸并混勻。
⑦將細(xì)胞懸液加入輔有飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔培養(yǎng)板中，每孔0．1ml，在37℃含5％CO2的孵箱中培養(yǎng)。
4．抗體檢測(cè)--間接ELISA法(1)用已知抗原滅活菌液包被。
(2)加有克隆長(zhǎng)生的孔中的培養(yǎng)上清100μl。
(3)加酶標(biāo)單抗鼠IgG抗體100μl。
(4)加底物液100μl，室溫避光顯色10～20分鐘。
(5)判定結(jié)果在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀492nm波長(zhǎng)下測(cè)定OD值，空白對(duì)照調(diào)零，若待測(cè)孔OD值大于或等于陰性對(duì)照孔2．1倍，即為陽(yáng)性克隆。
5．克隆化--有限稀釋法將96孔板中待做克隆化的雜交瘤細(xì)胞用加樣器反復(fù)吹打均勻后記數(shù)，然后采取有限稀釋法進(jìn)行逐級(jí)稀釋，加到96孔板進(jìn)行培養(yǎng)。觀察克隆生長(zhǎng)，記錄單克隆孔，并及時(shí)進(jìn)行陽(yáng)性檢測(cè)。將陽(yáng)性單克隆的細(xì)胞轉(zhuǎn)到24孔板培養(yǎng)，待其增殖到一定數(shù)量后再轉(zhuǎn)入細(xì)胞瓶中擴(kuò)大培養(yǎng)。
6．雜交瘤細(xì)胞的凍存將成對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的雜交瘤細(xì)胞收集入離心管，1000rpm離心10分鐘，棄上清，加入1ml凍存液混勻，然后加到凍存管，在-70℃代溫冰箱過(guò)夜后移入液氮罐長(zhǎng)期保存。
7．腹水型單克隆抗體制備將培養(yǎng)的雜交瘤細(xì)胞吹打下來(lái)，1000rpm離心10分鐘，收集上清作亞型試驗(yàn)，加無(wú)血清培養(yǎng)液到沉淀的細(xì)胞中，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1×106個(gè)／ml。每只Ba／b／c小鼠注射0．5ml，接種雜交瘤細(xì)胞后7～14天，拉頸脫臼處死小鼠，吸取腹水，離心，收集上清，分裝后-20℃凍存?zhèn)溆谩?br> 8．單克隆抗體的鑒定抗鰻弧菌單抗篩選到8株能穩(wěn)定分泌單克隆抗體的陽(yáng)性細(xì)胞株，分別命名為2H2、3B2、3D2、3A3、3C4、4A6、4E3和4E12。經(jīng)亞類鑒定其中2H2、3D2、3B2和4E12為IgG3；4E3為IgG2a；3A3、3C4、4A6為IgG1。經(jīng)效價(jià)測(cè)定，這些單抗效價(jià)為1×10-5～1×10-7。
抗創(chuàng)傷弧菌單抗篩選到12株能穩(wěn)定分泌單抗的雜交瘤細(xì)胞株，命名為1B12、3E9、3F11、3E3、2G8、3D5、1E11、3H4、2F1、1A1、2F6和1G1。經(jīng)亞類鑒定，其中2F6為IgG3、1B12、3E3、3H4、1A1為IgG2a；2G8、3D5、2F1為IgG1。經(jīng)效價(jià)測(cè)定，以上單抗的效價(jià)為1×10-5～1×10-7。
抗溶藻弧菌單抗篩選到8株能穩(wěn)定分泌單抗的雜交瘤細(xì)胞中，命名為2E3、2E4、2G2、2G8、2D11、3A10、3B12和4C7。經(jīng)亞類鑒定，其中2E3為IgG3，2G2、2D11、3A10為IgG2a；2E4、3B12為IgG2b；2G8、4C7為IgG1。經(jīng)效價(jià)鑒定，以上單抗的效價(jià)為1×10-6～1×10-7。
抗遲緩愛德華菌單抗篩選到10株單抗雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為1B4、4D3、4D5、3F7、5A11、5H5、6B1l、6E1、6E6和6H3。經(jīng)亞類鑒定，其中1B4、3F7、5A11、5H5、6B11為IgG1，6El為IgG2b；4D3、4D5、6E6、6H3為IgG3。經(jīng)效價(jià)測(cè)定，以上單抗的效價(jià)為1×10-6～1×10-7。
(三)抗獨(dú)特型單抗(ab2)的制備1．動(dòng)物免疫將以上單抗進(jìn)行純化，然后以腹腔注射免疫小鼠，第一次免疫500μl／只小鼠(100μg／抗體蛋白／只)。
在第一次免疫后的第2、4、6周及細(xì)胞融合前3天，分別以同樣方法各追加免疫一次。
2．細(xì)胞融合(1)免疫脾細(xì)胞的制備①取免疫小鼠脾臟，放入盛有5ml不完全的培養(yǎng)液的平皿中，置于200目的不銹鋼銅網(wǎng)上。用注射器內(nèi)芯研磨脾臟，并用平皿內(nèi)不完全培養(yǎng)液輕輕沖洗鋼網(wǎng)，使脾細(xì)胞全部通過(guò)網(wǎng)孔擠壓到溶液中。
②將脾細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)入50ml離心管中，加不完全培養(yǎng)液至30ml，混勻，1000rpm離心5分鐘，棄去上清。
③用不完全培養(yǎng)液將沉淀細(xì)胞再離心洗滌一次(重復(fù)步驟②)，將細(xì)胞垂懸至10ml，混勻，用細(xì)胞記數(shù)板記數(shù)。
(2)SP2／0骨髓瘤細(xì)胞懸液的制備①將4瓶擴(kuò)增培養(yǎng)的骨髓瘤細(xì)胞收集到50ml離心管內(nèi)。
②1000rpm離心5分鐘，棄去上清。
③再加入30ml不完全培養(yǎng)液，重復(fù)步驟②再離心洗滌一次，然后將細(xì)胞垂懸至10ml，混勻，記數(shù)。
(3)細(xì)胞融合①分別吸取含1×108個(gè)脾細(xì)胞和懸液和含2-3×107個(gè)骨髓瘤細(xì)胞的懸液，加入一支50ml離心管中，補(bǔ)加不完全培養(yǎng)液至30ml，充分混勻。
②1000rpm離心7分鐘，棄去上清。
③加50％的融合劑PEG 0．7ml。
④加入25ml不完全培養(yǎng)液，使PEG稀釋而失去促融作用。
⑤800rpm離心7分鐘，棄去上清。
⑥加入20ml HAT培養(yǎng)液，輕輕吹吸沉淀細(xì)胞，使其垂懸并混勻。
⑦將細(xì)胞懸液加入輔有飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔培養(yǎng)板中，每孔0．1ml，在37℃含5％CO2的孵箱中培養(yǎng)。
3．抗獨(dú)特型抗體檢測(cè)--雙抗夾心ELISA法(1)用純化后的兔抗病菌抗體包被酶標(biāo)板(2)加有克隆生長(zhǎng)的孔中的培養(yǎng)上清100μl(3)加酶標(biāo)單抗鼠IgG抗體100μl(4)加底物液100μl，室溫避光顯色10～20分鐘(5)判定結(jié)果在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀492nm波長(zhǎng)下測(cè)定OD值，空白對(duì)照調(diào)零，若待測(cè)孔OD值大于或等于陰性對(duì)照孔2．1倍，即為陽(yáng)性克隆。
4．克隆化將96孔板中待做克隆化的雜交瘤細(xì)胞用加樣器反復(fù)吹打均勻后記數(shù)，然后采取有限稀釋法進(jìn)行逐級(jí)稀釋，加到96孔板進(jìn)行培養(yǎng)。觀察克隆生長(zhǎng)，記錄單克隆孔，并及時(shí)進(jìn)行陽(yáng)性檢測(cè)。將陽(yáng)性單克隆的細(xì)胞轉(zhuǎn)到24孔板培養(yǎng)，待其增殖到一定數(shù)量后再轉(zhuǎn)入細(xì)胞瓶中擴(kuò)大培養(yǎng)。
5．雜交瘤細(xì)胞的凍存將成對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的雜交瘤細(xì)胞收集入離心管，1000rpm離心10分鐘，棄上清，加入1ml凍存液混勻，然后加到凍存管，是-70℃代溫冰箱過(guò)夜的移入液氮罐長(zhǎng)期保存。
6．腹水型抗獨(dú)特型單克隆抗體的制備將培養(yǎng)的雜交瘤細(xì)胞吹打下來(lái)，1000rpm離心10分鐘，收集上清作直型試驗(yàn)，加無(wú)血清培養(yǎng)液到沉淀的細(xì)胞中，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1×106個(gè)／ml。每只Balb／c小鼠注射0．5ml，接種雜交瘤細(xì)胞后7～14天，拉頸脫臼處死小鼠，吸取腹水，離心，收集上清，分裝后-20℃凍存?zhèn)溆谩?br> 7．亞型及效價(jià)鑒定(1)鰻弧菌抗獨(dú)特型單克隆抗體共篩選到7株陽(yáng)性克隆，分別命名為1E10、1H12、2H12、1H5、1D1、2B12、2F12。經(jīng)亞型鑒定1E10屬于IgG3，2H12和1H12屬于IgG2a，1H5、1D1、2B12、2F12均為IgG2b。經(jīng)效價(jià)測(cè)定，以上抗獨(dú)特單抗的效價(jià)范圍為1×10-4～1×10-6。
(2)遲緩愛德華菌抗獨(dú)特型單克隆抗體共篩選到6株陽(yáng)性克隆，分別命名為2C8、1E5、2F1、2B3、1E11、1B11。經(jīng)亞類鑒定2C8、2F1和1B11為IgG2b；1E11、2B3、1E5為IgG3。經(jīng)效價(jià)測(cè)定，以上抗獨(dú)特型抗體的效價(jià)可達(dá)1×10-5～1×10-6。
(3)創(chuàng)傷弧菌抗獨(dú)特型單抗共篩選到5株陽(yáng)性克隆，分別命名為1C9、4A5、3A12、1C11、3B7。經(jīng)亞類鑒定1C9、3A12為IgG2b，4A5為IgG2a、1C11、3B7為IgG3。經(jīng)效價(jià)測(cè)定，以上抗體的效價(jià)為1×10-4～1×10-5。
(4)溶藻弧菌抗獨(dú)特型單抗共篩選到5株陽(yáng)性克隆，分別命名為1H2、2F4、1D10、1H5、1B2。經(jīng)亞類鑒定，1H2為IgG2a，2F4為IgG2b，1D10和1B2為IgG3，1H5為IgG1。經(jīng)效價(jià)測(cè)定，以上單抗的效價(jià)為1×10-4～1×10-5。
8．β型抗獨(dú)特型抗體的鑒定(1)經(jīng)競(jìng)爭(zhēng)抑制測(cè)定顯示，鰻弧菌抗獨(dú)特型單克隆抗體1D1、1E10和1H12能有效抑制抗原與Ab1結(jié)合，抑制率達(dá)70％以上，而且抑制率隨Ab2濃度的下降而降低，說(shuō)明以上三株單抗與抗原識(shí)別相同的Ab1表位，能有效地與抗原競(jìng)爭(zhēng)Ab1結(jié)合位點(diǎn)，說(shuō)明它們是β型鰻弧菌抗獨(dú)特型單克隆抗體。
(2)遲緩愛德華菌抗獨(dú)特型單克隆抗體1E5和1E11能較強(qiáng)地抑制抗原與Ab1的結(jié)合，抑制率達(dá)60％以上，而且抑制率隨其濃度的降低而降低。說(shuō)明該2株單抗與抗原識(shí)別相同的Ab1表位，有效地與抗原競(jìng)爭(zhēng)Ab1的結(jié)合位點(diǎn)。說(shuō)明它們是β型遲緩愛德華菌抗獨(dú)特型單克隆抗體。
9．以抗獨(dú)特型單克隆抗體(ab2)為免疫原誘導(dǎo)產(chǎn)生抗病菌的抗體(ab3)(1)以腹水型ab2為免疫原免疫Ba／b／c小鼠，每次免疫量及追加免疫次數(shù)同ab2的制備。第四次免疫5天后，摘除小鼠眼球放血，收集抗血清(Ab3)。
(2)ab3的檢測(cè)-間接ELISA法，1)用已知抗原滅活菌液包被。
2)加有克隆長(zhǎng)生的孔中的培養(yǎng)上清100μ1。
3)加酶標(biāo)單抗鼠IgG抗體100μl。
4)加底物液100μl，室溫避光顯色10～20分鐘。
5)判定結(jié)果在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀492nm波長(zhǎng)下測(cè)定OD值，空白對(duì)照調(diào)零，若待測(cè)孔OD值大于或等于陰性對(duì)照孔2．1倍，即為陽(yáng)性克隆。
(3)由鰻弧菌抗獨(dú)特型單克隆抗體1E10、1H5、1D1和2H12誘導(dǎo)產(chǎn)生的鼠血清中含有抗鰻弧菌的抗血(ab3)，OD值分別是對(duì)照組2倍以上，其效價(jià)為1∶100～1∶1000。
(4)由遲緩愛德華菌抗獨(dú)特型單克隆抗體1E5和1E11誘導(dǎo)產(chǎn)生的鼠血清中含有抗遲緩愛德華菌抗體。其效價(jià)為1∶10～1∶200。
10．抗獨(dú)特型單克隆抗體疫苗對(duì)牙鲆的免疫保護(hù)作用(1)方法抗獨(dú)特型單抗和弗氏不完全佐劑1∶1混和，腹腔注射免疫牙鲆海魚，每尾注射0．05m1(含單抗10～20μg)，免疫一個(gè)月后，用致死量的病菌腹腔注射攻擊牙鲆魚，觀察抗獨(dú)特型單克隆抗體疫苗對(duì)牙鲆的保護(hù)作用。
保護(hù)率的計(jì)算公式免疫保護(hù)率=(實(shí)驗(yàn)組存活率-對(duì)照組存活率)／對(duì)照組死亡率×100％(2)結(jié)果①鰻弧菌抗獨(dú)特型單抗1D1、1E10、1H12對(duì)牙鲆的保護(hù)率分別為82．5％、88．7％和81．2％。
②遲緩愛德華菌抗獨(dú)特型單抗1E11和1E5對(duì)牙鲆的保護(hù)率分別60．2％和20．8％。
③溶藻弧菌抗獨(dú)特單抗2F4、1B2對(duì)牙鲆的保護(hù)率分別為50．2％和90．0％。
④創(chuàng)傷弧菌抗獨(dú)特型單抗Va1、Va2對(duì)牙鲆的保護(hù)率分別為31．6％和15．2％。
以上對(duì)海魚保護(hù)率達(dá)60％以上的抗獨(dú)特型單克隆抗體，可用作海魚抗獨(dú)特型單抗免疫制劑。
11．制備成品將鰻弧菌抗獨(dú)特型單抗中的1E10，遲緩愛德華抗獨(dú)特型單抗中的1E11，浣藻弧菌抗獨(dú)特型單抗中的1B2單抗以1∶2∶1的比例混和，制成魚病多聯(lián)抗獨(dú)特型單抗疫苗制劑。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明魚病多聯(lián)抗獨(dú)特型單克隆抗體疫苗制劑對(duì)海魚的保護(hù)率達(dá)到60％以上，抗獨(dú)特型單抗疫苗除了對(duì)海魚有很好的免疫保護(hù)外，它還具備以下獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)即不含有毒的抗原成分，不會(huì)對(duì)海魚造成任何損害，另外抗獨(dú)特型抗體不存在種系差別，使用時(shí)無(wú)須考慮種系問(wèn)題，適用范圍非常廣，對(duì)海魚養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展十分有益。
權(quán)利要求
1．魚病多聯(lián)抗獨(dú)特型單克隆抗體疫苗制劑，其特征是將將鰻弧菌、創(chuàng)傷弧菌、溶藻弧菌、遲緩愛德華菌進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，再將培養(yǎng)后的菌液腹腔注射免疫小鼠Ba／b／c，取免疫后小鼠脾細(xì)胞和SP2／0骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合，將細(xì)胞融合的細(xì)胞懸液進(jìn)行培養(yǎng)，用酶聯(lián)免疫反應(yīng)法(ELISA法)檢測(cè)陽(yáng)性克隆，將確定為陽(yáng)性的孔以有限稀釋法，進(jìn)行克隆化，再將陽(yáng)性克隆的雜交瘤細(xì)胞株擴(kuò)增培養(yǎng)，腹腔注射接種到Ba／b／c小鼠制備出腹水型單抗；將以上腹水型單抗以ELISA法進(jìn)行效價(jià)，亞類及交叉試驗(yàn)，挑選效價(jià)較高的單克隆抗體，對(duì)海魚進(jìn)行保護(hù)試驗(yàn)，挑選對(duì)海魚有較高保護(hù)率的單抗進(jìn)行純化，以每只小鼠10～100μg的量，腹腔注射免疫小鼠；然后進(jìn)行細(xì)胞融合，篩選出能穩(wěn)定分泌抗獨(dú)特型單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，將細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)，調(diào)整為1×106／ml，以每只小鼠0．5ml量，腹腔注射接種到Ba／b／c小鼠，制備腹水型抗獨(dú)特型單克隆抗體，采用ELISA法，對(duì)以上單抗進(jìn)行亞類、效價(jià)及β型抗獨(dú)特型單克隆抗體鑒定；用以上單抗與不完全弗氏佐劑(1∶1～1∶2)混和，腹腔注射免疫海魚，再挑選出對(duì)海魚有較高保護(hù)率的抗獨(dú)特型單抗以一定比例配制成魚病多聯(lián)抗獨(dú)特型單抗疫苗制劑。
全文摘要
魚病多聯(lián)抗獨(dú)特型單克隆抗體疫苗制劑,涉及生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明將鰻弧菌、創(chuàng)傷弧菌、溶藻弧菌、遲緩愛德華菌免疫小鼠,進(jìn)行細(xì)胞融合,再克隆化,制備出特異性很強(qiáng),且效價(jià)較高的單抗,進(jìn)行純化,再免疫小鼠,制備抗獨(dú)特型單抗,挑選出保護(hù)率較高的抗獨(dú)特型單抗以一定比例配制成魚病多聯(lián)抗獨(dú)特型單抗疫苗制劑。對(duì)養(yǎng)殖魚起很好的免疫保護(hù)作用,不污染環(huán)境,不會(huì)通過(guò)食物鏈對(duì)人類造成損害。
文檔編號(hào)A61P43/00GK1293066SQ0011392
公開日2001年5月2日 申請(qǐng)日期2000年9月20日 優(yōu)先權(quán)日2000年9月20日
發(fā)明者黃威權(quán), 夏永娟, 李元, 李別虎, 金曉航, 張榮慶 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)