專利名稱：苯并異硒唑衍生物的免疫調(diào)節(jié)和生物治療作用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一類能夠增強(qiáng)人體內(nèi)細(xì)胞免疫系統(tǒng)NK細(xì)胞和LAK細(xì)胞活性的苯并異硒唑衍生物的應(yīng)用。本發(fā)明還涉及包含該苯并異硒唑衍生物及其組合物作為免疫調(diào)節(jié)和生物治療的藥物、藥物應(yīng)用的技術(shù)方案、實(shí)施領(lǐng)域以及相關(guān)治療時(shí)的藥物組合物；以及該衍生物在制備具有免疫調(diào)節(jié)或生物調(diào)節(jié)功能的保健組合物所形成的技術(shù)方案和應(yīng)用方法。
背景技術(shù)：
生物治療技術(shù)或生物調(diào)節(jié)療法是與本發(fā)明申請(qǐng)所涉及的化合物有重要關(guān)系的背景技術(shù)。生物治療技術(shù)是近年來發(fā)展迅猛，與化療和放療相對(duì)應(yīng)的生物醫(yī)藥技術(shù)。主要的生物治療技術(shù)有細(xì)胞因子(素)療法、免疫細(xì)胞療法和基因療法。用于生物治療技術(shù)的物質(zhì)統(tǒng)稱生物學(xué)反應(yīng)調(diào)節(jié)劑，包括細(xì)胞調(diào)節(jié)因子或細(xì)胞素(干擾素、白細(xì)胞介素等)、細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)劑(生物應(yīng)答調(diào)節(jié)劑)等。
生物學(xué)反應(yīng)調(diào)節(jié)劑可以調(diào)整機(jī)體內(nèi)部的自身潛力以增強(qiáng)對(duì)腫瘤、感染一類病灶的生物學(xué)反應(yīng)。例如白細(xì)胞介素2(IL-2)可促進(jìn)B細(xì)胞、自然殺傷(NK)細(xì)胞、淋巴因子激活的殺傷(LAK)細(xì)胞的分化增殖，在免疫缺陷病和自身免疫性疾病的治療和診斷以及抗惡性腫瘤方面有重要意義。
免疫增強(qiáng)劑是一種全新的生物學(xué)反應(yīng)調(diào)節(jié)劑，也稱作免疫調(diào)節(jié)藥，在機(jī)體免疫系統(tǒng)中起著非常重要的調(diào)控作用，能使過高的或過低的免疫功能調(diào)節(jié)到正常水平。臨床與實(shí)驗(yàn)免疫學(xué)研究表明，腫瘤、感染、變態(tài)反應(yīng)性疾病、自身免疫病、以及獲得性免疫缺陷綜合癥(AIDS)等均伴有免疫損傷。免疫調(diào)節(jié)在上述相關(guān)治療中起重要的作用，具有非常廣闊的應(yīng)用前景。特別是近年來腫瘤免疫學(xué)迅速發(fā)展，腫瘤生物學(xué)反應(yīng)調(diào)節(jié)劑(Biological Rer Spense Modifier BRSM)療法已進(jìn)入了一個(gè)新階段。
除此以外，目前報(bào)導(dǎo)的其他疾病，如發(fā)病率極高的病毒性肝炎、危害極大的AIDS等，使用或聯(lián)合使用免疫調(diào)節(jié)劑也能使病情顯著改善。
有文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)病毒性肝炎(HBV)感染引起的肝損害與機(jī)體的免疫反應(yīng)密切相關(guān)，其中包括病毒復(fù)制、感染肝細(xì)胞表面抗原性改變以及對(duì)HBV感染細(xì)胞和正常細(xì)胞的細(xì)胞毒免疫反應(yīng)。HBV不能直接殺傷肝細(xì)胞，肝的損害主要通過宿主的免疫反應(yīng)。宿主的免疫反應(yīng)包括了特異性免疫反應(yīng)(抗體和細(xì)胞免疫)和非特異性免疫反應(yīng)(NK細(xì)胞)，它們對(duì)是否造成慢性HBV感染占有重要的地位。
AIDS病人表現(xiàn)免疫功能缺乏，一般為IL-2水平下降，目前增強(qiáng)病人的免疫功能的藥物和措施包括了干擾素和IL-2利用，IL-2由成熟的T細(xì)胞產(chǎn)生，重要的功能之一是提高NK細(xì)胞活性、促進(jìn)T細(xì)胞分化增殖、促進(jìn)B細(xì)胞增殖等，臨床報(bào)導(dǎo)，體外應(yīng)用IL-2 10U/ml，使病人的外周血MΦ分泌IFN-γ和淋巴細(xì)胞表達(dá)IL-2受體明顯增多，可使病人免疫功能得到恢復(fù)。此外免疫誘導(dǎo)劑雙乙硫氨甲雙酯鈉應(yīng)用于臨床，能使42％的病人好轉(zhuǎn)，體重增加，體質(zhì)恢復(fù)；而異丙肌苷能使機(jī)體IL-2升高，改善病人的AIDS病情。
與本發(fā)明申請(qǐng)所涉及化合物的應(yīng)用有重要關(guān)系的免疫細(xì)胞是一些非特異性免疫反應(yīng)細(xì)胞，包括NK細(xì)胞和Lak細(xì)胞，在生物治療技術(shù)中占有重要地位。NK細(xì)胞即自然殺傷細(xì)胞(natural killer cell，NK)，是重要的免疫淋巴細(xì)胞和機(jī)體天然免疫的主要承擔(dān)者。NK細(xì)胞不依賴胸腺、不依賴抗體和補(bǔ)體、無需抗原預(yù)先刺激即能分泌細(xì)胞毒因子，在無抗體參與的情況下，能在體內(nèi)外殺傷腫瘤一類細(xì)胞，是一種廣譜的殺傷細(xì)胞，對(duì)阻止腫瘤生長(zhǎng)起著十分重要的作用。并抗病毒，抗感染，參與免疫調(diào)節(jié)。研究表明NK細(xì)胞在腫瘤免疫中占有重要地位，是機(jī)體抗腫瘤的第一道防線。而LAK細(xì)胞是一種需要淋巴因子IL-2激活的殺傷細(xì)胞，LAK細(xì)胞與NK細(xì)胞具有互補(bǔ)性，能夠殺傷對(duì)NK細(xì)胞所不能殺傷的的腫瘤一類細(xì)胞，比NK細(xì)胞具有更為廣泛的廣譜性，它同樣是現(xiàn)代生物療法最重要的免疫細(xì)胞。
鑒于NK細(xì)胞和LAK細(xì)胞在免疫生物治療中的重要性，因此尋找強(qiáng)有力的NK和LAK細(xì)胞活性增強(qiáng)劑或誘導(dǎo)劑甚為重要。
有關(guān)硒的研究與本發(fā)明申請(qǐng)所涉及的化合物在結(jié)構(gòu)與功能上都有直接的關(guān)系。硒是人體必需的微量元素之一，調(diào)查表明人體中血硒含量長(zhǎng)期低于0.1ppm有可能引起肝壞死、心肌損傷、癌癥和關(guān)節(jié)炎等眾多疾病。硒作為哺乳動(dòng)物(包括人類)生命必需的微量元素地位確立于1957年K.Schwarz和C.M.Foltz對(duì)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)作用的發(fā)現(xiàn)。近二十年來，硒的生物活性研究取得突飛猛進(jìn)的發(fā)展，科學(xué)家們連續(xù)發(fā)現(xiàn)哺乳動(dòng)物體內(nèi)的四種硒酶，包括細(xì)胞谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、磷脂氫過氧化物谷胱甘肽過氧化物酶(PHG-Px)、血漿谷胱甘肽過氧化物酶(P GSH-Px)和I型碘甲狀腺素5’脫碘酶(5’-DI)，此外，還發(fā)現(xiàn)與某些疾病相關(guān)的硒酶—硫氧還蛋白酶等。
硒對(duì)生命科學(xué)的重要性，使得含硒藥物和保健功能品成為眾人矚目的熱點(diǎn)。通常無機(jī)硒不易被吸收，生物活性較低，毒性大；而有機(jī)硒易被肌體吸收，在血液中能能維持較長(zhǎng)時(shí)間，在體內(nèi)易被轉(zhuǎn)化為有活性的代謝中間體，且生物毒性相對(duì)較小。
在本領(lǐng)域的現(xiàn)有技術(shù)中，通過人工的方法可以獲得具有谷胱甘肽過氧化酶GSHPx樣活性作用的化學(xué)模擬物。實(shí)驗(yàn)證明苯并異硒唑酮類化合物(Benzisoselenazolones，BISA)能夠抑制體外微粒體脂質(zhì)過氧化作用，具有保護(hù)機(jī)體免受過氧化作用的損傷功能。其中具有以下化學(xué)式的2-苯基-1，2-苯并異硒唑-3(2)-酮(依布硒啉，Ebselen，)，是目前公認(rèn)的最有前景的GSH-px的模擬物，不僅抗氧化活性高，而且毒性極低(LD50＞6810mg/kg mice)，是迄今為止有機(jī)硒類抗氧化劑的最佳代表，日本第一制藥公司已完成了Ebselen的三期臨床研究。
最近有文章報(bào)道R-雙苯并異硒唑取代化合物具有抗腦心肌炎病毒(EMCV)、皰疹性口炎病毒(VSV)和單純皰疹病毒1型(HSV-1)活性的研究(如Polish J Chem 75，823-830，2001)，但除了上述病毒以外，其它DNA病毒和RNA病毒，特別是肝炎病毒(HBV)和艾滋病病毒(HIV)均未報(bào)導(dǎo)。
已有幾篇專利披露Ebselen衍生物作為藥用的研究，它們分別是中國(guó)專利98124487.4(申請(qǐng)?zhí)?苯并異硒唑酮磺酰胺衍生物在抑制炎癥和過敏性疾病方面的作用；中國(guó)專利01118666.6(申請(qǐng)?zhí)?R-雙或糖苯并異硒唑取代化合物的抗炎、抗腫瘤作用和PCT/CN02/00412(申請(qǐng)?zhí)?具有抗炎、抗腫瘤和抗血栓形成作用的苯并異硒唑衍生物及其應(yīng)用；在免疫調(diào)節(jié)研究方面，盡管有眾多的研究利用Ebselen母核，將其改造成免疫增強(qiáng)化合物，但成功的免疫增強(qiáng)藥物，特別是有關(guān)本發(fā)明申請(qǐng)所涉及的化合物的免疫調(diào)節(jié)研究和生物治療應(yīng)用尚未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是在Ebselen(依布硒啉)抗氧化母核結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上定位改造出免疫調(diào)節(jié)作用強(qiáng)、適應(yīng)性更廣、毒性較低的新型有機(jī)硒生物調(diào)節(jié)劑和免疫增強(qiáng)劑藥物，用于治療各種免疫損傷疾病和免疫調(diào)節(jié)功能依賴或促進(jìn)的相關(guān)疾病，如感染、病毒性肝炎、變態(tài)反應(yīng)性疾病、自身免疫病、獲得性免疫缺陷綜合癥(AIDS)和腫瘤治療等。
本發(fā)明涉及的苯并異硒唑衍生物的藥物與保健功能品設(shè)計(jì)思路，是在充分考慮保留Ebselen活性核的基礎(chǔ)上，增加新功能基團(tuán)，定位設(shè)計(jì)的一系列化合物。由于結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)在生物體內(nèi)具有多種生物活性，尤其具有“生物應(yīng)答調(diào)節(jié)劑”(生物學(xué)反應(yīng)調(diào)節(jié)劑)的特點(diǎn)，以生物應(yīng)答器中的調(diào)節(jié)點(diǎn)為靶標(biāo)，定向產(chǎn)生作用，是一類新型的具有全面調(diào)節(jié)機(jī)體、多作用靶點(diǎn)的活性化合物，特別對(duì)NK細(xì)胞和LAK細(xì)胞等免疫細(xì)胞的激活作用，增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能，顯示其抗炎、抗腫瘤和其他免疫損傷疾病作用，具有較好的治療藥物應(yīng)用前景。
本發(fā)明的內(nèi)容包括1、本發(fā)明化合物提供以下通式(I)、(II)或(III)的苯并異硒唑衍生物及其藥物學(xué)上可接受的鹽
其中R是C1-6亞烷基、亞苯基、亞聯(lián)苯基、亞三苯基、或者 其中M是Pt、Pd或Rh，R′是糖殘基或者 其中R″為Cl、H2O、OH、Br、或者I，R為-H、-CH2C6H5OH、-CH2OH、-CH2CONH2、-CH2CH2COOH -CH2(CH2)4NH2、-CH2COOH、-CH2CH2CONH2、-(CH2)3CH、-(CH2)3NHC(NH)NH2、-(CH2)3CHCH2、-CH3、-CH2CH3、-CH2C6H5、-CH2SH、或者-CH2CH2SCH3.
R″″為-H、-CH2C6H5OH、-CH2OH、-CH2CONH2、-CH2CH2COOH -CH2(CH2)4NH2、-CH2COOH、-CH2CH2CONH2、-(CH2)3CH、-(CH2)3NHC(NH)NH2、-(CH2)3CHCH2、-CH3、-CH2CH3、-CH2C6H5、-CH2SH、或者-CH2CH2SCH3。
在本實(shí)施方案中，R優(yōu)選為C1-4亞烷基、亞苯基、亞聯(lián)苯基，更優(yōu)選為亞丁基和亞聯(lián)苯基。
R′優(yōu)選為1，3，4，6-四-O-乙?；?2-去氧-D-吡喃葡萄糖基。
R和R″″優(yōu)選分別獨(dú)立地為-H、-CH3、-CH2CH3、-CH2C6H5、-CH2SH、或-CH2CH2SCH3。
2、本發(fā)明提供包含上述通式(I)、(II)或(III)的苯并異硒唑衍生物，或其藥物學(xué)上可接受的鹽的藥物組合物以及藥物學(xué)上可接受的賦形劑和載體，或其衛(wèi)生學(xué)上可接受的鹽的保健功能組合物以及衛(wèi)生學(xué)上可接受的賦形劑和載體，3、本發(fā)明提供上述通式(I)、(II)或(III)的苯并異硒唑衍生物，或其藥物學(xué)上可接受的鹽在制備用于對(duì)NK細(xì)胞和LAK細(xì)胞等免疫細(xì)胞調(diào)節(jié)(增強(qiáng))藥物中的應(yīng)用，或其衛(wèi)生學(xué)上可接受的鹽在制備用于具有免疫調(diào)節(jié)功能的保健品中的應(yīng)用，顯示其在生物治療和生物保健調(diào)節(jié)方面的應(yīng)用前景。
4、本發(fā)明的衍生物或其藥物學(xué)上可接受的鹽可以純化合物形式或適宜的藥物組合物進(jìn)行給藥，可采用任何可接受的給藥方式或用于類似用途的試劑進(jìn)行。
采用的給藥形式為固體、半固體、凍干粉或液體藥劑形式給藥，例如，片劑、栓劑、丸劑、軟和硬明膠膠囊劑、散劑、溶液劑、混懸劑或氣霧劑等，優(yōu)選采用適用于精確劑量的簡(jiǎn)單給藥的單元?jiǎng)┝啃问?；組合物可包含常規(guī)藥用載體、賦形劑和作為活性成分(一種或多種)的本發(fā)明的結(jié)合物，此外，還可包含其它藥劑和輔劑等；采用液體形式給藥的藥物組合物可通過溶解、分散等手段將本發(fā)明的結(jié)合物(約0.5至約20％)和選擇性的藥用輔劑溶解、分散于載體中，載體的實(shí)例為水、鹽水、含水葡萄糖、甘油、乙醇等，從而形成溶液劑或混懸劑。
采用的給藥方式，可選擇通過口、鼻內(nèi)、直腸、透皮、注射給藥和脂質(zhì)體類靶向給藥方式等，優(yōu)選的給藥途徑是注射給藥，采用常規(guī)日劑量方案，該方案可根據(jù)疾病的嚴(yán)重程度進(jìn)行調(diào)整。本發(fā)明的結(jié)合物或其藥學(xué)上可接受的鹽也可配制成注射用劑，例如使用約0.5至約50％的活性成分分散于可采用液體形式給藥的藥用輔劑中，實(shí)例為水、鹽水、含水葡萄糖、甘油、乙醇等，從而形成溶液劑或混懸劑；通常，根據(jù)所需給藥方式，藥學(xué)上可接受的組合物包含本發(fā)明涉及的結(jié)合物約1至99重量％、以及99至1重量％的適宜的藥用賦形劑。優(yōu)選組合物包含約5至75重量％的本發(fā)明結(jié)合物，其余為適宜的藥用賦形劑。
如果需要的話，本發(fā)明的藥物組合物還可包含少量的輔助物質(zhì)，如潤(rùn)濕劑或乳化劑、pH緩沖劑、抗氧化劑等，例如檸檬酸、脫水山梨醇單月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯、丁基化羥基甲苯等。
該類劑型的實(shí)際制備方法是本領(lǐng)域的技術(shù)人員公知的或者顯而易見的，例如可參見Remington′s Pharmaceutical Sciences，第18版，(MackPublishing Company，Easton，Pennsylvania，1990)。無論如何，按照本發(fā)明的技術(shù)，所使用的組合物將含有治療有效量的本發(fā)明結(jié)合物，以用于治療相應(yīng)的免疫缺陷病和自身免疫性疾病的診斷、治療以及抗腫瘤方面疾病。
5、本發(fā)明的衍生物或其衛(wèi)生學(xué)上可接受的鹽可以純化合物保健品形式或適宜的保健組合物進(jìn)行口服用，可采用任何可接受的服用方式進(jìn)行。
采用的口服用形式為固體、半固體、凍干粉或液體形式，例如片劑、丸劑、軟和硬明膠膠囊劑、散劑、溶液劑、混懸劑等，優(yōu)選采用適用于精確劑量的簡(jiǎn)單給藥的單元?jiǎng)┝啃问?；組合物可包含常規(guī)使用的載體、食用賦形劑和作為活性成分(一種或多種)的本發(fā)明的結(jié)合物，此外，還可包含其它保健成分和需要的添加劑和輔劑等；采用液體形式服用的組合物可通過溶解、分散等手段將本發(fā)明的結(jié)合物(約0.5至約20％)和選擇性的輔劑溶解、分散于載體中，載體的實(shí)例為水、食用乙醇等，從而形成溶液劑或混懸劑。
通常，根據(jù)所需口服用形式，衛(wèi)生學(xué)上可接受的組合物將包含本發(fā)明涉及的結(jié)合物約1至99重量％、以及99至1重量％的適宜的食用賦形劑和添加劑。優(yōu)選組合物包含約5至75重量％的本發(fā)明結(jié)合物，其余為適宜的食用賦形劑和添加劑。
本發(fā)明組合物中使用的食品添加劑包括乳化劑、抗氧化劑、防腐劑等。
該類劑型的實(shí)際制備方法是本領(lǐng)域的技術(shù)人員公知的或者顯而易見的。無論如何，按照本發(fā)明的技術(shù)，所使用的組合物將含有保健有效量的本發(fā)明結(jié)合物，以用于人體免疫調(diào)節(jié)的保健。
6、本發(fā)明提供人和哺乳動(dòng)物中治療相應(yīng)的各種免疫損傷疾病和免疫調(diào)節(jié)功能依賴或促進(jìn)的相關(guān)疾病，如感染、病毒性肝炎、變態(tài)反應(yīng)性疾病、自身免疫病、獲得性免疫缺陷綜合癥(AIDS)和腫瘤治療等的方法，包括向需要此等治療的患者給予有效量的上述通式(I)或(II)的苯并異硒唑衍生物或其藥物學(xué)上可接受的鹽以及聯(lián)合給予其他治療藥物或免疫調(diào)節(jié)藥物。
7、在本發(fā)明的苯并異硒唑衍生物與其他治療藥物或免疫細(xì)胞增強(qiáng)藥物聯(lián)合使用時(shí)，可同時(shí)或者順序地給藥這兩種藥物，包括先給藥本發(fā)明的苯并異硒唑衍生物，然后再給藥其他的治療藥物或免疫細(xì)胞增強(qiáng)藥物，以及先給藥其他的治療藥物或免疫細(xì)胞增強(qiáng)藥物，然后再給藥本發(fā)明的苯并異硒唑衍生物。
8、本發(fā)明的苯并異硒唑衍生物在治療相應(yīng)的各種免疫損傷疾病和免疫調(diào)節(jié)功能依賴或促進(jìn)的相關(guān)疾病，如感染、病毒性肝炎、變態(tài)反應(yīng)性疾病、自身免疫病、獲得性免疫缺陷綜合癥(AIDS)和腫瘤治療時(shí)，其給藥劑量為約0.05-250mg/kg體重。在與其他的治療藥物或免疫細(xì)胞增強(qiáng)藥物聯(lián)合使用時(shí)，本發(fā)明的衍生物以及相應(yīng)的其他藥物的給藥劑量都可顯著降低，約為單獨(dú)使用時(shí)的十分之一到二分之一。
在下面的實(shí)施例中進(jìn)一步描述了本發(fā)明，藥物以1，2-二{(1，2)-苯并異硒唑-3(2H)-酮}-乙烷(或丁烷)為例，這并不限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施方式實(shí)施例1藥物對(duì)BALB/C正常鼠的免疫調(diào)節(jié)作用研究動(dòng)物分組和給藥方式BALB/C鼠隨機(jī)分為4組，實(shí)驗(yàn)藥物組20只動(dòng)物，腹腔注射新鮮配置的藥物，10只劑量為25.0mg/kg，另外10只劑量為12.5mg/kg，每天1次，連續(xù)給藥7天；陽性對(duì)照組10只動(dòng)物，腹腔注射陽性對(duì)照藥物ddp，劑量為2.0mg/kg，每天給藥一次，連續(xù)7天。對(duì)照組10只，腹腔注射溶劑，體積根據(jù)體重調(diào)整，與藥物組相同。每天注射1次，連續(xù)7天。
以上各組小鼠經(jīng)連續(xù)給藥，在停藥后第3天引頸處死，無菌取脾，稱濕重，加入2ml培養(yǎng)液將脾剪碎，用150目細(xì)胞篩過濾，加入2ml培養(yǎng)液，制成單細(xì)胞懸液，用淋巴細(xì)胞分離液分離單個(gè)核細(xì)胞，其中主要為淋巴細(xì)胞。用1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為2×106/ml作為NK細(xì)胞活性測(cè)定的效應(yīng)細(xì)胞，0.2％臺(tái)盼藍(lán)染色，細(xì)胞存活率大于95％.
MTT法測(cè)脾細(xì)胞增殖活性用淋巴細(xì)胞分離液分離單個(gè)核細(xì)胞，調(diào)整濃度為3×106/ml。取96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔加入細(xì)胞懸液100μl，10mg/ml的ConA溶液100μl，每個(gè)樣品設(shè)6個(gè)復(fù)孔，另設(shè)3個(gè)空白對(duì)照孔，每孔加入培養(yǎng)液200μl，輕搖混勻，37。C培養(yǎng)箱培養(yǎng)72小時(shí)，培養(yǎng)結(jié)束前4小時(shí)每孔吸出培養(yǎng)上清，加人5mg/ml的MTT20μl，繼續(xù)培養(yǎng)；培養(yǎng)結(jié)束時(shí)3000rpm離心30min，(表一)NK活性、脾重和脾細(xì)胞增殖結(jié)果

棄上清，每孔加入200μl的乙醇-DMSO溶液溶解，595nm測(cè)OD值。
脾重和脾細(xì)胞增殖結(jié)果如表一。從表一可以看出，實(shí)驗(yàn)藥物組脾細(xì)胞增殖活性明顯高于對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)藥物組小鼠脾重與對(duì)照組小鼠脾重相比有所提高，陽性藥物組小鼠脾重最小。
實(shí)施例2藥物對(duì)普通一級(jí)小白鼠IC2的免疫調(diào)節(jié)作用25克左右的IC2小鼠32只，隨機(jī)分為4組，每組8只，第1組腹腔注射藥物，劑量為25mg/kg，連續(xù)給藥4天；第2組腹腔注射藥物，劑量為12.5mg/kg，連續(xù)給藥4天；第3組腹腔注射DDP，劑量為2mg/kg；第4組腹腔注射等體積溶劑，連續(xù)4天。第五天引頸處死，取脾，淋巴細(xì)胞分離液分離單個(gè)核細(xì)胞調(diào)整細(xì)胞濃度為2×106/ml，作為NK細(xì)胞的效應(yīng)細(xì)胞。取單個(gè)核細(xì)胞懸液3.6ml，加入104U/ml的IL20.4ml，，轉(zhuǎn)入塑料培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)48小時(shí)后，吸去培養(yǎng)液及懸浮細(xì)胞，加入新的培養(yǎng)液，維持IL2的濃度為1000U/ml，繼續(xù)培養(yǎng)，兩天換一次液。第7天收獲貼壁細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為106/ml，作為L(zhǎng)AK細(xì)胞的效應(yīng)細(xì)胞。調(diào)整YAC-1和P815細(xì)胞的濃度為105/ml備用①NK/LAK細(xì)胞活性的測(cè)定設(shè)實(shí)驗(yàn)孔、靶細(xì)胞對(duì)照孔、效應(yīng)細(xì)胞對(duì)照孔和空白孔，實(shí)驗(yàn)孔加入效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞各50μl；細(xì)胞對(duì)照孔加入靶細(xì)胞50μl，培養(yǎng)液50μl；效應(yīng)細(xì)胞對(duì)照孔加入效應(yīng)細(xì)胞50μl，培養(yǎng)液50μl；空白對(duì)照孔加入培養(yǎng)液100μl，每個(gè)樣品設(shè)6復(fù)孔，培養(yǎng)4小時(shí)，M每孔加入MTT 20μl再培養(yǎng)2小時(shí)，3000rpm離心30min，棄上清，每孔加入200μl的乙醇-DMSO溶液溶解，595nm測(cè)OD值。
NK/LAK細(xì)胞活性＝(實(shí)驗(yàn)孔OD值-效應(yīng)細(xì)胞對(duì)照孔OD值)/靶細(xì)胞對(duì)照孔OD值×100％②脾細(xì)胞增殖活性的測(cè)定單個(gè)核細(xì)胞懸液和10μg/ml的ConA各100μl/孔加入96孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)72小時(shí)后用MTT法測(cè)脾細(xì)胞增殖。
(表二)脾細(xì)胞增殖活性

③實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表二。實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明申請(qǐng)所涉及的苯并異硒唑衍生物可誘導(dǎo)脾細(xì)胞對(duì)NK細(xì)胞的分泌，顯著提高NK細(xì)胞活性。
實(shí)施例3藥物對(duì)C57腫瘤鼠生物調(diào)節(jié)作用的研究(1)C57腫瘤鼠分別腹腔注射EB(25mg/kg)、DDP和溶劑，連續(xù)給藥7天，與第10天引頸處死，取睥稱脾重，分離單個(gè)核細(xì)胞，MTT法測(cè)脾細(xì)胞增殖活性和NK/LAK細(xì)胞活性，MTT法測(cè)NK細(xì)胞活性，方法同上。脾重和脾細(xì)胞增殖結(jié)果如表三。
(表三)脾重和脾細(xì)胞增殖結(jié)果如下表


從表中可以看出實(shí)驗(yàn)藥物組脾細(xì)胞增殖活性與對(duì)照組和陽性對(duì)照組相比有明顯的差異，前者的脾細(xì)胞增殖活性明顯高于后者；ddp組小鼠的脾重最低，實(shí)驗(yàn)藥物組小鼠脾重最高，對(duì)照組次之；實(shí)驗(yàn)藥物組小鼠NK細(xì)胞活性比其他兩組高(2)藥物對(duì)C57小鼠腫瘤的影響接種腫瘤后的3天，對(duì)照組頸背部長(zhǎng)起肉眼可見的腫塊，且生長(zhǎng)迅速；陽性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)藥物組小鼠于接種腫瘤后第4、5天始見頸背部腫塊，且生長(zhǎng)緩慢。接種腫瘤后地10天處死小鼠，剝離腫瘤，稱重，結(jié)果列于表四。
(表四)藥物對(duì)Lewis肺癌C57小鼠腫瘤的影響

從表中可以看出，實(shí)驗(yàn)藥物組和陽性對(duì)照組腫瘤瘤重與對(duì)照組相比均有顯著差異，其中25mg/kg劑量組的抑制率與陽性對(duì)照藥物DDP2.0mg/kg劑量組差異不顯著，12.5mg/kg劑量組與對(duì)照組相比有顯著差異，但抑制率小于25mg/kg劑量組。
(3)腫瘤組織細(xì)胞形態(tài)觀察腫瘤組織經(jīng)石蠟包埋切片后，HE染色，40×光鏡下觀察，對(duì)照組細(xì)胞核大，分裂相多，異質(zhì)性強(qiáng)，與對(duì)照組相比DDP組和EB組核濃縮深染，核形態(tài)多樣有圓形、多邊形、條形、圓環(huán)形、半月形等，分裂相較少，如圖2所示。每組選4張片子，每張片子隨機(jī)記數(shù)3個(gè)視野，120-150個(gè)細(xì)胞，記數(shù)分裂細(xì)胞，分裂指數(shù)＝分裂相細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)，計(jì)算分裂指數(shù)如下從表五中可以看出，DDP組和藥物組腫瘤細(xì)胞分裂指數(shù)明顯低于對(duì)照組，有顯著性差異。 DDP組和藥物組之間分裂指數(shù)無顯著差異。
(表五).給藥7天后光鏡下觀察腫瘤組織HE染色的細(xì)胞分裂指數(shù)

實(shí)施例4藥物對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響體重18-22g的健康小白鼠，隨機(jī)分成給藥組、陰性和陽性對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)前4天給1，2-二{(1，2)-苯并異硒唑-3(2H)-酮}-丁烷(藥物1)(25mg/kg)，1，2-二{(1，2)-苯并異硒唑-3(2H)-酮}-乙烷(藥物2)(25mg/kg)給藥4天后，每鼠腹腔注射5％雞紅細(xì)胞生理鹽水懸液0.5ml。間隔10小時(shí)，頸椎脫臼處死小鼠，正中剪開腹壁皮膚，經(jīng)腹膜注入生理鹽水2ml，輕輕按揉鼠腹部1分鐘，然后吸出腹腔洗液1ml，分滴于兩片載玻片上，放入墊有濕紗布的搪瓷盒內(nèi)，移置37℃孵箱溫育30分鐘。以生理鹽水漂洗，以除去未粘片的細(xì)胞。晾干，1∶1丙酮一甲醇溶液固定5分鐘。4％(V/V)Giemsa一磷酸緩沖液染色3分鐘，用流水沖洗，晾于。油鏡下計(jì)數(shù)巨噬細(xì)胞，每片200個(gè)計(jì)算①吞噬百分率＝吞噬的雞紅細(xì)胞的巨噬細(xì)胞數(shù)/200個(gè)巨噬細(xì)胞(吞及未吞的)×100％②吞噬指數(shù)＝被吞噬的雞紅細(xì)胞/200個(gè)巨噬細(xì)胞×2在計(jì)數(shù)時(shí)，同時(shí)觀察雞紅細(xì)胞被消化的程度，借以判定巨噬細(xì)胞吞噬和消化功能，通常分為4級(jí)I級(jí)未消化。被吞噬的雞紅細(xì)胞完整，胞質(zhì)淺紅或淺黃帶綠色，胞核淺紫紅色。
II級(jí)輕度消化。胞質(zhì)淺黃綠色，胞核固縮呈紫藍(lán)色。
III級(jí)重度消化。胞質(zhì)淡染，胞核呈淺灰黃色。
IV級(jí)完全消化。巨噬細(xì)胞內(nèi)僅見形態(tài)類似雞紅細(xì)胞大小的空泡，邊緣整齊，胞核隱約可見。
(表六).給藥4天后巨噬細(xì)胞吞噬功能活性評(píng)價(jià)

權(quán)利要求
1.本發(fā)明化合物提供以下通式(I)、(II)或(III)的苯并異硒唑衍生物及其藥物學(xué)上可接受的鹽 其中R是C1-6亞烷基、亞苯基、亞聯(lián)苯基、亞三苯基、或者 其中M是Pt、Pd或Rh，R′是糖殘基或者 其中R″為Cl、H2O、OH、Br、或者I，R為-H、-CH2C6H5OH、-CH2OH、-CH2CONH2、-CH2CH2COOH -CH2(CH2)4NH2、-CH2COOH、-CH2CH2CONH2、-(CH2)3CH、-(CH2)3NHC(NH)NH2、-(CH2)3CHCH2、-CH3、-CH2CH3、-CH2C6H5、-CH2SH、或者-CH2CH2SCH3，R″″為-H、-CH2C6H5OH、-CH2OH、-CH2CONH2、-CH2CH2COOH、 -CH2(CH2)4NH2、-CH2COOH、-CH2CH2CONH2、-(CH2)3CH、-(CH2)3NHC(NH)NH2、-(CH2)3CHCH2、-CH3、-CH2CH3、-CH2C6H5、-CH2SH、或者-CH2CH2SCH3。
2.如權(quán)利要求1所述的苯并異硒唑衍生物及其應(yīng)用，其中R是C1-4亞烷基。
3.如權(quán)利要求2所述的苯并異硒唑衍生物及其應(yīng)用，其中R是亞丁基。
4.如權(quán)利要求1所述的苯并異硒唑衍生物及其應(yīng)用，其中R是亞苯基或亞聯(lián)苯基。
5.如權(quán)利要求4所述的苯并異硒唑衍生物及其應(yīng)用，其中R是亞聯(lián)苯基。
6.如權(quán)利要求1所述的苯并異硒唑衍生物及其應(yīng)用，其中R′是1，3，4，6-四-O-乙?；?2-去氧-D-吡喃葡萄糖基。
7.如權(quán)利要求1所述的苯并異硒唑衍生物及其應(yīng)用，其中R和R″″分別獨(dú)立地為-H、-CH3、-CH2CH3、-CH2C6H5、-CH2SH、-CH2CH2SCH3。
8.一種藥物組合物，其包含如權(quán)利要求1所述的通式(I)、(II)或(III)的苯并異硒唑衍生物或其藥物學(xué)上可接受的鹽的藥物組合物以及藥物學(xué)上可接受的賦形劑或載體。
9.一種保健功能組合物，其包含如權(quán)利要求1所述的通式(I)、(II)或(III)的苯并異硒唑衍生物或其衛(wèi)生學(xué)上可接受的鹽的保健功能組合物以及衛(wèi)生學(xué)上可接受的賦形劑或載體。
10.如權(quán)利要求8所述的藥物組合物，其還包含其他的治療藥物和細(xì)胞免疫增強(qiáng)藥物。
11.如權(quán)利要求9所述的保健功能組合物，其還包含其他的保健功能有效成分。
12.如權(quán)利要求1所述的通式(I)、(II)或(III)的苯并異硒唑衍生物或其藥物學(xué)上可接受的鹽在制備用于治療各種免疫損傷疾病和免疫調(diào)節(jié)功能依賴或促進(jìn)的相關(guān)疾病，如感染、病毒性肝炎、變態(tài)反應(yīng)性疾病、自身免疫病、獲得性免疫缺陷綜合癥(AIDS)和腫瘤的診斷、治療等。
13.在包括人的哺乳動(dòng)物中用于各種免疫損傷疾病和免疫調(diào)節(jié)功能依賴或促進(jìn)的相關(guān)疾病，如感染、病毒性肝炎、變態(tài)反應(yīng)性疾病、自身免疫病、獲得性免疫缺陷綜合癥(AIDS)和腫瘤等方面疾病的診斷、治療的方法，其包括向需要此等治療的患者給藥治療有效量的如權(quán)利要求1所述的通式(I)、(II)或(III)的苯并異硒唑衍生物或其藥物學(xué)上可接受的鹽。
14.在包括人的哺乳動(dòng)物中用于各種免疫損傷疾病和免疫調(diào)節(jié)功能依賴或促進(jìn)的相關(guān)疾病，如感染、病毒性肝炎、變態(tài)反應(yīng)性疾病、自身免疫病、獲得性免疫缺陷綜合癥(AIDS)和腫瘤等方面疾病的診斷、治療的方法，其包括向需要此等治療的患者聯(lián)合給藥治療有效量的如權(quán)利要求1所述的通式(I)、(II)或(III)的苯并異硒唑衍生物或其藥物學(xué)上可接受的鹽以及其他治療上述疾病的藥物。
15.如權(quán)利要求14所述的方法，其中如權(quán)利要求1所述的通式(I)、(II)或(III)的苯并異硒唑衍生物或其藥物學(xué)上可接受的鹽是與其他的藥物同時(shí)給藥的。
16.如權(quán)利要求14所述的方法，其中先給藥如權(quán)利要求1所述的通式(I)、(II)或(III)的苯并異硒唑衍生物或其藥物學(xué)上可接受的鹽，然后再給藥所述的其他藥物。
17.如權(quán)利要求14所述的方法，其中先給藥所述其他藥物，然后再給藥如權(quán)利要求1所述的通式(I)、(II)或(III)的苯并異硒唑衍生物或其藥物學(xué)上可接受的鹽。
18.如權(quán)利要求14-17之一所述的方法，其中給藥所述的其他藥物是它們的組合。
全文摘要
本發(fā)明涉及以下通式(I)、(II)或(III)的苯并異硒唑衍生物及其藥物學(xué)上可接受的鹽。該衍生物可用于免疫調(diào)節(jié)和生物治療作用或具有免疫調(diào)節(jié)功能的保健組合物。
文檔編號(hào)A61P37/02GK1511834SQ0215891
公開日2004年7月14日 申請(qǐng)日期2002年12月27日 優(yōu)先權(quán)日2002年12月27日
發(fā)明者曾慧慧 申請(qǐng)人:北京大學(xué)藥學(xué)院