專利名稱：含有細(xì)胞生長因子的皮膚外用組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及皮膚外用組合物，特別是涉及含有細(xì)胞生長因子的不同劑型的皮膚外用組合物及其生產(chǎn)方法。本發(fā)明的皮膚外用組合物具有向正?；蚴艿阶贤夤?，炎癥和/或創(chuàng)傷損害的皮膚組織穩(wěn)定地釋放活性細(xì)胞生長因子肽，以治療皮膚炎癥和/或創(chuàng)傷并發(fā)揮防止皮膚萎縮、干皺的功能。
早在遠(yuǎn)古時(shí)期，人類就知道利用天然植物汁液、色素及各種帶顏色的礦物質(zhì)粉未制造化妝品。這些化妝品主要是以美容為目的的，而且有些成分可能對(duì)皮膚有毒害作用。在化學(xué)工業(yè)興起并不斷進(jìn)步之后，逐步發(fā)明了以烴類、酯類、醇類化學(xué)物質(zhì)為主，可以乳化的、有美容和皮膚保健作用的化妝品。本世紀(jì)中期以來，隨著經(jīng)濟(jì)的飛速發(fā)展和人們物質(zhì)生活的不斷改善，也增加了對(duì)美容和皮膚保健的關(guān)注與追求。近幾十年來，特別是在包括中國、日本和韓國在內(nèi)的一些國家出現(xiàn)了許多加有中草藥(包括植物、動(dòng)物及礦物質(zhì)來源的)的水或醇提取物的化妝品，這些中草藥包括但不只限于人參、皂角、當(dāng)歸、白芷、花粉、銀杏、蘆薈、珍珠粉等(例如參見中國專利申請(qǐng)87150120、87105347、89100708、92109672、93104735、93102038，以及日本專利申請(qǐng)?zhí)亻_昭60-23325)。自七十年代中后期發(fā)現(xiàn)表皮生長因子(EGF)及成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)等細(xì)胞生長因子后，也已有人試圖在常規(guī)化妝品中加入單獨(dú)的一種或多種細(xì)胞生長刺激肽，期望以其作為活性成分制備所謂的功能性化妝品和外用皮膚保護(hù)劑。
多肽生長因子是細(xì)胞增殖和分化的激素樣調(diào)節(jié)劑。已經(jīng)從各種組織和細(xì)胞中分離并鑒定了許多生長因子，其中包括表皮生長因子、血小板衍生的生長因子、神經(jīng)生長因子、造血細(xì)胞生長因子、以及成纖維細(xì)胞生長因子。
成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)最初是作為對(duì)BALB/c 3T3成纖維細(xì)胞具有生長促進(jìn)活性的因子，從牛垂體組織中分離的(D.Gospodarowicz，Nature 249123，1974)。該分子對(duì)酸和溫度敏感，并具有高的(堿性)等電點(diǎn)。后來發(fā)現(xiàn)從腦中分離的促細(xì)胞分裂因子與此前從腦垂體中分離的不同，因而基于它們具有相似的生物學(xué)活性和不同的等電點(diǎn)而分別稱為酸性和堿性FGF(即aFGF和bFGF)。aFGF和bFGF是至少8種結(jié)構(gòu)上相關(guān)的、具有肝素結(jié)合能力的分子家族的成員，它們可以選擇性地激發(fā)包括中胚層細(xì)胞和神經(jīng)外胚層細(xì)胞在內(nèi)的許多類型細(xì)胞的生物學(xué)反應(yīng)，這些細(xì)胞包括內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞、成肌細(xì)胞及成骨細(xì)胞。牛bFGF是具有154個(gè)氨基酸的多肽。人bFGF不同于牛bFGF在于其第121位氨基酸是蘇氨酸(Thr)而不是絲氨酸(Ser)，第137位氨基酸是絲氨酸(Ser)而不是脯氨酸(Pro)。本說明書下文中將牛和人堿性成纖維細(xì)胞生長因子以及我們的共同待批專利申請(qǐng)(申請(qǐng)?zhí)?6114279.0)中公開的稱為FGF-2m的人堿性成纖維細(xì)胞生長因子結(jié)構(gòu)類似物統(tǒng)稱為FGF-2。
除了刺激細(xì)胞生長外，F(xiàn)GF還可刺激許多類型的細(xì)胞以非有絲分裂方式發(fā)生不同的反應(yīng)，例如促進(jìn)細(xì)胞向受傷部位遷移(趨化因子活性)、促進(jìn)新的血管生成、調(diào)節(jié)神經(jīng)退化和存活性(神經(jīng)營養(yǎng)活性)、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌功能以及刺激或抑制特異性細(xì)胞蛋白質(zhì)表達(dá)、細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生及細(xì)胞存活等(Baird，A.and Bohler，P.，Handbook of Exp.Pharmacol.，95(1)369-418，1990)。這些性質(zhì)為使用FGF制備用來加速傷口愈合、神經(jīng)組織修復(fù)、預(yù)防和治療腦和心肌局部缺血(側(cè)枝血管生成)的藥物奠定了基礎(chǔ)。再者，僅就對(duì)皮膚組織的作用來說，由于皮膚組織的第二層即真皮組織以及第三層即皮下組織均來源于胚胎的中胚層，所以皮膚組織恰好是FGF的主要作用靶位。已有許多研究工作證實(shí)，F(xiàn)GF可促進(jìn)真皮及皮下組織內(nèi)細(xì)胞的分化和增殖，加速細(xì)胞更新，并分泌更多的膠原纖維和彈性纖維及基質(zhì)(Sprugel K.H.，et al.，Effect of growthfactor in vivo.l.cell ingrowth into porous supcutaneouschambers.Am.J.Pathol.129601-613，1987)，從而起到延緩皮膚衰老的作用。特別是，F(xiàn)GF可通過“量效效應(yīng)”或者說“級(jí)聯(lián)放大作用”來促進(jìn)細(xì)胞的分化與增殖，其作用比激素對(duì)機(jī)體系統(tǒng)的影響更為細(xì)微(Schweigere L.et al.，Capillary endothelial cells expressbasic fibroblast growth factor，a mitogen that promotes their owngrowth，Nature 325257-259，1987)。FGF不同于其他激素樣肽類生長因子在于它主要作用于皮膚的深層組織和細(xì)胞，而真皮層和皮下組織老化正是皮膚衰老、皺縮的根本原因。
表皮生長因子(EGF也稱為尿抑胃素)是由53或52個(gè)氨基酸組成的生長因子多肽。已發(fā)現(xiàn)EGF對(duì)包括表皮和間質(zhì)細(xì)胞及成纖維細(xì)胞在內(nèi)的多種類型細(xì)胞具有促分裂活性，因而可用于加速傷口愈合及治療消化道潰瘍(Knauer，D.J.et al.，Relationship betweenepidermal growth factor receptor occupaney and mitogenic response，J.Biol.Chem.259(9)5623-5631，1984；Okeef，E.et al.，Invest.Dermatol.，78482-485，1982及美國專利4,820,690)。就該生長因子的局部應(yīng)用來說，已公開了使用從尿中提取的EGF(β-尿抑胃素)作為活性成分與常規(guī)化妝品基質(zhì)相混合，制成包括化妝水、軟膏、乳液及口紅在內(nèi)的多種劑型的皮膚外用組合物或化妝品(見日本專利申請(qǐng)昭61-15810和中國專利申請(qǐng)CN1063410A)。
如眾所周知，包括表皮生長因子(EGF)和成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)、血小板衍生的生長因子(PDGF)在內(nèi)的多肽生長因子均表現(xiàn)有不穩(wěn)定性，即在常溫下和含水介質(zhì)中很容易失活，從而致使在實(shí)際應(yīng)用中遇到困難。本發(fā)明人在利用以DNA重組技術(shù)生產(chǎn)的人成纖維細(xì)胞生長因子(hFGF-2)或其結(jié)構(gòu)類似物制備外用治療劑以及制備FGF-2為基本活性成分的局部外用制劑或化妝品組合物的研究過程中發(fā)現(xiàn)，在常規(guī)載體和賦形劑內(nèi)加入一種或多種硫酸多糖類物質(zhì)和選自聚乙二醇、聚丙烯酸及羥丙基纖維素等的物質(zhì)作為穩(wěn)定劑或活性保護(hù)劑，可以大大提高FGF-2的穩(wěn)定性，使該活性蛋白質(zhì)在含水介質(zhì)或凝膠中的半壽期顯著延長，并具有較好的抗低pH能力及較好的溫度耐受性。
因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供含有細(xì)胞生長因子多肽的皮膚外用組合物，該組合物含有作為活性成分的至少一種細(xì)胞生長因子，至少一種所說的活性多肽的穩(wěn)定劑，以及皮膚外用上可接受的基質(zhì)或賦形劑。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，其中所說的細(xì)胞生長因子選自成纖維細(xì)胞生長因子、表皮生長因子、胰島素樣生長因子，血小板衍生的生長因子，及神經(jīng)生長因子和腦衍生的神經(jīng)生長因子。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中所說的細(xì)胞生長因子是成纖維細(xì)胞生長因子和/或表皮生長因子或它們的結(jié)構(gòu)類似物，并且所說的細(xì)胞生長因子可以是從天然來源提取的或以DNA重組技術(shù)產(chǎn)生的。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中所說的基質(zhì)是含有水溶性潤濕劑、親水凝膠劑和pH調(diào)節(jié)劑的含水凝膠基質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明的這一實(shí)施方案，其中所說的水溶性潤濕劑成分選自丙二醇、1，3-丁二醇、甘油、甘油二醇、透明質(zhì)酸及其鈉鹽或其交聯(lián)酯或由之分離的大分子透明質(zhì)酸素，或脫乙酰殼多糖；所說的親水性凝膠劑選自羧甲基纖維素，羥丙基纖維素、甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、明膠、黃原膠、硅硐樹膠、瓜耳樹膠和海藻酸及其鈉鹽。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，其中所說的活性蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑可選自硫酸多糖例如角叉聚糖、肝素、硫酸肝素、硫酸葡聚糖、硫酸甘露聚糖、多磷酸戊聚糖、硫酸環(huán)糊糊、硫酸氨基葡聚糖、羥甲基氨基多糖、羥甲基纖維素、蔗糖八硫酸酯、以及多聚甘氨酸、聚乙二醇和聚丙二醇。
根據(jù)本發(fā)明的這一實(shí)施方案，其中所說的加在水凝膠質(zhì)基質(zhì)中的細(xì)胞生長因子的含量為0.1-1000ppm(重量)，較好為1-100ppm；水溶性潤濕劑的含量為0.5-30％(重量)較好為大約5-20％(重量)；親水性凝膠劑的含量約為0.05-20％(重量)，較好為大約0.1-5％(重量)；且水凝膠質(zhì)基中的活性多肽穩(wěn)定劑含量約為0.1-1000ppm，較好約為1-100ppm。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案，其中所說的基質(zhì)是由水、水溶性潤濕劑、脂類及乳化劑制成的乳劑。其中所說的乳化劑可以是選自長鏈飽和或不飽和脂肪酸的一、二或三甘油酯、飽和或不飽和脂肪酸的脫水山梨醇酯的親脂乳化劑；選自磷脂酰甘油二?；ィ字Ｄ憠A二?；?、卵磷脂、磷脂酰膽堿二肉豆蔻酰酯、磷脂酰甘油二肉豆蔻酰酯的磷脂、以及選自聚氧乙烯脫水山梨醇的單硬脂酸、單油酸酯的兩性離子型乳化劑。
根據(jù)本發(fā)明，所說的含細(xì)胞生長因子的含水凝膠型皮膚外用組合物中可以加入一種或多種選自a-生育酚、抗壞血酸、谷胱甘肽或其衍生物的自由基清除劑；一種或多種選自維生素A、抗壞血酸、維生素B、生物素、泛酸、維生素D、維生素E的維生素；一種或多種選自羥基苯甲酸甲酯、乙酯、丙酯和丁酯，及苯氧基丙醇的水溶性防腐劑。另外還可以含有選自N-乙酰-L-半胱氨酸及其衍生物的抗皮膚皺紋形成劑和選自水楊酸及其衍生物的角蛋白溶解劑，以及選自聚甲基丙烯酸甘油酯及其衍生物的潤滑劑，以及選自月桂皂和二甲亞砜的皮膚滲透劑。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，其中可在所說的含水凝膠中加入適當(dāng)量含油基質(zhì)及乳化劑，按常規(guī)方法制成乳劑。
根據(jù)本發(fā)明的再一個(gè)實(shí)施方案，其中可利用上述適當(dāng)?shù)某煞只虺煞纸M合，按常規(guī)方法制成高粘高凝膠劑或軟膏。
根據(jù)本發(fā)明的再一個(gè)實(shí)施方案，其中可以利用上述適當(dāng)?shù)某煞只虺煞纸M合，按常規(guī)方法制成將細(xì)胞生長因子包圍在脂質(zhì)體中的脂質(zhì)體組合物。
根據(jù)本發(fā)明的再一個(gè)實(shí)施方案，其中可以利用上述的適當(dāng)成分或成分組合，按常規(guī)方法制成預(yù)加入或使用前臨時(shí)加入細(xì)胞生長因子多肽的，另外含有一種或多種護(hù)膚劑的護(hù)膚液。
根據(jù)本發(fā)明的這一實(shí)施方案，其中所說的護(hù)膚劑包括但不只限于甘油、透明質(zhì)酸、維生素E、卵磷脂、氨基酸復(fù)合物、天然植物或動(dòng)物提取物及天然蛋白質(zhì)或多糖水解物。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了制備含有細(xì)胞生長因子的含水凝膠型護(hù)膚組合物的方法，該方法包括分別制備從天然來源提取的或以DNA重組技術(shù)生產(chǎn)的細(xì)胞生長因子的冷凍干燥制品，和由水溶性潤濕劑、親水性凝膠劑、活性蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑及其他皮膚外用上可接受的輔助成分組成的含水凝膠基質(zhì)，并在不含破壞細(xì)胞生長因子活性蛋白質(zhì)之生物學(xué)活性的適當(dāng)溫度和pH條件下加入所說的細(xì)胞生長因子并充分混勻之。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中在使用前臨時(shí)將所說的細(xì)胞生長因子的冷凍干燥制劑加入到所說的含水凝膠基質(zhì)中。
本發(fā)明涉及包含細(xì)胞生長因子的含水凝膠型皮膚外用組合物，該組合物由選自成纖維細(xì)胞生長因子、表皮生長因子、胰島素樣生長因子、血小板衍生的生長因子、神經(jīng)生長因子、腦衍生的神經(jīng)生長因子的一種或多種活性多肽及含水凝膠基質(zhì)組成，其中所說的細(xì)胞生長因子可以是在生產(chǎn)所說的皮膚外用組合物時(shí)，在不至于對(duì)生物學(xué)活性多肽造成破壞或使之失活的溫度及pH條件下加入到所說的含水凝膠基質(zhì)中并與之均勻混合；或者也可以分別制備并包裝本發(fā)明護(hù)膚組合物的含水凝膠基質(zhì)和細(xì)胞生長因子的冷凍干燥制劑，使用前臨時(shí)按著規(guī)定的比例將細(xì)胞因子的凍干粉末加入到含水凝膠基質(zhì)中并充分混勻之。
根據(jù)本發(fā)明的含水凝膠皮膚外用組合物，其中細(xì)胞生長因子較好是成纖維細(xì)胞生長因子和/或表皮生長因子，并且最好是成纖維細(xì)胞生長因子-2(FGF-2)。所說的FGF-2可以是由天然來源或以DNA重組技術(shù)制備得到的。
根據(jù)本發(fā)明的皮膚外用組合物，其中作為水凝膠基質(zhì)成分之一的水溶性潤濕劑可以是甘油或其衍生物，例如丙氧基化甘油和乙氧基化甘油，或者可以是丙二醇、乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮，透明質(zhì)酸或其高分子量組分，例如分子量約在30kD以上的透明質(zhì)素(Hyalectin，HAC)。透明質(zhì)酸作為化妝品生產(chǎn)中常用的皮膚保水調(diào)節(jié)劑，由于是從天然來源提取的一組有不均一分子量的混合物，其中分子量小于30kD的組分對(duì)皮膚有較強(qiáng)的致過敏性，所以在本發(fā)明的含水凝膠組合物中優(yōu)選使用由甘油和透明質(zhì)素組成的潤濕劑。實(shí)驗(yàn)表明，該潤濕劑具有極好的吸濕性和釋濕性，即在較高溫度的環(huán)境下其可吸收環(huán)境中的水份，而在較大濕度的環(huán)境下則可以促進(jìn)皮膚釋放水份，從而使局部皮膚保持適當(dāng)?shù)臐穸?，即可以促進(jìn)皮膚的舒適感，又有利于本發(fā)明組合物中的EGF和FGF的充分保留及發(fā)揮其生物學(xué)活性?？梢园凑彰绹鴮＠?,166,331中所述的方法由透明質(zhì)酸制備和純化透明質(zhì)素。
根據(jù)本發(fā)明的含有細(xì)胞生長因子的含水凝膠型護(hù)膚組合物，其中水溶性潤濕劑的含量約占組合物總重量的在約0.1％-40％。較好為1％-30％，最好占5％-20％。
用于本發(fā)明組合物中的含水凝膠劑可以是選自羥甲基纖維素、羥乙基纖維素、甲基纖維素和羥丙基纖維素的纖維素醚、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、膠原蛋白水解物、硅酮樹膠、明膠或黃原膠及其混合物。其他適用的含水凝膠劑是長鏈烷基丙烯酸酯，例如較好是十八烷基丙烯酸甲酯。然而，從有利于保護(hù)本發(fā)明組合物中將要加入的生物學(xué)活性多肽的角度來說，較好是使用以羥丙基纖維素為代表的纖維素醚與膠原蛋白水解物的混合物。本發(fā)明組合物中含水凝膠劑的含量一般約占組合物重量的0.01％-10％，較好為0.1-3％，最好為0.5％-1％。
在制備預(yù)先加有細(xì)胞生長因子的皮膚外用組合物的情況下，本發(fā)明組合物中含水凝膠劑的粘度較好約為400至4000Cps。相反，在制備使用前臨時(shí)添加細(xì)胞生長因子凍干品的皮膚外用組合物的情況下，本發(fā)明組合物中含水凝膠劑粘度較好約為200-1000Cps。
如前所述，由于EGF和FGF等多肽細(xì)胞因子在常溫和水溶液中均相對(duì)不穩(wěn)定，比較容易受到各種環(huán)境因素的影響而變性失活，因此在制備本發(fā)明含有細(xì)胞生長因子的皮膚外用組合物時(shí)，一個(gè)首要的方面是盡可能地保持這些生物學(xué)活性肽在含水介質(zhì)中的穩(wěn)定性，延長其活性維持時(shí)間。為此目的，我們使用本實(shí)驗(yàn)室以DNA重組技術(shù)制備的具有人成纖維細(xì)胞生長因子活性的多肽和其結(jié)構(gòu)類似物作為本發(fā)明皮膚外用組合物的基本活性物質(zhì)，并利用加在含水凝膠基質(zhì)中的各種不同的蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑進(jìn)行了大量實(shí)驗(yàn)研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，特別是以本實(shí)驗(yàn)室制備的人重組FGF或其結(jié)構(gòu)類似物(rhFGF-Arg78，Arg96.即FGF-2m)作為活性成分的情況下，在本發(fā)明的凝膠基質(zhì)(甘油加CMC的0.9％NaCl溶液)中加入選自聚乙二醇、羥丙基纖維素、硫酸多糖及谷胱甘肽的一種或多種物質(zhì)作為穩(wěn)定劑，可以使該護(hù)膚組合物中rhFGF-2或rhFGF-2m在室溫保存6個(gè)月的穩(wěn)定性提高近10％(見實(shí)驗(yàn)實(shí)施例)。其中所說的適于用作穩(wěn)定劑的硫酸多糖類物質(zhì)包括聚乙二醇400、角叉聚糖、肝素、硫酸肝素、硫酸葡聚糖、多硫酸戊聚糖、硫酸甘露聚糖、硫酸環(huán)糊精、羥甲基殼多糖、蔗糖八硫酸酯的鹽、多聚甘氨酸和三甲基甘氨酸。
可以按照本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)方法制備上述含水凝膠護(hù)膚組合物。
雖然本發(fā)明的一個(gè)目的主要是涉及含有FGF和/或EGF及可能加入的其他細(xì)胞生長因子的含水凝膠組合物，但本發(fā)明并不只限于含水凝膠劑型的組合物。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解到在低凝膠劑含量的、低粘度的含水介質(zhì)中加入適當(dāng)量的常規(guī)脂類潤膚材料，例如甘油酯、植物或礦物油、鏈烯基酯、乙氧基化脂醇、并加入適當(dāng)?shù)娜榛瘎┗蚓哂腥榛δ艿牧字蚋男跃酆衔?，例如非離子聚丙烯酰胺，可以將本發(fā)明的組合物制成乳劑或脂質(zhì)體組合物。
乳劑，特別是水包油型乳劑是迄今將功能性護(hù)膚制劑用于皮膚的最為普遍使用的系統(tǒng)。因此，可以使用常規(guī)方法將本發(fā)明的組合物制成乳劑。為了有利于包含在乳劑水相中活性多肽的分散和吸收，較好使用礦物油，例如硅酮油作為油相，使用溶解有聚乙二醇和聚丙烯纖維素的等滲氯化鈉溶液作為水相，并使用(C10-22)烷基丙烯酸酯，例如丙烯酸月桂酯或丙烯酸硬脂酸酯作為主乳化劑和表面活性劑。另外，還可以使用適當(dāng)?shù)膲A中和劑或檸檬酸鹽緩沖液將所得乳劑的pH值維持在大約中性或偏堿性的范圍內(nèi)。
可在制備乳液之前向上述基質(zhì)材料內(nèi)加入FGF-2和或EGF多肽，以及活性多肽保護(hù)劑或穩(wěn)定劑，必要時(shí)加入pH調(diào)節(jié)劑。或者也可以在制成乳劑之后，于使用前加入活性多肽及其穩(wěn)定劑或保護(hù)劑，并在與上述基質(zhì)混勻后涂敷于皮膚表面。
適用的乳化劑可以是選自長鏈飽和或不飽和脂肪酸的一、二或三甘油酯、飽和或不飽和脂肪酸的脫水山梨醇酯的親脂乳化劑；選自磷脂酰甘油二?；?、磷脂酰膽堿二?；?、卵磷脂、磷脂酰膽堿二肉豆蔻酸酯、磷脂酰甘油二肉豆蔻酸酯的磷脂；以及選自聚氧乙烯脫水山梨醇的單硬脂酸酯、單油酸酯的兩性離子型乳化劑。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案，還可以按本領(lǐng)域已知的薄層水合、反相蒸發(fā)(例如參見Szoka，F(xiàn).et al.，Proc.Natl.Acad.Sci，USA，754194-4197，1978)、及溶劑注射方法，將本發(fā)明的組合物制成FGF-2/或EGF/脂質(zhì)體的高粘度凝膠或膏狀皮膚外用組合物。在本發(fā)明的FGF-2/脂質(zhì)體中，中性磷脂和帶負(fù)電荷磷脂的含量分別約占總重量的20-50％。所使用的中性磷脂可以選自用已知方法從天然來源分離的或化學(xué)合成的磷脂，例如可以是由卵黃中提取的磷脂酰甘油酯或磷脂酰肌醇酯。另外，在脂質(zhì)成分中可加入膽固醇，借以提高脂質(zhì)體雙層的穩(wěn)定性，從而在實(shí)質(zhì)上延長體外(或體內(nèi))釋放的FGF和/或EGF的半壽期。再者，在該脂質(zhì)體組合物中還可以含有其他用于提高脂質(zhì)體穩(wěn)定性并對(duì)活性多肽的穩(wěn)定性和釋放特征有利的成分，例如α-生育酚或聚乙氧基化的α-生育酚。
為了制備本發(fā)明的FGF-2/脂質(zhì)體凝膠組合物，可以將囊泡生成脂溶解于適當(dāng)?shù)挠袡C(jī)溶劑中，并在真空下干燥以形成薄的脂質(zhì)膜。然后在強(qiáng)烈攪拌下使該膜水合約30分鐘，以得到囊泡。將此囊泡分散于前述凝膠基質(zhì)中，以使FGF-2脂質(zhì)體約占組合物總重量的5-20％。上述囊泡形成脂的水合作用較好在含兩性離子化合物的低導(dǎo)電性含水介質(zhì)中進(jìn)行。如此得到的脂質(zhì)體含水凝膠組合物是凝膠狀的，并且具有相對(duì)低的脂質(zhì)濃度。
另外，也可以首先將并不處于等電點(diǎn)的兩性電解質(zhì)化合物加入到脂質(zhì)膜中以形成脂質(zhì)體，然后將含水介質(zhì)的pH調(diào)到該介質(zhì)的等電點(diǎn)以達(dá)到所需的凝膠狀態(tài)。制備中可將FGF-2以適當(dāng)?shù)臐舛热芙庥谟脕硇纬芍|(zhì)體組合物的含水介質(zhì)中。以這種方式制成的懸液包括微囊化包裹的、脂質(zhì)體吸附的、以及游離的FGF-2或FGF-2m。如上所述，可在脂質(zhì)體制成后將FGF-2加入已形成的脂質(zhì)體內(nèi)，以產(chǎn)生只吸附了FGF-2的FGF-2/脂質(zhì)體組合物。
可以將按上述方法制得的流體的含F(xiàn)GF-2脂質(zhì)體組合物與空的中性脂質(zhì)體混合以制成有較高脂質(zhì)體濃度的膏狀組合物，或者將所說的含F(xiàn)GF-2脂質(zhì)體組合物與前述有較高粘度的含水凝膠組合物混合，以得到有較低脂質(zhì)濃度的膏狀組合物。如此制成的FGF-2/脂質(zhì)體組合物具有大約1000-10000Cps的高粘度。
本發(fā)明提供了含有細(xì)胞生長因子，特別是成纖維細(xì)胞生長因子-2和/或表皮生長因子的皮膚外用組合物，特征在于該組合物內(nèi)含有化妝品上和醫(yī)藥上有效量的FGF-2和/或EGF的蛋白質(zhì)保護(hù)劑或穩(wěn)定劑，并且該組合物可以是含水凝膠或乳劑或脂質(zhì)體組合物形式的。根據(jù)本發(fā)明的組合物，一方面其中活性成分可以維持并保留較大的生物學(xué)活性，并滲入皮膚發(fā)揮其固有的生物學(xué)作用；另一方面該組合物還具有良好的皮膚感覺和殘留特性，以及良好的潤濕性、滲透性和吸收性。
在使用FGF-2，特別是使用本實(shí)驗(yàn)室生產(chǎn)的FGF-2結(jié)構(gòu)類似物(FGF-2m)(參見共同待批專利申請(qǐng)№.96114279.0)作本發(fā)明皮膚外用組合物的活性成分的情況下，由于我們利用定點(diǎn)誘變技術(shù)將FGF-2氨基酸序列三維空間結(jié)構(gòu)中暴露于分子表面的第78和96位半胱氨酸改變成了帶有氨基基團(tuán)的精氨酸而不是絲氨酸，因而更有利于所說的氨基基團(tuán)與可加入組合物中作為保護(hù)劑的聚乙二醇分子中的羥基基團(tuán)形成共價(jià)結(jié)合，借以防止FGF-2分子聚合，從而大大提高了活性蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。另外，由于本發(fā)明皮膚外用組合物主要是不含脂質(zhì)或只含有很少量脂質(zhì)的含水凝膠形式的，所以無論其中含有或不含有透皮吸收劑，均可使所說的活性蛋白質(zhì)在局部得以最大吸收，而且具有在用藥部位延遲釋放的特性。
最后還應(yīng)特別強(qiáng)調(diào)指出的是，雖然為了最大限度地保留細(xì)胞生長因子的生物學(xué)活性，可以將本發(fā)明的護(hù)膚基質(zhì)與細(xì)胞生長因子多肽分開包裝并在使用前臨時(shí)由使用者混合并在規(guī)定時(shí)間期限內(nèi)使用之，但也完全可以在生產(chǎn)過程中在本發(fā)明組合物的基質(zhì)內(nèi)直接混入這些多肽物質(zhì)，而不致于在6個(gè)月內(nèi)使其生物學(xué)活性明顯降低。
以下借助實(shí)施進(jìn)一步舉例描述本發(fā)明，但這些實(shí)施例并不是以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)驗(yàn)實(shí)施例本實(shí)施例中，使用培養(yǎng)的小鼠成纖維細(xì)胞作為靶細(xì)胞，以3H-胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)摻入法檢測(cè)在本發(fā)明的皮膚外用組合物內(nèi)加入硫酸肝素或硫酸葡聚糖和聚乙二醇對(duì)基質(zhì)中所含hbFGF-2m之生物學(xué)活性的影響。
1.樣品的制備和儲(chǔ)存按照實(shí)施例1中所述的配方和配制方法制備用于本實(shí)驗(yàn)的含水凝膠基質(zhì)。將這些基質(zhì)以每管4ml的量分別加于4組12個(gè)無菌試管(20ml容積)內(nèi)。第1組凝膠加入10mM(1ml)PBS作為陰性對(duì)照；第2組加入0.1ug/ml的硫酸葡聚糖溶液；第3組加1ug/ml硫酸肝素和0.2ug/ml的聚乙二醇(各0.5ml)；第4組加入溶于10mM PBS(1ml)的1ug/ml羥丙基纖維素得到有較高粘度的凝膠基質(zhì)。然后分別以1ug/ml的較大劑量在上述2、3、4組樣品內(nèi)加入hFGF-2m。使用加有同樣量hFGF-2m但未加穩(wěn)定劑的凝膠基質(zhì)(同第1組的較低粘度凝膠基質(zhì))作為陽性對(duì)照，并定為第5組。配制完成后將上述所有樣品裝在帶蓋的無菌玻璃瓶內(nèi)置于常溫(20-25℃)下放置6個(gè)月備用。
2.靶細(xì)胞的制備及檢測(cè)簡單地說，首先將大約106個(gè)BALB/c3T3細(xì)胞(由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所提供)接種于3ml含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中。于37℃在5％CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)24小時(shí)后，用新鮮DMEM培養(yǎng)基稀釋培養(yǎng)物，使血清的終濃度變?yōu)?％。繼續(xù)培養(yǎng)2天后，向培養(yǎng)物內(nèi)加入如上制備并儲(chǔ)存6個(gè)月的試驗(yàn)樣品和對(duì)照樣品(2ml/105個(gè)細(xì)胞)。并加入3H-TdR(終濃度為2uCi/ml)。37℃繼續(xù)保溫24小時(shí)后，用冷生理鹽水洗細(xì)胞3次。離心后向細(xì)胞沉淀物內(nèi)加入10％三氯乙酸以沉淀蛋白質(zhì)。再次用生理鹽水洗2次，并加入乙醇-乙醚洗一次。用甲酸消化沉淀物后取0.1ml加于4ml閃爍瓶內(nèi)測(cè)定放射計(jì)數(shù)。
按下列公式計(jì)算FGF-2m對(duì)3T3細(xì)胞DNA合成的刺激指數(shù)并得到如表1所示的結(jié)果。表中所示數(shù)據(jù)代表三次測(cè)定的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。
表1FGF在含水凝膠組合物中的穩(wěn)定性組別處理細(xì)胞3H-TdR摻入量(CPM) 刺激指數(shù) p值1 陰性對(duì)照(無FGF)16,065 1.00-2 凝膠+肝素+FGF 24,576 1.52 ＜0.053 凝膠+肝素+ 25,387 1.58 ＜0.05聚乙二醇+FGF4 高粘度凝膠+FGF 23,875 1.48 ＜0.055 凝膠+FGF 23,064 1.43 ＜0.05(陽性對(duì)照)從上表所示的結(jié)果可以看出，本發(fā)明護(hù)膚組合物中具有成纖維細(xì)胞生長刺激活性的多肽(FGF-2m)，在含水凝膠基質(zhì)中于常溫下儲(chǔ)存6個(gè)月后仍然保留有較高的生物學(xué)活性。另外，在本發(fā)明的組合物中加入聚乙二醇400、聚丙烯纖維素及硫酸多糖等具有FGF-2穩(wěn)定化功能的物質(zhì)，可以有效地保護(hù)該多肽的生物學(xué)活性。在本實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)中，與未加穩(wěn)定劑或保護(hù)劑的樣品相比，加入這些穩(wěn)定劑可使蛋白質(zhì)活性高出大約11％。
實(shí)施例1含有FGF-2m的含水凝膠及其制備使用常規(guī)混合技術(shù)混合下列(A)含水凝膠基質(zhì)，和(B)含F(xiàn)GF-2及其穩(wěn)定劑的水溶液成 分重量百分比A. 甘油20.0聚乙二醇400 2.0羥丙基纖維素2.0對(duì)羥基苯甲酸甲酯0.2聚甲基丙烯甘油酯0.6B. 重組FGF-2 10ppm葡聚糖硫酸酯0.05透明質(zhì)素0.05蒸餾水加至100.0將上述原料A于55℃溶解并充分混合后，冷卻到40℃，加入原料B的水溶液并用攪伴器進(jìn)一步混合均勻，然后加入適當(dāng)量的0.1M NaOH溶液將所得凝膠的pH調(diào)到在約6.5。如此制得的含水凝膠具有較小粘度，可以借助穩(wěn)定劑有效地維持FGF-2m的生物學(xué)活性。另外，該凝膠施用于皮膚表面時(shí)具有良好的皮膚感覺，并有極好的潤濕性和滲透性。
實(shí)施例2水溶液基質(zhì)的制備和使用使用常規(guī)混合技術(shù)混合下列組分，以制備用作潤膚液的水溶液基質(zhì)成 分重量百分比甘油 20.0硫酸葡聚糖 0.02生理鹽水 加至100.0將如此混合制得的水溶液單獨(dú)保存，使用時(shí)由使用者抽取小量(2ml)該水溶液用以溶解置于另一無菌容器內(nèi)的FGF-2的冷干粉未，待充分溶解后重新注入所說的水溶液內(nèi)充分混勻并按照規(guī)定的劑量盡快使用。實(shí)施例3含有FGF-2的水包油型乳劑及基質(zhì)制備使用常規(guī)混合乳化技術(shù)制備含下列成分的乳劑組合物成分重量百分比A. 聚氧乙烯 (20)脫水山梨醇單硬脂酸酯 2.0氫化羊毛脂 5.0角鯊烯 10.0蜂蠟 4.0甘油10.0硅酮油 0.5維生素E 0.1丙二醇 2.0聚乙二醇 0.5B. FGF-2 5ppm硫酸肝素 0.1透明質(zhì)酸鈉 0.05蒸餾水 加至100.0將油相基質(zhì)原料A加熱至75℃融化，混勻并冷卻到40℃后加入水相B溶液，然后充分?jǐn)嚢璨⒗鋮s至室溫。如此制得的乳液具有良好的穩(wěn)定性，并且在與皮膚接觸后迅速破乳并可促使含在水相中的FGF-2盡快滲入皮膚。另外該乳劑還具有良好的保水性能和除污作用。
實(shí)施例4含有FGF-2的水包油型乳劑及其制備使用常規(guī)混合乳化技術(shù)制備含下列成分的乳劑組合物成分 重量百分比A. 卵磷脂 4.0硬脂酸單甘油酯 3.0羊毛脂醇 3.0乙二胺四乙酸二鈉 0.05甘油 3.0羧甲基纖維素 0.2肉豆蔻酸異丙酯 5.0對(duì)羥基苯甲酸甲酯 0.1
檸檬酸鹽緩沖液適量B. FGF-25ppm硫酸氨基葡聚糖0.1維生素C 0.01蒸餾水 加至100.0將原料A置于80℃下融化，攪伴混合并冷卻至50℃。然后進(jìn)一步用超聲波乳化器乳化，同時(shí)加入原料B的水溶液，得到均勻的霜膏樣制劑。該制劑有較高粘度，在肝素等保護(hù)劑存在下更有利于維持FGF-2的生物學(xué)活性。
實(shí)施例5含有FGF-2的脂質(zhì)體組合物的制備用含有卵黃磷酯酰膽堿/卵黃磷酯酰甘油/膽固醇/α-生育酚(1∶1∶0.5∶0.02重量比)的脫水脂質(zhì)混合物，以常規(guī)薄層水合法制備脂質(zhì)體。首先，將脂類原料溶解于氯仿/甲醇(2∶1重量比)中，并將所得溶液倒入園底燒瓶內(nèi)。真空干燥后形成薄層脂質(zhì)膜。向該膜上倒入10倍體積/重量的2.5％(重量/體積)甘氨酸(一種兩性離子化合物)的水合緩沖液。渦流攪拌下水合1.5小時(shí)后得到凝膠樣的脂質(zhì)體材料。可以使用除菌裝置、過濾除菌的脂質(zhì)和含水溶液，在無菌室內(nèi)制備該脂質(zhì)體囊泡材料，以盡可能地減少微生物污染。使用Brookfield DV-II粘度計(jì)，在加入0.1％NaCL(重量)后測(cè)得該脂質(zhì)體組合物的平均粘度為1.5×103Cps。
其中用于形成脂質(zhì)體組合物的含水介質(zhì)(上述緩沖液)內(nèi)所含F(xiàn)GF-2的濃度可根據(jù)使用目的及凝膠涂敷部位而定，一般約占總組合物的0.1-100ppm?？稍诩尤隖GF-2的同時(shí)一并加入選自聚乙二醇、羥丙基纖維素和硫酸多糖的保護(hù)劑或穩(wěn)定劑。所形成的脂質(zhì)體懸液中可包含被包裹的、被吸附的以及游離的FGF-2。也可以在脂質(zhì)體形成后以適當(dāng)?shù)臐舛燃尤隖GF-2。
如此得到的脂質(zhì)體制劑可以單獨(dú)使用，也可以在與實(shí)施例1制得的凝膠基質(zhì)按適當(dāng)比例混合后使用。該制劑可進(jìn)一步有效地保持FGF-2的生物學(xué)活性，并可以達(dá)到在局部延緩釋放活性多肽的目的。
權(quán)利要求
1.含有細(xì)胞生長因子的皮膚外用組合物，該組合物含有至少一種細(xì)胞生長因子多肽，至少一種所說多肽的穩(wěn)定劑，以及皮膚外用上可接受的基質(zhì)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的組合物，其中所說的細(xì)胞生長因子多肽選自成纖維細(xì)胞生長因子、表皮細(xì)胞生長因子、胰島素樣生長因子、血小板衍生的生長因子、以及神經(jīng)生長因子和腦衍生的神經(jīng)生長因子多肽。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的組合物，其中所說的細(xì)胞生長因子多肽是成纖維細(xì)胞生長因子-2和表皮細(xì)胞生長因子。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任何一項(xiàng)的組合物，其中所說的細(xì)胞生長因子多肽是從天然來源提取的或以DNA重組技術(shù)產(chǎn)生的。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任何一項(xiàng)的組合物，其中所說的細(xì)胞生長因子多肽的穩(wěn)定劑選自聚乙二醇、聚丙烯醇、甲基纖維素、羥丙基纖維素、羧甲基纖維素、肝素、硫酸肝素、硫酸氨基葡聚糖、硫酸皮膚素、羥甲基氨基多糖、多硫酸戊糖、硫酸甘露聚糖、硫酸葡聚糖、角叉聚糖、硫酸環(huán)糊精、羥甲基殼多糖、透明質(zhì)素、透明質(zhì)酸、蔗糖八硫酸酯、多聚甘氨酸、三甲基甘氨酸和谷胱甘肽及半酰氨酸。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的組合物，其中所說的基質(zhì)是含水凝膠基質(zhì)。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的組合物，其中所說的含水凝膠基質(zhì)含有水溶液性潤濕劑、親水凝膠劑和pH調(diào)節(jié)劑。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的組合物，其中所說的水溶性潤濕劑選自甘油、甘油二醇、丙二醇、1，3-丁二醇、透明質(zhì)酸及其鈉鹽或其交聯(lián)酯或由之分離的大分子透明質(zhì)素，或脫乙酰殼多糖；并且其中所說的親水凝膠劑選自羥甲基纖維素、羥丙基纖維素、甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷硐、明膠、黃原膠、硅酮樹膠、瓜耳樹膠和海藻酸及其鈉鹽。
9.根據(jù)權(quán)利要求1的組合物，其中所說的基質(zhì)是含有一種或多種潤膚劑及多肽穩(wěn)定劑的水溶液。
10.根據(jù)權(quán)利要求1的組合物，其中所說的基質(zhì)是水包油型或油包水型乳劑。
11.根據(jù)權(quán)利要求1的組合物，其中所說的基質(zhì)是脂質(zhì)體或其組合物。
12.根據(jù)權(quán)利要求1或6至11中任何一項(xiàng)的組合物，其中所說的細(xì)胞生長因子多肽是在制備所說的基質(zhì)的同時(shí)加入的，或者是以其凍干形成單獨(dú)放置并在使用之前臨時(shí)加入的。
13.根據(jù)權(quán)利要求6至11中任何一項(xiàng)的組合物，其中所說的細(xì)胞生長因子是成纖維細(xì)胞生長因子-2和/或表皮生長因子。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的組合物，其中所說的成纖維細(xì)胞生長因子和/或表皮生長因子在所說組合物中的含量約為1-100ppm。
15.根據(jù)權(quán)利要求1至11中任何一項(xiàng)的組合物，所說的基質(zhì)中還含有一種或多種皮膚通透劑。
16.根據(jù)權(quán)利要求1至11中任何一項(xiàng)的組合物，所說的基質(zhì)中還含有一種或多種維生素。
17.根據(jù)權(quán)利要求1至11中任何一項(xiàng)的組合物，所說的基質(zhì)中還有一種或多種抗氧化劑。
18.根據(jù)權(quán)利要求1至11中任何一項(xiàng)組合物，其中所說的基質(zhì)中還含有一種或多種自由基清除劑。
全文摘要
本發(fā)明提供了含有細(xì)胞生長因子，特別是成纖維細(xì)胞生長因子-2和/或表皮生長因子的皮膚外用組合物，特征在于該組合物內(nèi)含有化妝品上或醫(yī)藥上有效的成纖維細(xì)胞生長因子-2和/或表皮生長因子的蛋白質(zhì)保護(hù)劑或穩(wěn)定劑，并且該組合物可以是含水凝膠或水溶液或乳劑或脂質(zhì)體形式的。根據(jù)本發(fā)明的皮膚外用組合物，一方面其中的活性成分可以維持并保留最大的生物學(xué)活性，并滲入皮膚發(fā)揮其固有的生物學(xué)效應(yīng)，另一方面該組合物還具有良好的皮膚感覺和殘留特性，以及良好的潤濕性、滲透性和吸收性。
文檔編號(hào)A61K38/18GK1160582SQ9611428
公開日1997年10月1日 申請(qǐng)日期1996年12月27日 優(yōu)先權(quán)日1996年12月27日
發(fā)明者林劍, 李校坤 申請(qǐng)人:暨南大學(xué)生物工程研究所