專利名稱：臍帶華通膠間充質(zhì)干細(xì)胞在制備細(xì)胞移植材料中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物材料在制備醫(yī)用材料中的用途，特別涉及以人臍帶華通膠為原料制備的間充質(zhì)干細(xì)胞在制備細(xì)胞移植材料以及組織工程種子細(xì)胞材料方面的應(yīng)用。按本發(fā)明方法制備的醫(yī)用材料，包括細(xì)胞移植材料和種子細(xì)胞材料，可以用于對(duì)椎間盤退變性疾病的治療。
背景技術(shù)：
椎間盤退變性疾病(degenerative disc disease, DDD)是一種常見(jiàn)病、多發(fā)病， 所引起的下腰痛常嚴(yán)重影響患者的工作及生活。椎間盤由纖維環(huán)包繞凝膠狀的髓核組織及上下的軟骨終板組成，其凝膠狀的髓核組織含有大量蛋白多糖及II型膠原，蛋白多糖可吸收水分增強(qiáng)張力，以對(duì)抗上下椎體的壓力。椎間盤退變時(shí)髓核內(nèi)細(xì)胞數(shù)量減少，增殖能力降低，合成蛋白多糖及II型膠原等細(xì)胞外基質(zhì)的能力下降，使髓核含水量低，影響了椎間盤的生物力學(xué)性能。目前對(duì)椎間盤退變的治療方法包括保守治療和手術(shù)治療。使用較多的髓核摘除術(shù)和脊柱融合術(shù)，能暫時(shí)緩解臨床癥狀，但遠(yuǎn)期療效不理想，且有一定并發(fā)癥。近年來(lái)，建立在組織工程技術(shù)和細(xì)胞移植技術(shù)的治療策略，利用種子細(xì)胞、支架材料及參入各種細(xì)胞因子以修復(fù)退變椎間盤，展現(xiàn)了良好的前景。無(wú)論是組織工程技術(shù)還是細(xì)胞移植技術(shù)的應(yīng)用，自體髓核細(xì)胞被認(rèn)為是最理想的種子細(xì)胞，但髓核中細(xì)胞含量少，髓核細(xì)胞體外增殖能力差，其來(lái)源受到很大限制，不能滿足治療需要；而且，從相鄰椎間盤獲取自體髓核細(xì)胞會(huì)引起相應(yīng)椎間盤的退變。因此，尋找一種擴(kuò)增能力強(qiáng)，易于獲取的適用種子細(xì)胞是成為當(dāng)前應(yīng)用細(xì)胞移植技術(shù)治療椎間盤退變的關(guān)鍵問(wèn)題。由于間充質(zhì)干細(xì)胞具有無(wú)限增殖能力及多能分化潛能，被認(rèn)為是當(dāng)前最有前景的種子細(xì)胞來(lái)源。已有學(xué)者利用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化成為髓核細(xì)胞，能夠分泌蛋白多糖及II型膠原等功能蛋白。但成人骨髓中還存在著造血細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等多種細(xì)胞成分，間充質(zhì)干細(xì)胞含量相對(duì)稀少，約為 1/105，分離純化相當(dāng)困難。而且，骨髓中間充質(zhì)干細(xì)胞的數(shù)量及增殖分化能力隨著年齡增長(zhǎng)迅速遞減。其他來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞如脂肪、腎臟、肺及胎兒臍血等間充質(zhì)干細(xì)胞，或者含量稀少難以制備，或需創(chuàng)傷性手術(shù)才能獲得，因此限制了它們的臨床應(yīng)用。本專利申請(qǐng)所稱“臍帶華通膠間充質(zhì)干細(xì)胞”，或稱“來(lái)源于臍帶華通膠的間充質(zhì)干細(xì)胞”，英文名稱為“Umbilical Cord Wharton's Jelly-Derived MSCs，UW-MSCs”，是指以臍帶華通膠為原材料經(jīng)擴(kuò)增技術(shù)傳代培養(yǎng)的細(xì)胞群。胎兒娩出母體后，胎盤連同臍帶的生理功能終結(jié)，繼胎兒之后被母體排出體外，成為人體排泄物。剖腹產(chǎn)是對(duì)胎兒生產(chǎn)過(guò)程的人工干預(yù)，在以手術(shù)方法從母腹中取出胎兒后，同時(shí)將胎盤連同臍帶作為遺棄物從母腹中取出。近年來(lái)，醫(yī)學(xué)界發(fā)現(xiàn)，存在于臍帶華通膠的間充質(zhì)干細(xì)胞有許多潛在的利用價(jià)值。包括本申請(qǐng)人的在先專利申請(qǐng)“200910157731. 6臍帶華通膠間充質(zhì)干細(xì)胞的制備方法及其產(chǎn)品”在內(nèi)的若干文獻(xiàn)，公開(kāi)了將華通膠間充質(zhì)干細(xì)胞在體外誘導(dǎo)分化為脂肪細(xì)胞、骨細(xì)胞、 軟骨細(xì)胞、心肌細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞及神經(jīng)細(xì)胞的技術(shù)，但尚無(wú)人報(bào)告華通膠間充質(zhì)干細(xì)胞具有向髓核細(xì)胞分化的潛能。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是，將臍帶華通膠間充質(zhì)干細(xì)胞應(yīng)用于制備細(xì)胞移植材料或組織工程種子細(xì)胞材料，所制備的細(xì)胞移植材料或組織工程種子細(xì)胞材料可用于人椎間盤退行性病變的治療。本發(fā)明臍帶華通膠間充質(zhì)干細(xì)胞在制備細(xì)胞移植材料和組織工程種子細(xì)胞材料中的應(yīng)用，其方法包括以下工藝步驟以新生兒臍帶為材料制備華通膠間充質(zhì)干細(xì)胞；分離培養(yǎng)正常髓核細(xì)胞。以實(shí)施椎間盤摘除術(shù)被摘除遺棄的椎間盤標(biāo)本為材料分離制備髓核細(xì)胞；應(yīng)用非接觸式或接觸式細(xì)胞共培養(yǎng)方法以髓核細(xì)胞誘導(dǎo)分化臍帶華通膠間充質(zhì)干細(xì)胞成為髓核細(xì)胞。本發(fā)明應(yīng)用臍帶華通膠間充質(zhì)干細(xì)胞為原材料制備用于人椎間盤退行性病變治療的細(xì)胞移植材料或組織工程種子細(xì)胞材料，其中的髓核細(xì)胞性能接近于自體髓核細(xì)胞， 是一種比較理想的同種異體移植醫(yī)用生物材料，顯示了諸多優(yōu)點(diǎn)人臍帶華通膠來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞可活躍增殖進(jìn)行自我更新并具有多向分化潛能，相對(duì)于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，來(lái)源豐富，易于提?。患?xì)胞具有端粒酶活性，增殖能力強(qiáng)；不表達(dá)HLA-DR，低表達(dá)HLA-ABC，其免疫源性更低；其來(lái)源為臍帶，是嬰兒分娩后的遺棄物，避免了倫理道德問(wèn)題。
具體實(shí)施例方式以下通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。實(shí)施例1分離培養(yǎng)華通膠間充質(zhì)干細(xì)胞取新鮮新生兒臍帶約30cm為材料，無(wú)菌儲(chǔ)存于D-Hanks液中，2_6°C保存。所取臍帶材料以足月產(chǎn)健康新生兒臍帶為優(yōu)，可保證其臍帶發(fā)育良好；再則，優(yōu)選剖腹產(chǎn)新生兒臍帶，較之陰道產(chǎn)感染率低。在超凈工作臺(tái)中用平衡鹽溶液洗去臍帶殘留血液，將臍帶剪成4cm大小節(jié)段，對(duì)每一節(jié)段均縱行剪開(kāi)臍帶外膜，游離去除2條臍動(dòng)脈和1條臍靜脈，取血管之間以及血管與外膜之間的華通膠組織，剪切成約Imm3大小碎塊，以平衡鹽溶液沖洗后，浸于濃度為0. 2% 膠原酶溶液中，膠原酶溶液，置37°C消化5小時(shí)，觀察消化情況，未見(jiàn)組織塊，消化液成粘稠狀，2500rpm離心10分鐘，棄掉上層上清液，剩余粘稠液體再用0. 25%胰蛋白酶37°C恒溫消化30分鐘，2500rpm離心10分鐘，棄上清液，加DMEM/F12培養(yǎng)基和胎牛血清，使胎牛血清濃度達(dá)到20%，于37°C、5%二氧化碳條件培養(yǎng)。細(xì)胞于第2天開(kāi)始貼壁，第4天用含20% 胎牛血清的DMEM/F12完全培養(yǎng)基進(jìn)行換液。以后每2 3天換液一次，待細(xì)胞融合達(dá)到 80-90%時(shí)，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。棄上清液，PBS洗細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶消化5分鐘，IOOOrpm離心，進(jìn)行細(xì)胞傳代。傳代后用含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，每3天進(jìn)行換液。細(xì)胞免疫表型鑒定，表達(dá)⑶73，⑶90，⑶105，⑶四，⑶166，HLA-ABC,不表達(dá)⑶；34，⑶45， HLA-DR0實(shí)施例2分離培養(yǎng)正常髓核細(xì)胞椎間盤摘除術(shù)是長(zhǎng)久以來(lái)對(duì)椎間盤突出癥患者普遍實(shí)施的一種手術(shù)治療方法，手術(shù)過(guò)程是將移位的椎間盤摘除或部分切除。本發(fā)明是收集新鮮的經(jīng)手術(shù)摘除的椎間盤標(biāo)本，立即在超凈工作臺(tái)中分離出髓核組織，PBS清洗兩遍，除去殘留的血液。將髓核組織剪碎約1. Omm3大小，放入5ml離心管中，加入用DMEM/F12無(wú)血清培養(yǎng)基配制好的0. 2% II型膠原酶溶液，置37°C消化5小時(shí)，通過(guò)無(wú)菌不銹鋼絲網(wǎng)OOOmm)過(guò)濾組織碎片。細(xì)胞懸液 1000r/min離心5分鐘，棄上清液，收集細(xì)胞，加入含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基，于 37°C、5%二氧化碳條件培養(yǎng)。細(xì)胞于第2天開(kāi)始貼壁，以后每2 3天換液一次，待細(xì)胞融合達(dá)到80-90%時(shí)，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。傳代后用含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)， 每3天進(jìn)行換液。實(shí)施例3非接觸式細(xì)胞共培養(yǎng)方法誘導(dǎo)分化臍帶華通膠間充質(zhì)干細(xì)胞用帶有插入層的Transwell六孔板進(jìn)行非接觸式共培養(yǎng)，其插入層具有高密度孔徑，孔徑大小為0. 4 μ m，細(xì)胞因子能夠穿過(guò)，其材料為聚對(duì)苯二甲酸乙酯，細(xì)胞能夠粘附生長(zhǎng)，插入層接種髓核細(xì)胞，六孔板下層接種華通膠間充質(zhì)干細(xì)胞，細(xì)胞最優(yōu)接種數(shù)量為，華通膠間充質(zhì)干細(xì)胞2 X 104，髓核細(xì)胞為6X 104。培養(yǎng)7天后，收集華通膠間充質(zhì)干細(xì)胞。實(shí)施例4接觸式細(xì)胞共培養(yǎng)方法誘導(dǎo)分化臍帶華通膠間充質(zhì)干細(xì)胞(1)利用活細(xì)胞染料羧基熒光素乙酰乙酸琥珀酰亞胺酯(5， 6-carboxyfluorescein diacetate succinimidy ester, CFSE)標(biāo)記華通膠間充質(zhì)干細(xì)胞。 胰蛋白酶消化收集第三代細(xì)胞，PBS洗兩遍，計(jì)數(shù)細(xì)胞，用無(wú)血清DMEM/F12培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1. O X 106/ml，加入一定量10 μ mol/L濃度的CFSE溶液，使其終濃度為 5. 0mol/L，37°C孵育30分鐘，加入一定量胎牛血清使其終濃度為40%，終止反應(yīng)10分鐘， IOOOrpm離心5分鐘，PBS洗兩遍，用于細(xì)胞共培養(yǎng)。(2)用普通六孔板進(jìn)行接觸式共培養(yǎng)。細(xì)胞接種密度為6. OX 107cm2。用含10% 胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基，37°C、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔2 3天換液。細(xì)胞最優(yōu)接種數(shù)量為，華通膠間充質(zhì)干細(xì)胞1. 5X104,髓核細(xì)胞4. 5X 104。細(xì)胞培養(yǎng)7天，每2 3天換液。(3)共培養(yǎng)7天后對(duì)接觸式共培養(yǎng)的細(xì)胞利用MoFlo高速流式細(xì)胞分選儀進(jìn)行細(xì)胞分選。胰蛋白酶消化細(xì)胞，IOOOrpm離心5分鐘，PBS洗兩遍，用250 μ IPBS懸浮細(xì)胞，通過(guò)直徑30 μ m的無(wú)菌濾網(wǎng)，除去細(xì)胞團(tuán)塊，進(jìn)行高速流式細(xì)胞分選。激發(fā)波長(zhǎng)為490 μ m，發(fā)射波長(zhǎng)為530 μ m。熒光陽(yáng)性細(xì)胞為華通膠間充質(zhì)干細(xì)胞，熒光陰性細(xì)胞為髓核細(xì)胞。細(xì)胞收集于含PBS液的離心管中。在實(shí)際應(yīng)用時(shí)，可任意選擇使用實(shí)施例3所述的非接觸式細(xì)胞共培養(yǎng)方法或者實(shí)施例4所述的接觸式細(xì)胞共培養(yǎng)方法。發(fā)明人根據(jù)實(shí)時(shí)定量PCR(ReaI-TimePCR)分析共培養(yǎng)后華通膠間充質(zhì)干細(xì)胞基因表達(dá)變化，結(jié)果表明接觸式共培養(yǎng)或非接觸式共培養(yǎng)后，華通膠間充質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)髓核細(xì)胞標(biāo)志基因(S0X-9、II型膠原和蛋白多糖)顯著上調(diào)；ELISA 方法分析共培養(yǎng)后的華通膠間充質(zhì)干細(xì)胞合成及分泌蛋白多糖和二型膠原的能力顯著提高，證明華通膠間充質(zhì)干細(xì)胞被誘導(dǎo)分化為髓核細(xì)胞。其作為一種醫(yī)用生物材料，可以按細(xì)胞移植方法治療椎間盤退行性變；也可作為組織工程種子細(xì)胞，復(fù)合組織工程支架，構(gòu)建組織工程椎間盤，用于治療椎間盤退變性疾病。下述發(fā)明人所做的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，證明了本發(fā)明技術(shù)的實(shí)用性。實(shí)驗(yàn)例華通膠間充質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞移植治療椎間盤退變動(dòng)物實(shí)驗(yàn)
家犬在CT引導(dǎo)下穿刺椎間盤纖維環(huán)，進(jìn)行椎間盤退變動(dòng)物模型制作。術(shù)后6周 MRI顯示穿刺造模椎間盤發(fā)生退變，Pfirrmarm分級(jí)退變達(dá)到4級(jí)。家犬在麻醉下進(jìn)行經(jīng)接觸式共培養(yǎng)誘導(dǎo)分化的華通膠間充質(zhì)干細(xì)胞移植，將1 X IO6細(xì)胞經(jīng)注射器移植入退變椎間盤間隙，空白對(duì)照組注射aiilPBS溶液。2月后進(jìn)行影像學(xué)觀察，實(shí)驗(yàn)組椎間盤經(jīng)細(xì)胞移植治療后，椎間盤退變由PfirrmanM級(jí)改善為3級(jí)，椎間盤高度增高；對(duì)照組椎間盤退變變?yōu)? 級(jí)，椎間盤間隙變窄。處死動(dòng)物后，進(jìn)行免疫組織化學(xué)分析表明，實(shí)驗(yàn)組椎間盤髓核內(nèi)蛋白多糖和二型膠原含量比對(duì)照組顯著增高。
權(quán)利要求
1.臍帶華通膠間充質(zhì)干細(xì)胞在制備人椎間盤細(xì)胞移植材料和制備椎間盤組織工程種子細(xì)胞材料中的應(yīng)用。
2.權(quán)利要求1所述的臍帶華通膠間充質(zhì)干細(xì)胞的應(yīng)用包括以下方法步驟以分娩后新生兒臍帶為材料制備華通膠間充質(zhì)干細(xì)胞；以實(shí)施椎間盤摘除術(shù)被摘除遺棄的椎間盤標(biāo)本為材料分離培養(yǎng)正常髓核細(xì)胞；以與髓核細(xì)胞共培養(yǎng)方法誘導(dǎo)分化臍帶華通膠間充質(zhì)干細(xì)胞。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的臍帶華通膠間充質(zhì)干細(xì)胞的應(yīng)用，其特征在于，所述臍帶華通膠間充質(zhì)干細(xì)胞的制備包括以下步驟取臍帶血管之間以及血管與外膜之間的華通膠組織，經(jīng)膠原酶消化18小時(shí)、胰蛋白酶消化30分鐘，用含20%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的臍帶華通膠間充質(zhì)干細(xì)胞的應(yīng)用，其特征在于，所述正常髓核細(xì)胞的分離培養(yǎng)包括以下步驟取新鮮椎間盤標(biāo)本分離髓核組織，經(jīng)II型膠原酶溶液消化5小時(shí)，再以含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的臍帶華通膠間充質(zhì)干細(xì)胞的應(yīng)用，其特征在于，所述以與髓核細(xì)胞共培養(yǎng)方法誘導(dǎo)分化臍帶華通膠間充質(zhì)干細(xì)胞的方法為非接觸式方法，具體工藝步驟為使用聚對(duì)苯二甲酸乙酯制作的、孔徑大小為0. 4 μ m的Transwell六孔板進(jìn)行共培養(yǎng)， 其插入層接種髓核細(xì)胞6 X IO4,下層接種華通膠間充質(zhì)干細(xì)胞2 X IO4,培養(yǎng)7天后，收集華通膠間充質(zhì)干細(xì)胞。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的臍帶華通膠間充質(zhì)干細(xì)胞的應(yīng)用，其特征在于，所述以與髓核細(xì)胞共培養(yǎng)方法誘導(dǎo)分化臍帶華通膠間充質(zhì)干細(xì)胞的方法為接觸式方法，具體工藝步驟為用乙酰乙酸琥珀酰亞胺酯標(biāo)記華通膠間充質(zhì)干細(xì)胞，與髓核細(xì)胞混勻，接種于普通六孔板，細(xì)胞接種密度為6. 0 X IOVcm2 ；培養(yǎng)7天后進(jìn)行細(xì)胞分選，收集華通膠間充質(zhì)干細(xì)胞。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的臍帶華通膠間充質(zhì)干細(xì)胞的應(yīng)用，其特征在于，所述以接觸式誘導(dǎo)分化臍帶華通膠間充質(zhì)干細(xì)胞的方法中，接種的髓核細(xì)胞數(shù)量為華通膠間充質(zhì)干細(xì)胞的3倍。
全文摘要
本發(fā)明涉及臍帶華通膠間充質(zhì)干細(xì)胞在制備醫(yī)用生物材料中的應(yīng)用。這種醫(yī)用生物材料可以用于人椎間盤細(xì)胞移植，也可用作椎間盤組織工程的種子細(xì)胞。它是以新鮮人臍帶為材料制備華通膠間充質(zhì)干細(xì)胞，以實(shí)施椎間盤摘除術(shù)時(shí)被摘除的椎間盤標(biāo)本為材料分離培養(yǎng)正常髓核細(xì)胞；再應(yīng)用非接觸式或接觸式細(xì)胞共培養(yǎng)方法誘導(dǎo)分化臍帶華通膠間充質(zhì)干細(xì)胞。
文檔編號(hào)A61L27/38GK102258809SQ20111019833
公開(kāi)日2011年11月30日 申請(qǐng)日期2011年7月15日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月15日
發(fā)明者何勍, 吳劍宏, 張燕, 張超, 李海峰, 王德利, 王超峰, 辛洪奎, 阮狄克 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍海軍總醫(yī)院