專利名稱：一種蟬擬青霉分生孢子在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于中藥和天然藥物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及蟬擬青霉分生孢子在抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
蝶擬青霉(Paecilomyces cicadae)是中藥蝶花的無性型,屬蟲生性藥用真菌,在我國的認(rèn)識(shí)和利用已有悠久的歷史。南北朝劉宋時(shí)代的《雷公炮炙論》云“蟬花，凡使要白花全者，收得后于屋下東南懸干，去甲土后，用漿水煮一日至夜，焙干碾細(xì)用之”。目前在市場上流通的蟬花藥材基本上為無性型的蟬擬青霉藥材?，F(xiàn)代研究表明， 蟬擬青霉具有免疫調(diào)節(jié)、抗疲勞抗應(yīng)激、解熱鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜催眠、改善腎功能、抗腫瘤等作用。腫瘤化療藥物均有較大的毒副作用，這使得臨床應(yīng)用受到很大限制，并且腫瘤的治療效果已經(jīng)步入平臺(tái)期，因此全世界對(duì)腫瘤治療研究的投入不斷加大，新藥物和新療法的開發(fā)正在加緊進(jìn)行。蟬擬青霉的抗腫瘤作用雖有ー些報(bào)道，但基本集中在蟬擬青霉的水提物或多糖方面，研究發(fā)現(xiàn)，蟬花粗提物對(duì)癌細(xì)胞的生長有明顯的抑制作用，且存在劑量關(guān)系，抑瘤作用與細(xì)胞周期有相關(guān)性；蟬擬青霉水提取總多糖能使人外周血單個(gè)核細(xì)胞的増殖率升高，較高濃度多糖能抑制白血病細(xì)胞株U937、K562的増殖，能提高人外周血單個(gè)核細(xì)胞的増殖能力，從而可能促進(jìn)外周血單個(gè)核細(xì)胞的殺腫瘤活性。而對(duì)于蟬擬青霉分生孢子，目前尚未有對(duì)其進(jìn)行研究和應(yīng)用的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是為了提供一種蟬擬青霉分生孢子在制備抗腫瘤藥物中的用途。本發(fā)明的蟬擬青霉分生孢子可作為主要藥效成分或主要藥效成分之一廣泛應(yīng)用于抗腫瘤藥物的制備。所述的抗腫瘤藥物選自抗胃癌、抗宮頸癌、抗膠質(zhì)瘤、抗胰腺癌、抗白血病、抗回盲腸癌或抗橫紋肌肉瘤的藥物。較優(yōu)的，所述的抗腫瘤藥物選自抗胃癌、抗宮頸癌(鱗癌)、抗胰腺癌、抗白血病或抗橫紋肌肉瘤的藥物。 最優(yōu)的，所述的抗腫瘤藥物選自抗胰腺癌的藥物。本發(fā)明另一方面，公開了ー種抗腫瘤藥物，該抗腫瘤藥物含有治療有效量的蟬擬青霉分生孢子及藥學(xué)上可接受的載體，所述孢子與藥學(xué)上可接受載體的總重量比例為
I 0. 5-1 2。藥學(xué)上可接受的載體為各種藥學(xué)上常用的輔料和/或賦形劑，包括(但不限于)糖類，如乳糖、葡萄糖和蔗糖，淀粉，如玉米淀粉和土豆淀粉，纖維素及其衍生物，如羧甲基纖維素鈉、こ基纖維素和甲基纖維素，黃蓍膠粉末，麥芽，明膠，滑石，固體潤滑劑，如硬脂酸和硬脂酸鎂，硫酸鈣，植物油，如花生油、棉籽油、芝麻油、橄欖油、玉米油和可可油，多元醇，如丙ニ醇、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚こニ醇，海藻酸，乳化劑，如Tween;潤濕劑，如月桂基硫酸鈉，著色劑，調(diào)味劑，壓片劑、穩(wěn)定劑，抗氧化劑，防腐剤，無熱原水，等滲鹽溶液和磷酸鹽緩沖液等，這些物質(zhì)根據(jù)需要用于幫助配方的穩(wěn)定性或有助于提高活性或它的生物有效性或在ロ服的情況下產(chǎn)生可接受的ロ感或氣味。本發(fā)明采用蟬擬青霉分生孢子制備的抗腫瘤藥物，可以通過常規(guī)方法制成任何常規(guī)的制劑形式，包括ロ服制劑，也包括胃腸外給藥制劑。優(yōu)選的是片劑、膠囊劑、顆粒劑、糖漿劑、透皮吸收劑以及噴霧劑。本發(fā)明的蟬擬青霉分生孢子制備的抗腫瘤藥物，可按常規(guī)方法在臨床上使用，例如ロ服。在使用時(shí)，蟬擬青霉分生孢子通常每人每天給藥量至少為2g。具體劑量還應(yīng)考慮給藥途徑、病人個(gè)體狀況等因素，這些都是熟練醫(yī)師技能范圍之內(nèi)的。
本發(fā)明的蟬擬青霉分生孢子可采用下列步驟培養(yǎng)獲得I)斜面菌種制備將蟬擬青霉菌株接種到斜面培養(yǎng)基上，20 25°C下，培養(yǎng)3 5天;2)種子液的制備從斜面上刮取菌絲接種到以PDA液體為基礎(chǔ)的三角瓶液體培養(yǎng)基中，20 25°C下，140 160rpm,培養(yǎng)3 5天即可制得蝶擬青霉種子液；3)將步驟2)中制得的蟬擬青霉種子液按重量百分比為10 15%接入液體培養(yǎng)基中，在20 25°C下，140 160rpm,振蕩發(fā)酵3 5天；4)將步驟3)中制得的發(fā)酵液按重量百分比為3 10%接入滅菌后的固相培養(yǎng)基中，在溫度為18 25°C，濕度為50 90%的條件下，靜置開放式培養(yǎng)15 25天；5)孢子的分離與收集。較佳的，步驟I)中，所述斜面培養(yǎng)基為PDA固相培養(yǎng)基，其制備可由本領(lǐng)域技術(shù)人員參考現(xiàn)有技術(shù)進(jìn)行配制。進(jìn)ー步優(yōu)選的，所述PDA固相培養(yǎng)基的制備方法為挑取新鮮馬鈴薯，去皮洗凈并切碎后與水混合，其中，馬鈴薯和水的重量比例為I : (3 7),滅菌后過濾,其濾液為馬鈴薯煮汁，然后在所述馬鈴薯濾液中加入瓊脂2%份，蔗糖2%份，加熱溶解后加水補(bǔ)足使得體積至原來馬鈴薯濾液體積，然后分裝至試管，滅菌后擺斜面，冷卻后使用。較佳的，步驟2)、3)中，所述液體培養(yǎng)基的制備方法為挑取新鮮無發(fā)芽無病害的馬鈴薯，去皮洗浄，切成小薄片后與水混合，其中，馬鈴薯的重量百分比為10 30%，煮沸后過濾，其濾液為馬鈴薯煮汁。然后加入量百分比為I 10%的蔗糖，0. 01 1%的檸檬酸，加熱溶解后補(bǔ)足剩余百分量的水，混合、滅菌后使用。較佳的，步驟4)中，所述固相培養(yǎng)基的制備方法為先將玉米粉和麩皮煮熟，將蔗糖、KN03、KH2PO4, MgSO4在水中溶解，再與蠶蛹粉、煮熟后的玉米粉和麩皮按照比例混合均勻，滅菌后使用。培養(yǎng)基各原料的組分為麩皮20 45重量份；玉米粉5 30重量份；鹿糖0. 5 5重量份；蠶蛹粉0. 5 5重量份；KNO30. I 3 重量份；
KH2PO40. 05 I 重量份；MgSO40. 05 0. 8 重量份；H2O25 70 重量份?；蛘撸龉滔嗯囵B(yǎng)基還可為稱取一定量的麩皮、蠶蛹粉、貝殼粉、營養(yǎng)液混合、滅菌后使用。培養(yǎng)基各原料的組分為麩皮40 70重量份；營養(yǎng)液30 60重量份；貝殼粉0. 01 2重量份； 蠶蛹粉0. 01 5重量份；其中，所述營養(yǎng)液中含有的組分名稱及其重量百分比為KNO30. I 5 % ;蔗糖I 20%;KH2PO40.05 3%;MgSO40.01 0.5%;檸檬酸銨0. 01 0. 1% ;H2O余量。較佳的，步驟4)中，所述靜置開放式培養(yǎng)過程中，周圍環(huán)境為萬級(jí)潔凈空間，同時(shí)通無菌風(fēng)保證培養(yǎng)室內(nèi)空氣交換流通；進(jìn)一步優(yōu)選的，在靜置開放式培養(yǎng)過程中，還需要在培養(yǎng)基上面覆蓋多層厚度為0. I 0. 3_/層，含水量為飽和的無菌吸水紙進(jìn)行固相發(fā)酵；更佳的，所述靜置開放式培養(yǎng)過程中，在培養(yǎng)基上面覆蓋多層厚度為0. I 0. 3_/層，在所述固相培養(yǎng)基的營養(yǎng)液中浸泡至飽和的無菌吸水紙進(jìn)行固體發(fā)酵。本發(fā)明的蟬擬青霉分生孢子粉可通過下述步驟分離、收集(I)培養(yǎng)物烘干將培養(yǎng)物整體倒入沸騰干燥機(jī)，脫水烘干；(2)培養(yǎng)物粗粉碎將烘干的培養(yǎng)物進(jìn)行粗粉碎，使孢子從培養(yǎng)物上脫落；(3)孢子分離開啟旋風(fēng)收集器，將孢子與培養(yǎng)物分離，使孢子從管道中進(jìn)入收集室;(4)孢子收集孢子從管道中進(jìn)入收集室，在收集室頂端通過微風(fēng)裝置將孢子吹至收集室底部收集袋，獲得蟬擬青霉孢子粉。體外抗腫瘤活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明的蟬擬青霉分生孢子加入各種人癌細(xì)胞的培養(yǎng)液中，對(duì)人胃癌、人宮頸癌、人膠質(zhì)瘤、人胰腺癌、人白血病、人回盲腸癌或人橫紋肌肉瘤的増殖具有一定的抑制作用。最優(yōu)的，對(duì)人胰腺癌具有很好的抑制效果，且抑制作用存在劑量關(guān)系，抑瘤作用的原因可能與誘導(dǎo)細(xì)胞自噬及損傷腫瘤細(xì)胞膜，改變細(xì)胞形態(tài)，破壞細(xì)胞膜完整性及阻滯細(xì)胞周期，抑制細(xì)胞増殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡或壞死性凋亡等有夫。因此，本發(fā)明的蟬擬青霉分生孢子可作為主要藥效成分或主要藥效成分之一的原料廣泛應(yīng)用于抗腫瘤藥物的制備，為抗腫瘤藥物提供了新的來源。


圖I :蟬擬青霉孢子粉對(duì)人胰腺癌SW1990細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響(A :空白對(duì)照；B_F 孢子粉；G 5-氟尿嘧啶)
圖2 :蟬擬青霉孢子粉對(duì)人宮頸癌Hela細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響(A :空白對(duì)照；B_F :孢子粉；G 5-氟尿嘧啶圖3 :蟬擬青霉孢子粉對(duì)人回盲腸癌Ccl-244細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響(A :空白對(duì)照；B-F :孢子粉；G :5_氟尿嘧啶)圖4 :蟬擬青霉孢子粉對(duì)人橫紋肌肉瘤RD細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響(A :空白對(duì)照；B_F 孢子粉；G 5-氟尿嘧啶)圖5 :蟬擬青霉孢子粉對(duì)人膠質(zhì)瘤LN229細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響(A :空白對(duì)照；B_F :孢子粉；G :環(huán)磷酰胺)圖6 :蟬擬青霉孢子粉對(duì)人胃癌HGC27細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響(A :空白對(duì)照；B_F :孢子粉；G 5-氟尿嘧啶)圖7 :孢子粉對(duì)人胰腺癌SW1990細(xì)胞周期的影響(A :空白對(duì)照；B lmg/ml孢子粉； C 5uM 5-氟尿嘧啶)圖8 :孢子粉對(duì)人白血病K562細(xì)胞周期的影響(A :空白對(duì)照；B lmg/ml孢子粉；C 5uM5-氟尿嘧啶)圖9 :孢子粉對(duì)人宮頸癌Hela細(xì)胞周期的影響(A :空白對(duì)照；B lmg/ml孢子粉；C 5uM5-氟尿嘧啶)
具體實(shí)施例方式下面通過具體實(shí)施例進(jìn)ー步描述本發(fā)明的技術(shù)方案。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例所用到的實(shí)驗(yàn)藥品、儀器如下I.實(shí)驗(yàn)藥品藥品名稱藥品來源
權(quán)利要求
1.蟬擬青霉分生孢子在制備抗腫瘤藥物中的用途。
2.如權(quán)利要求I所述的用途，其特征在于，蟬擬青霉分生孢子作為所述抗腫瘤藥物的主要藥效成分或主要藥效成分之一的原料應(yīng)用于抗腫瘤藥物的制備。
3.如權(quán)利要求I所述的用途，其特征在于，所述的抗腫瘤藥物為抗胃癌、抗宮頸癌、抗膠質(zhì)瘤、抗胰腺癌、抗白血病、抗回盲腸癌或抗橫紋肌肉瘤的藥物。
4.一種抗腫瘤藥物，含有治療有效量的蟬擬青霉分生孢子及藥學(xué)上可接受的載體。
5.如權(quán)利要求4所述抗腫瘤藥物，其特征在于，所述治療有效量蟬擬青霉分生孢子與藥學(xué)上可接受載體的總重量比例為I : 0.5-1 2。
6.如權(quán)利要求4所述抗腫瘤藥物，其特征在于，所述抗腫瘤藥物的劑型選自片劑、膠囊劑、顆粒劑、糖漿劑、透皮吸收劑或噴霧劑。
7.如權(quán)利要求4所述抗腫瘤藥物，其特征在于，所述蟬擬青霉分生孢子由下列步驟培養(yǎng)獲得 (1)斜面菌種制備將蟬擬青霉菌株接種到斜面培養(yǎng)基上，20 25°C下，培養(yǎng)3 5天; (2)種子液的制備從斜面上刮取菌絲接種到以PDA液體為基礎(chǔ)的液體培養(yǎng)基中，20 25°C下，140 160rpm,培養(yǎng)3 5天制得蝶擬青霉種子液； (3)將步驟2)中制得的蟬擬青霉種子液按重量百分比為10 15%接入液體培養(yǎng)基中，在20 25°C下，140 160rpm，振蕩發(fā)酵3 5天； (4)將步驟3)中制得的發(fā)酵液按重量百分比為3 10%接入滅菌后的固相培養(yǎng)基中，在溫度為18 25°C，濕度為50 90%的條件下，靜置開放式培養(yǎng)15 25天； (5)孢子的分尚與收集。
8.如權(quán)利要求7所述的的抗腫瘤藥物，其特征在于，步驟(4)中所述固相培養(yǎng)基，其原料及組分為 麩皮 20 45重量份； 玉米粉 5 30重量份； 鹿糖 0. 5 5重量份； 蠶蛹粉 0. 5 5重量份； KNO3 0. I 3重量份； KH2PO4 0. 05 I重量份； MgSO4 0. 05 0. 8 重量份； H2O25 70重量份。
9.如權(quán)利要求7所述的抗腫瘤藥物，其特征在于，步驟(4)中所述固相培養(yǎng)基的另一原料組分為 麩皮 40 70重量份； 營養(yǎng)液 30 60重量份； 貝殼粉 0.01 2重量份； 蠶蛹粉 0. 01 5重量份； 其中，所述營養(yǎng)液中含有的組分名稱及其重量百分比為 KNO30. I 5% ;庶糖I 20% ；KH2PO40.05 3%;MgSO40.01 0.5%; 朽1檬酸銨0. 01 0. 1% ；H2O余量。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種蟬擬青霉分生孢子在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明首次將蟬擬青霉分生孢子應(yīng)用于抗腫瘤藥物的制備。體外實(shí)驗(yàn)表明，蟬擬青霉分生孢子對(duì)多種人腫瘤細(xì)胞具有明顯的抑制作用，且抑制效果存在劑量關(guān)系。本發(fā)明為抗腫瘤藥物的制備提供了新的來源。
文檔編號(hào)A61P35/02GK102755357SQ20111011191
公開日2012年10月31日 申請(qǐng)日期2011年4月29日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月29日
發(fā)明者孫長勝, 王玉芹, 蓋悅, 譚悠久, 陳祝安 申請(qǐng)人:上海泛亞生命科技有限公司