專利名稱：利用靜電紡絲制備硫酸化絲素蛋白血管組織工程支架的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)用材料領(lǐng)域，特別是涉及一種具有良好抗凝血性能的硫酸化絲素蛋白血管組 織工程支架的及其制備方法。
背景技術(shù)：
心血管類疾病嚴(yán)重危害人類身體健康，血管重建在臨床外科中具有十分重要的地位,全球每年大約超過60萬人需要接受各種血管外科手術(shù),其中大多數(shù)都需要合適的血管移植物。目前，臨床上應(yīng)用的血管移植物主要包括自體血管、異體血管和人工合成血管，由于自體血管的來源有限以及異體血管的排異反應(yīng)，使得人工血管移植術(shù)備受重視。目前，直徑大于6毫米的大口徑人工血管已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了商品化，而直徑小于6毫米的小口徑人工血管的臨床應(yīng)用非常令人失望。小口徑人工血管存在的主要問題是其植入人體后易發(fā)生急性血栓，而血管支架材料具有良好的生物相容性、優(yōu)良的力學(xué)性能和長期穩(wěn)定的血液相容性是其技術(shù)突破的關(guān)鍵。對支架材料進(jìn)行抗凝血改性以提高小口徑組織工程血管的長期抗血栓性已經(jīng)成為當(dāng)前國內(nèi)外學(xué)者的研究重點(diǎn)。在材料表面結(jié)合抗凝血蛋白和種植血管內(nèi)皮細(xì)胞都是改善支架材料抗凝血性能的有效途徑。肝素是常見的抗凝血蛋白，肝素單純涂層后可改善血液流變學(xué)性能，但結(jié)合的強(qiáng)度不夠，易脫落導(dǎo)致過快釋放。近年來，一些學(xué)者采用等離子體照射來改變材料表面結(jié)構(gòu)，使材料表面生成具有反應(yīng)活性的基團(tuán)，將肝素以共價鍵形式固定在材料表面，但是其抗凝血效果并不令人滿意。處于體內(nèi)環(huán)境中的支架材料由于要接觸到體液、有機(jī)大分子、酶、自由基、細(xì)胞等多種因素，其生物學(xué)環(huán)境極為復(fù)雜，采用表面改性的方法對材料長期抗凝血性能的改善較為有限，隨著支架材料的降解和表面修飾層的脫落，其抗凝血性能雖然可以滿足高血流量、低阻力的大口徑血管的需要，但還是無法滿足對抗凝血性能要求較高的小口徑血管的需要。另一方面,在支架材料的內(nèi)表面種植血管內(nèi)皮細(xì)胞可以形成抗栓表層，能夠降低組織工程血管內(nèi)表面的凝血酶原的活性，從而提高材料的血液相容性特別是提高小口徑組織工程血管的通暢率，然而內(nèi)皮細(xì)胞在受到血流沖刷后保存率不足一直是困擾國內(nèi)外學(xué)者的一大難題。研究表明，當(dāng)植有內(nèi)皮細(xì)胞的組織工程血管植入人體后，受到血流沖擊最初的4 24小時內(nèi)，會有30% 60%的內(nèi)皮細(xì)胞脫落，而血管內(nèi)皮層的修復(fù)需要一定的時間，在這段時間內(nèi)血管形成血栓的可能性會極大增加，因此提高組織工程血管內(nèi)皮層的保存率非常重要，而此時支架材料的抗凝血性能也顯得尤為關(guān)鍵，這就要求小口徑組織工程血管的支架材料既要具有良好的生物相容性，又要具有長期穩(wěn)定的抗凝血性能。近年來，絲素蛋白以其良好的細(xì)胞相容性和顯著的機(jī)械性能引起越來越多的關(guān)注。在之前的研究中，我們對絲素蛋白進(jìn)行抗凝血改性，制備了硫酸化絲素蛋白。研究結(jié)果表明，硫酸化絲素蛋白不但具有良好的血液相容性，而且可以促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的黏附、增殖并維持其功能。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是將具有良好細(xì)胞相容性和抗凝血性能的硫酸化絲素蛋白利用靜電紡絲技術(shù)制備成管狀的小口徑組織工程血管支架材料，從而使該支架材料具有三維立體全方位的抗凝血性能，而不僅僅是表面具有抗凝血性能，支架的抗凝血性能不會隨著表面涂層的脫落和降解而消失，而是會隨著支架材料而一直長期穩(wěn)定的存在。為達(dá)到上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下a)絲素蛋白的制備將家蠶絲置于0. 1%的Na2CO3溶液中，于98 100°C處理30分鐘，重復(fù)三次，以脫去蠶絲纖維表面的絲膠蛋白，在室溫空氣中晾干。將蠶絲纖維放入CaCl2-CH3CH2OH-H2O (摩爾比為I : 2 8)溶液中溶解，保持溫度在78±2°C并不斷攪拌，得到絲素蛋白溶液，隨后用透析管在蒸餾水中透析。最后，將絲素溶液冷凍干燥24小時制成絲素蛋白海綿；

b)硫酸化絲素蛋白的制備將IOmL的氯磺酸緩慢均勻地加入到60mL的吡啶中，然后將步驟(b)制得的絲素蛋白海綿加入氯磺酸的吡啶溶液中，把體系溫度逐步提高到80°C并保持一定時間。反應(yīng)結(jié)束后，將200mL水加入到體系中，并用適量的氫氧化鈉溶液中和反應(yīng)溶液，將體系中的不溶物濾掉，加入500mL乙醇使可溶的硫酸化絲素蛋白析出，離心收集硫酸化絲素蛋白，并使其復(fù)溶于少量雙蒸水中，制備一定濃度的硫酸化絲素蛋白溶液，凍干保存；c)靜電紡絲過程將絲素蛋白和硫酸化絲素蛋白海綿溶于六氟異丙醇中，配制濃度為7% 10%的絲素蛋白和硫酸化絲素蛋白混合溶液。將此溶液置于注射器中，施加電壓值為10 30kV，用旋轉(zhuǎn)的金屬棒接收纖維，接收距離為10 25cm,接收棒的直徑選擇為3 5mm,旋轉(zhuǎn)速度為200 IOOOrpm,注射器推進(jìn)速度為0. 03 0. 05mm/s。d)使用90% 100%的甲醇溶液浸泡支架，誘導(dǎo)絲素蛋白向P片層結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變，提高力學(xué)性能以防止其在水中溶解。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是(I)本發(fā)明的硫酸化絲素蛋白血管組織工程支架不但具有良好的細(xì)胞相容性，而且具有長期穩(wěn)定的抗凝血性能。(2)本發(fā)明的硫酸化絲素蛋白血管組織工程支架具有比較高的孔隙率，并且具有好的連通性，利于細(xì)胞的生長增殖。(3)本發(fā)明直接制備出了硫酸化絲素蛋白血管組織工程支架，避免了粘合劑和交聯(lián)劑的使用。(4)采用的靜電紡絲方法工藝簡單，耗量少，耗時短，易實(shí)現(xiàn)商業(yè)生產(chǎn)。(5)根據(jù)需要可調(diào)節(jié)硫酸化絲素蛋白小口徑血管的直徑、長度和厚度。(6)本發(fā)明所制備的硫酸化絲素蛋白管狀組織工程支架可用于小口徑血管的修復(fù)和組織工程以及血液透析通路的建立。
具體實(shí)施例方式具體結(jié)合實(shí)施例，對本發(fā)明做進(jìn)一步的闡述。這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對發(fā)明做各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。實(shí)施例I(I)將絲素蛋白和硫酸化絲素蛋白海綿溶于六氟異丙醇中，配制濃度為8%的混合溶液。
(2)將此溶液置于注射器中，施加電壓值為20kV，用旋轉(zhuǎn)的金屬棒接收纖維，接收距離為15cm,接收棒的直徑選擇為3mm,長度為300mm,旋轉(zhuǎn)速度為500rpm,注射器推進(jìn)速度為 0. 05mm/so(3)將金屬棒上接收到的硫酸化絲素蛋白血管置于99%的甲醇中，誘導(dǎo)絲素蛋白向3片層結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變，真空干燥24小時得到管壁厚度為0.2mm，管徑為3mm的硫酸化絲素蛋
白血管。實(shí)施例2(I)將絲素蛋白和硫酸化絲素蛋白海綿溶于六氟異丙醇中，配制濃度為9%的混合溶液。(2)將此溶液置于注射器中，施加電壓值為20kV，用旋轉(zhuǎn)的金屬棒接收纖維，接收距離為14cm，接收棒的直徑選擇為4mm，長度為300mm，旋轉(zhuǎn)速度為500rpm，注射器推進(jìn)速度為 0.04mm/s。(3)將金屬棒上接收到的硫酸化絲素蛋白血管置于99%的甲醇中，誘導(dǎo)絲素蛋白向3片層結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變，真空干燥24小時得到管壁厚度為0. 2mm,管徑為4mm的硫酸化絲素蛋
白血管。實(shí)施例3(I)將絲素蛋白和硫酸化絲素蛋白海綿溶于六氟異丙醇中，配制濃度為10%的混合溶液。(2)將此溶液置于注射器中，施加電壓值為20kV，用旋轉(zhuǎn)的金屬棒接收纖維，接收距離為13cm,接收棒的直徑選擇為5mm,長度為300mm,旋轉(zhuǎn)速度為500rpm,注射器推進(jìn)速度為 0. 03mm/so(3)將金屬棒上接收到的硫酸化絲素蛋白血管置于99%的甲醇中，誘導(dǎo)絲素蛋白向3片層結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變，真空干燥24小時得到管壁厚度為0. 2mm,管徑為5mm的硫酸化絲素蛋
白血管。
權(quán)利要求
1.硫酸化絲素蛋白血管組織工程支架的制備方法，其特征在于包含如下步驟將絲素蛋白和硫酸化絲素蛋白海綿溶于六氟異丙醇中，配制濃度為7% 10%的絲素蛋白和硫酸化絲素蛋白混合溶液。采用靜電紡絲工藝，在旋轉(zhuǎn)的接收棒上收集納米纖維。然后用90% 100%的甲醇溶液浸泡支架，誘導(dǎo)絲素蛋白向P片層結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變，提高力學(xué)性能以防止其在水中溶解。
2.如權(quán)利要求I所述的硫酸化絲素蛋白血管組織工程支架，其特征在于所述靜電紡絲的工藝參數(shù)為施加電壓10 30kV，接收距離10 25cm，接收棒的直徑3 5mm，旋轉(zhuǎn)速度200 IOOOrpm,注射器推進(jìn)速度0. 03 0. 05mm/s。
3.如權(quán)利要求I所述的硫酸化絲素蛋白血管組織工程支架，其特征在于絲素蛋白和硫酸化絲素蛋白可以采用不同的混合比例，硫酸化絲素蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍為10 % 40%。
4.如權(quán)利要求I所述的硫酸化絲素蛋白血管組織工程支架，其特征在于可根據(jù)需要調(diào)整接收棒的直徑或長度。
5.如權(quán)利要求I所述的硫酸化絲素蛋白血管組織工程支架，其特征在于具有抗凝血性能。
6.如權(quán)利要求I所述的硫酸化絲素蛋白血管組織工程支架，其特征在于所制備的硫酸化絲素蛋白管狀組織工程支架可用于小口徑血管的修復(fù)和組織工程以及血液透析通路的建立。
全文摘要
本發(fā)明涉及利用靜電紡絲技術(shù)制備硫酸化絲素蛋白血管組織工程支架，屬于生物醫(yī)用材料的領(lǐng)域。將絲素蛋白和硫酸化絲素蛋白海綿溶于六氟異丙醇中，配制濃度為7％～10％的絲素蛋白和硫酸化絲素蛋白混合溶液。將此溶液置于注射器中，施加電壓值為10～30kV，用旋轉(zhuǎn)的金屬棒接收纖維，接收距離為10～25cm，接收棒的直徑選擇為3～5mm，旋轉(zhuǎn)速度為200～1000rpm，注射器推進(jìn)速度為0.03～0.05mm/s?？傻玫胶穸葹?.1～1mm，內(nèi)徑為3～5mm的管狀組織工程支架。然后用90％～100％的甲醇溶液浸泡支架，誘導(dǎo)絲素蛋白向β片層結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變，提高力學(xué)性能以防止其在水中溶解。本發(fā)明制備的血管組織工程支架具有良好的細(xì)胞相容性和長期穩(wěn)定的抗凝血性能，且管徑可控，可用于小口徑血管的修復(fù)和組織工程以及血液透析通路的建立。該制備方法操作簡單，成本低，可實(shí)現(xiàn)商業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號A61L31/04GK102652841SQ20121011322
公開日2012年9月5日 申請日期2012年4月17日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月17日
發(fā)明者丁希麗, 劉海峰, 樊瑜波, 畢研學(xué) 申請人:北京航空航天大學(xué)