專利名稱：一種氫氧化鋁納米膠佐劑的制備方法
一種氫氧化鋁納米膠佐劑的制備方法技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于動物生物制品免疫佐劑制備工藝技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種氫氧化鋁納米膠佐劑的制備方法。
背景技術(shù)：
佐劑最初是由Gaston Ramon作為與特異性抗原聯(lián)合應(yīng)用的一種物質(zhì)而進(jìn)行敘述的，而與佐劑聯(lián)合應(yīng)用的特異性抗原此時(shí)所產(chǎn)生的免疫應(yīng)答比其單獨(dú)應(yīng)用時(shí)要高得多。一般而言，佐劑本身并不提供免疫，只有在與免疫原組成一種制劑時(shí)，它們才能夠改善由疫苗誘導(dǎo)產(chǎn)生的免疫應(yīng)答的廣度和效力。
目前臨床上應(yīng)用的疫苗用免疫佐劑多為白油佐劑、氫氧化鋁佐劑、類脂佐劑和蜂膠佐劑等。白油佐劑免疫原性好，但是毒副作用大；氫氧化鋁膠佐劑免疫原性好，副作用小， 但不能誘導(dǎo)細(xì)胞免疫；類脂佐劑和蜂膠佐劑免疫原性好，可誘導(dǎo)體液免疫和細(xì)胞免疫，免疫持續(xù)時(shí)間長，但原材料價(jià)格昂貴。因此近年來，各國科研工作者應(yīng)用不同原料和采用不同方法研制了一系列新型免疫佐劑，但均因?yàn)樾Ч焕硐牖蛘叨玖μ?，沒有一種得到得到廣泛應(yīng)用。發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提出了一種氫氧化鋁納米膠佐劑的制備方法，該方法制備出緩釋作用更強(qiáng)的納米級動物疫苗佐劑，所得的產(chǎn)物粒徑分布均勻、純度高，吸附力強(qiáng)，無副作用，應(yīng)用效果好。
本發(fā)明的技術(shù)方案是通過如下步驟來實(shí)現(xiàn)的
(1)配制明礬溶液將固體明礬投入水中，通入蒸汽吹沸溶解，調(diào)節(jié)明礬溶液濃度至 25%-28%，使明礬溶液溫度保持在60 65°C之間；配制純堿溶液通入蒸汽吹沸溶解堿液，調(diào)節(jié)濃度至10-12%，使純堿溶液溫度保持在 50 55°C之間；(2)化合將調(diào)節(jié)好溫度的礬堿溶液和堿液，用內(nèi)徑為20mm的膠管互相吻合，以相同流速通過沖擊擋板流入不銹鋼容器中內(nèi)，邊化合邊用高速剪切機(jī)對混合溶液進(jìn)行高速剪切， 化合完畢后繼續(xù)剪切30分鐘，化合后溶液溫度應(yīng)在49± 1°C，pH值為6-7 ；(3)熟化向剪切后的溶液中直接插入蒸汽管通入蒸汽，對溶液進(jìn)行熟化，驅(qū)除C02，至沒有大量氣泡產(chǎn)生為止；(4)冷卻向熟化膠液中加冷水使熟化膠液溫降至75°C以下，攪拌均勻后測PH；(5)分裝用水泵將熟化膠液送入六個(gè)帆布袋內(nèi)，待熟化膠母液控干后，對剩余熟化膠進(jìn)行洗滌；(6)洗滌母液控干后即可進(jìn)行洗滌，洗滌水溫控制在50 55°C，每次洗滌間隔2.5 3小時(shí)，洗滌時(shí)用攪棒打碎膠鹽，攪拌均勻，將水放滿膠袋，洗完六次，檢查硫酸鹽合格后，停止洗漆;(7)收膠把洗滌好的膠控干，用膠袋收起壓在磅秤上，使膠脫水，至脫水后膠量位明礬投料量的2 2. 5倍時(shí)進(jìn)行收膠，膠經(jīng)檢驗(yàn)合格后即可使用。
其中上述步驟(3)中對溶液進(jìn)行熟化至膠態(tài)變稀、發(fā)灰、青亮?xí)r停止通入蒸汽，吹沸后PH為7. 6 7. 8。
其中上述步驟(4)中冷卻后熟化膠液PH較熟化時(shí)膠液PH低或不變。
本發(fā)明所述技術(shù)方案的有益效果為本發(fā)明在常規(guī)氫氧化鋁膠佐劑的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)了一種緩釋作用更強(qiáng)的納米級動物疫苗佐劑制備方法，制備的氫氧化鋁納米膠佐劑與普通氫氧化鋁膠佐劑配置的傳染性滅活疫苗相比，提供吸附力更強(qiáng)，抗體水平結(jié)果顯示納米級氫氧化鋁膠佐劑組明顯好于普通氫氧化鋁膠組，高出2 8個(gè)抗體滴度；用緩釋作用更緩慢的納米級佐劑生產(chǎn)疫苗，能提高滅活疫苗的質(zhì)量，增強(qiáng)疫苗的免疫效力，延長兔疫持續(xù)期，較普通鋁膠組長60天左右；另外用本制備方法所得的產(chǎn)物粒徑分布均勻、純度高，粒徑主要集中于50 IOOnm左右，在免疫佐劑方面有較好的應(yīng)用前景。
具體實(shí)施方式
為了使本發(fā)明的技術(shù)方案更加清楚明白，下面結(jié)合結(jié)合傳染性鼻炎滅活疫苗實(shí)例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
一、疫苗制備1、制備抗原(O菌液培養(yǎng)將生產(chǎn)種子接種于半合成培養(yǎng)基封好瓶口并搖勻，置37°c溫室中靜止培養(yǎng)18小時(shí)左右，期間每個(gè)6 8小時(shí)搖晃一次。當(dāng)眼觀菌液呈現(xiàn)混濁的淡黃色時(shí)即達(dá)到生長聞峰，準(zhǔn)備收犾，此時(shí)含囷量可以達(dá)到10億/ml左右。
(2)制苗菌液的濃縮與滅活用濃縮機(jī)將純檢合格的菌液進(jìn)行濃縮，然后再用PH 為7. 2的生理鹽水制成懸浮液，使40 50億/ml菌體，通過比濁法測定最終的含菌量。再按體積比加入2%。的甲醛溶液進(jìn)行滅活，混勻后于37°C滅菌I天，于2 8°C下放置I天，經(jīng)檢驗(yàn)無菌生長作為制苗抗原。
2、制備氫氧化鋁膠 (1)配制明礬溶液將固體明礬投入水中，通入蒸汽吹沸溶解，調(diào)節(jié)明礬溶液濃度至 25%-28%，使明礬溶液溫度保持在60 65°C之間；配制純堿溶液通入蒸汽吹沸溶解堿液，調(diào)節(jié)濃度至10-12%，使純堿溶液溫度保持在 50 55°C之間；(2)化合將調(diào)節(jié)好溫度的礬堿溶液和堿液，用內(nèi)徑為20mm的膠管互相吻合，以相同流速通過沖擊擋板流入不銹鋼容器中內(nèi)，邊化合邊用高速剪切機(jī)對混合溶液進(jìn)行高速剪切， 化合完畢后繼續(xù)剪切30分鐘，化合后溶液溫度應(yīng)在49± 1°C，pH值為6-7 ；(3)熟化向剪切后的溶液中直接插入蒸汽管通入蒸汽，對溶液進(jìn)行熟化，驅(qū)除C02，至沒有大量氣泡產(chǎn)生、溶液進(jìn)行熟化至膠態(tài)變稀、發(fā)灰、青亮?xí)r停止通入蒸汽，吹沸后PH為7. 6 7. 8 ;(4)冷卻向熟化膠液中加冷水使熟化膠液溫降至75°C以下，攪拌均勻后測PH；(5)分裝用水泵將熟化膠液送入六個(gè)帆布袋內(nèi)，待熟化膠母液控干后，對剩余熟化膠進(jìn)行洗滌；(6)洗滌母液控干后即可進(jìn)行洗滌，洗滌水溫控制在50 55°C，每次洗滌間隔2.5 3小時(shí)，洗滌時(shí)用攪棒打碎膠鹽，攪拌均勻，將水放滿膠袋，洗完六次，檢查硫酸鹽合格后，停止洗漆;(7)收膠把洗滌好的膠控干，用膠袋收起壓在磅秤上，使膠脫水，至脫水后膠量位明礬投料量的2 2. 5倍時(shí)進(jìn)行收膠，膠經(jīng)檢驗(yàn)合格后即可使用。
其中上述步驟(4)中冷卻后熟化膠液PH較熟化時(shí)膠液PH低或不變。
3、疫苗配置佐劑準(zhǔn)備按照成品疫苗最終含納米級氫氧化鋁佐劑10%的量取納米級氫氧化鋁佐劑，用生理鹽水溶解納米級氫氧化鋁佐劑，并進(jìn)行高壓滅菌。
4、乳化按照最終疫苗中抗原含量為6億/ml，納米級氫氧化鋁膠佐劑含量為10%， 將抗原按比例加入準(zhǔn)備好的納米級氫氧化鋁膠佐劑溶液中，按照3000rpm，乳化30分鐘。乳化完畢后將疫苗降溫至室溫，取樣檢測。
二、佐劑及疫苗檢測將新型復(fù)合佐劑依照國家獸藥標(biāo)準(zhǔn)，驗(yàn)證其結(jié)果1、佐劑安全性檢驗(yàn)用2 3月齡的SPF雞8只，每只皮下注射本納米級氫氧化鋁佐劑疫苗1ml，連續(xù)觀察 14日，均應(yīng)無異常反應(yīng)。
檢驗(yàn)結(jié)果連續(xù)觀察14日后8只SPF雞均未出現(xiàn)異常反應(yīng)。
2、佐劑配置疫苗的效力檢驗(yàn)選用傳染性鼻炎復(fù)納米級氫氧化鋁佐劑滅活疫苗，用2 3月齡的SPF雞為試驗(yàn)動物， 8只/組，設(shè)置A、B組，A組每只皮下注射納 米級氫氧化鋁佐劑疫苗O. 5ml, B組每只皮下注射用普通氫氧化鋁佐劑疫苗O. 5ml，C組設(shè)為對照組，8只/組，不做注射。
I個(gè)月后向每只條件相同的對照雞8只/組及實(shí)驗(yàn)雞的眶下竇內(nèi)注射C-Hpg-8攻毒菌液0.2ml (50 100萬活菌)，連續(xù)觀察14日。
合格條件若對照雞全部發(fā)病，免疫雞至少保護(hù)6只，或?qū)φ针u3只發(fā)病，免疫雞至少保護(hù)7只為合格。
檢驗(yàn)結(jié)果C組全發(fā)病，A組全健活，B組5只發(fā)病，3只健活。
權(quán)利要求
1.一種氫氧化鋁納米膠佐劑的制備方法，其特征在于其制備方法及步驟如下 (1)配制明礬溶液將固體明礬投入水中，通入蒸汽吹沸溶解，調(diào)節(jié)明礬溶液濃度至25%-28%，使明礬溶液溫度保持在60 65°C之間； 配制純堿溶液通入蒸汽吹沸溶解堿液，調(diào)節(jié)濃度至10-12%，使純堿溶液溫度保持在50 55°C之間； (2)化合將調(diào)節(jié)好溫度的礬堿溶液和堿液，用內(nèi)徑為20mm的膠管互相吻合，以相同流速通過沖擊擋板流入不銹鋼容器中內(nèi)，邊化合邊用高速剪切機(jī)對混合溶液進(jìn)行高速剪切，化合完畢后繼續(xù)剪切30分鐘，化合后溶液溫度保持在49 土 1°C，pH值保持6-7 ； (3)熟化向剪切后的溶液中直接插入蒸汽管通入蒸汽，對溶液進(jìn)行熟化，驅(qū)除CO2,至沒有大量氣泡產(chǎn)生為止； (4)冷卻向熟化膠液中加冷水使熟化膠液溫降至75°C以下，攪拌均勻后測PH； (5)分裝用水泵將熟化膠液送入六個(gè)帆布袋內(nèi)，待熟化膠母液控干后，對剩余熟化膠進(jìn)行洗滌； (6)洗滌母液控干后即可進(jìn)行洗滌，洗滌水溫控制在50 55°C，每次洗滌間隔2.5 3小時(shí)，洗滌時(shí)用攪棒打碎膠鹽，攪拌均勻，將水放滿膠袋，洗完六次，檢查硫酸鹽合格后，停止洗漆; (7)收膠把洗滌好的膠控干，用膠袋收起壓在磅秤上，使膠脫水，至脫水后膠量位明礬投料量的2 2. 5倍時(shí)進(jìn)行收膠，膠經(jīng)檢驗(yàn)合格后即可使用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種氫氧化鋁納米膠佐劑的制備方法，其特征在于步驟(3)中對溶液進(jìn)行熟化至膠態(tài)變稀、發(fā)灰、青亮?xí)r停止通入蒸汽，吹沸后PH為7. 6 7. 8。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種氫氧化鋁納米膠佐劑的制備方法，其特征在于步驟(4)冷卻后熟化膠液PH較熟化時(shí)膠液PH低或不變。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種氫氧化鋁納米膠佐劑的制備方法，屬于動物生物制品免疫佐劑制備工藝技術(shù)領(lǐng)域。該制備方法是以鋁鹽溶液和純堿溶液為原料，混合過程中添加一定量的穩(wěn)定劑，通過高剪切乳化機(jī)剪切，初步得到納米級氫氧化鋁溶液，經(jīng)沉淀、洗滌和再沉淀等操作，最后制得納米級氫氧化鋁膠，將制備的納米氫氧化鋁配制成溶液與滅菌活的菌液經(jīng)復(fù)合即可獲取滅活疫苗。本發(fā)明方法制備的納米級氫氧化鋁佐劑粒徑分布均勻、純度高，吸附力強(qiáng)，無副作用，在免疫佐劑制備方面有較好的應(yīng)用前景。
文檔編號A61K39/39GK102988982SQ20121054221
公開日2013年3月27日 申請日期2012年12月14日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月14日
發(fā)明者郎景民, 馬景霞, 張靜 申請人:山東濱州沃華生物工程有限公司