專利名稱：含蛋白標(biāo)簽的sumo融合蛋白及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)，涉及蛋白質(zhì)的翻譯后修飾，尤其是SUMO化修飾及其檢測。
背景技術(shù)：
I. SUMO的發(fā)現(xiàn)和同源性
在細胞的翻譯過程中，一些靶蛋白可以被修飾物修飾。研究表明翻譯后修飾可以決定靶蛋白的命運和功能[1]，其中包括泛素和SUM0。2004諾貝爾化學(xué)獎的頒發(fā)給以色列科學(xué)家阿龍·切哈諾沃、阿夫拉姆·赫什科和美國科學(xué)家歐文·羅斯，以表彰他們發(fā)現(xiàn)了泛素(ubiquitin)調(diào)節(jié)的蛋白質(zhì)降解。翻譯后修飾領(lǐng)域得到應(yīng)有的肯定和重視。SUMO，ISG15，NEDD8 都被稱作 ULM(Ubiquitin like domain)，他們在三維結(jié)構(gòu)以及修飾方式上與泛素高度一致[2]。SUMO是近IlKDa的蛋白，在結(jié)構(gòu)上類似于泛素并且同樣被連接到靶蛋白的賴氨酸上。SUMO的同源物Smt3最早在釀酒酵母的遺傳突變篩選中發(fā)現(xiàn)。在1996年，在后來1999年諾貝爾獎得主Blobel的實驗室最早發(fā)現(xiàn)SUMO (Smt3)能夠共價的結(jié)合一個小G蛋白的激活蛋白RANGAP1 [3]，影響了此蛋白在細胞核與核質(zhì)的運輸，隨后第一次將此類小蛋白命名為SUMO(Smallubiquitin-like modifiers,類泛素化小蛋白類泛素化小蛋白[4]，然后SUMO化修飾在多種生命過程，在多種生物體(酵母，昆蟲，線蟲甚至高等脊椎動物中被發(fā)現(xiàn)[5]，得到闡釋。在低等的真核生物如釀酒酵母，昆蟲，線蟲中只有一種SUMO基因表達，在植物中有8種之多[6]。SUMO在真核生物中有很好的保守性[I]。在脊椎動物中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了 4種SUMO的同源物SUMOl (Smt3c,PICl,GMPl, sentrin或 Ubll)，SUM02 (Smt3a 或 Sentrin3)，SUM03 (Smt3b 或 Sentrin2)，以及通過基因組范圍掃描預(yù)測得到的SUM04[7]，現(xiàn)在還并不確切知道SUM04的表達和功能。其中SUM02和SUM03只是在N端的三個氨基酸殘基有差別，有時它們亦稱為SUM02/3，與SUMOl在序列上有50%的同源性，但已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了在功能上的差別[8，9]?，F(xiàn)階段的研究主要集中SUMOl的共價修飾作用，而在[8]推測可能SUM02/3可能具有更大范圍修飾的靶目標(biāo)蛋白，而且除了 RANGAP1被SUMOl特異性的修飾外[8]，更多的情況依賴于細胞環(huán)境中的SUMOl和SUM02底物的相對數(shù)量，以及細胞所受的外界壓力(stress)?，F(xiàn)階段，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了大量的蛋白質(zhì)存在SUMO化的過程，包括染色質(zhì)的組裝，蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄，RNA代謝過程[10-13]。研究蛋白的SUMO化已經(jīng)成為了當(dāng)前研究蛋白質(zhì)翻譯后修飾的重要組成部分。同泛素一樣，所有的Ubls通過多個酶的級聯(lián)作用實現(xiàn)對靶蛋白的共價修飾，包括T Ubl激活酶(El)，Ubl轉(zhuǎn)移酶(E2)和具有特異性的Ubl連接酶(E3)。SUMO具有相同的修飾機理。新翻譯的SUMO蛋白在C端被剪切從而形成具有GG末端的成熟形式，這種剪切在酵母中有 Ulpl (Ubiquitin-1 ike-protein-specific proteases,泛素樣蛋白特異性蛋白酶)催化，在哺乳動物中則有SENPs (sentrin-specific proteases, sentrin特異性蛋白酶)剪切完成[14]。所有的SUMO化修飾公用同樣的El活化酶和E2接合酶。這兩種酶在結(jié)構(gòu)和催化方式上與泛素化酶系統(tǒng)類似[15]。酵母的El酶是由Aoslp (在脊椎動物中叫做SaeI)和Uba2p (在脊椎動物中叫做SaeII)組成的異質(zhì)二聚體[16]。Aoslp-Uba2p催化作用下成熟形式的SUMO的C端和Uba2p形成了硫酯鍵從而使SUMOl得到活化，此過程消耗一個 ATP[17]。2. SUMO和疾病之間的關(guān)系SUMO化從分子水平、細胞水平、甚至發(fā)育的個體水平影響各種生命活動過程，下面簡要介紹下SUMO和疾病之間的關(guān)系[18]對許多蛋白來講，被SUMO共價結(jié)合對自身的功能調(diào)節(jié)是很重要的?，F(xiàn)在已經(jīng)被證明可以被SUMO化的底物中有很多是與疾病相關(guān)的，例如癌癥、亨廷頓癥、阿爾茨海默病、帕金森、脊髓小腦性共濟失調(diào)和肌萎縮側(cè)壁增生等[19]。SUMO 和癌癥
一系列研究都指出SUMO化在腫瘤發(fā)生中有作用[18]。例如在許多人類癌癥中都有發(fā)現(xiàn)UBC9水平的升高，并且過表達UBC9會促進癌細胞的生長[19]。在一些類型的癌癥中SUMO E3酶PIAS3也有高的表達[20]，并且患有低生存率肝癌病人的腫瘤中SUMO El酶的蛋白水平也有所提高[21]。另外，許多腫瘤抑制因子的活性受SUMO化的調(diào)節(jié)，比如p53、p63、p73和Mdm2 [22]。另外，去SUMO化酶SENP在前列腺癌和甲狀腺癌中的水平提高[23]。SUMO和神經(jīng)退行性疾病許多在神經(jīng)退行性疾病中有重要作用的蛋白都可以被SUMO化。這些神經(jīng)退行性疾病及相關(guān)蛋白包括亨廷頓癥(huntingtin),脊髓小腦性共濟失調(diào)(ataxin_l),帕金森癥(tau, a-synuclein, DJ-1),阿爾茨海默癥(tau, APP)。APP阿爾茨海默病是最常見的老年神經(jīng)性疾病，它能降低人的認(rèn)知能力?，F(xiàn)在普遍認(rèn)為APP通過淀粉樣蛋白水解途徑產(chǎn)生Ab蛋白是阿爾茨海默產(chǎn)生的原因。而APP蛋白則在體外被證明是SUMO的靶蛋白，而其N端的b-secetase的酶切位置K587或K595可以被SUMOl和SUM02修飾。K587和K595的缺失則增加了 A_beta蛋白的聚集[24]暗示了 sumo化可以降低A-beta的聚集水平。進一步的實驗證明過表達SUMO E2酶UBC9可以提高APP的sumo化并降低A-beta的聚集。因此，干預(yù)APP的SUMO化反應(yīng)可以提供另一種治療阿爾茨海默病的方法。亨廷頓癥亨廷頓癥病人的蛋白huntingtin的N端有過多的多聚谷氨酸，由此導(dǎo)致了一些神經(jīng)效應(yīng)，包括運動功能的降低和認(rèn)知功能的缺陷。已經(jīng)證明huntingtinde在N端的Lys6、Lys9和Lysl5位點可以被SUMO化。這些位點的SUMO化被認(rèn)為可以降低huntingtin的聚集和提高huntingtin的穩(wěn)定性,從而降低Poly-Q介導(dǎo)的多聚體的毒性[25]。DJ-IDJ-I的功能包括抗氧化，轉(zhuǎn)錄促進因子和分子伴侶，在早發(fā)性帕金森病中有1-2%是由DJ-I的突變引起的。DJ-I的K130位點可以被SUMO化，被SUMO修飾的DJ-I的Ras依賴的轉(zhuǎn)化和細胞生長促進活性，并且能夠使細胞抵抗UV引起的細胞凋亡[26]。3.目前檢測SUMO化的方法 SUMO化修飾對靶蛋白的功能起著重要的調(diào)節(jié)作用，鑒定特定的蛋白在特定的條件下是否能被SUMO修飾就變的異常重要。最直接最充分的方法是將內(nèi)源的蛋白IP后用質(zhì)譜分析。其次的方法是將內(nèi)源蛋白IP后用SUMO抗體做WesternBlot檢測。但是對于大部分的修飾靶蛋白來說只有很少比例的蛋白可以被修飾，使得上述兩種方法都有困難，所以細胞過表達SUMO來增強靶蛋白的修飾是很多檢測方法所采用的[27]。用過表達標(biāo)簽SUMO融合蛋白與質(zhì)譜聯(lián)用的方法是高通量檢測蛋白翻譯后修飾的常見思路，比如6His-SUM0的融合蛋白方法[28]，但這種方法的一個缺點是由于鎳柱純化His融合蛋白時與SUMO非共價結(jié)合的蛋白也可能純化下來而被檢測導(dǎo)致假陽性太多。解決的這個問題的辦法是在變形條件下用鎳柱來純化，這樣可有效去除和SUMO非共價結(jié)合的蛋白，例如含有SIM的蛋白等[27]。但是使用鎳柱本身系統(tǒng)性問題還存在，鎳柱的純化原理是非共價結(jié)合，和哺乳動物細胞裂解液會有非共價結(jié)合從而導(dǎo)致假陽性，如果用更加嚴(yán)格的變形條件會使鎳柱純化效率降低而遺漏部分可能的底物。3. I.體外SUMO化檢測體系A(chǔ).用兔網(wǎng)織紅細胞轉(zhuǎn)錄翻譯體系表達被檢測蛋白，然后用western blot來檢測目的蛋白是否會有遷移條帶出現(xiàn)[29]。 B.在體外純化SUMO酶EI (SAEI，SAEII)、E2、Ubc9和待檢測的底物，然后在緩沖液中30°C反應(yīng)或者4°C過夜，western檢測[30]。3. 2.細胞內(nèi)檢測體系A(chǔ). 6Hi s-SUMO 純化[30]將Tag-底物和His6_SUM0的表達克隆轉(zhuǎn)染進選定的細胞株內(nèi)，培養(yǎng)36h后裂解細胞，用Ni+柱將SUMO及其SUMO結(jié)合物純化下來,并用抗-tag的抗體western檢測目的條帶。B. 6Hi s-SUMO 穩(wěn)定細胞株[27]此方法是將6His_SUM0整合進目的細胞株基因組，形成穩(wěn)定的表達株，然后就可以用上述A方法只用轉(zhuǎn)染目的蛋白就可以，也可以不用轉(zhuǎn)染直接檢測生理條件下全細胞被SUMO化的蛋白，前提是要有對應(yīng)蛋白的抗體。C. PRET 方法[31]以上的方法均是以western為基礎(chǔ)，而Calsion[31]所發(fā)展的方法則是以時間分辨熒光共振能量轉(zhuǎn)移(TR-FRET)為基礎(chǔ)的試驗方法檢測的，在SUMO上連上標(biāo)記FI，當(dāng)?shù)孜锉籗UMO修飾后，抗底物上tag的抗體上的Tb激發(fā)Fl從而可以被檢測到，這種方法特別適合于高通量篩選底物。4.常用蛋白標(biāo)簽(Tag)目前蛋白Tag的主要作用是用來蛋白純化和顯影葡萄球菌蛋白A (Protein A)和LacZ是最早用來親和純化蛋白的兩個標(biāo)簽,蛋白A是具有280個氨基酸的肽段，可以增強異源蛋白的穩(wěn)定性和表達量，但是由于需要用IgG來親和層析并且在PH比較低的條件下純化，對融合蛋白的功能活性會有影響并且使用免疫方法分析蛋白復(fù)雜化。LacZ，也叫β_半乳糖苷酶，是具有蛋白水解穩(wěn)定性的1024個氨基酸的肽段，可以和固定化的APTG親和層析而得到純化，但是由于蛋白太大會影響融合蛋白的功能活性而且在純化條件下容易形成四聚體而現(xiàn)在不常用于蛋白純化[32]。His標(biāo)簽最早在1991年His標(biāo)簽與被固定的金屬離子被用于純化半乳糖脫氫酶。一般常用的是6His標(biāo)簽，它可以和二價的金屬離子相互非共價結(jié)合從而將融合蛋白純化出來，事實上2-10個His都可以用來與金屬離子結(jié)合，金屬離子包括Co2+，Cu2+，Ni2+，Zn2+，Ca2+甚至Fe3+，其中以固定化的Ni2+最為常用，對于不同的蛋白也可根據(jù)經(jīng)驗來選擇金屬離子。His tag由于很小很少對蛋白的功能造成影響，在原核表達體系中是比較理想的純化標(biāo)簽，但是在昆蟲和哺乳動物表達體系中由于很多蛋白具有多His序列導(dǎo)致純化的背景很強，所以不適于用于昆蟲和哺乳動物表達體系。谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(GST)蛋白標(biāo)簽pGEX蛋白純化系統(tǒng)被廣泛采用，此質(zhì)粒編碼谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶的N端肽段——通常所說的GST蛋白標(biāo)簽[34]。GST融合蛋白可以和谷胱甘肽瓊脂柱相結(jié)合而得到層析純化，但是由于細胞裂解液中的Y-谷酰基轉(zhuǎn)肽酶對谷胱甘肽的影響，谷胱甘肽親和柱使用壽命有限，只能重復(fù)使用4-20次。另外，26kDa的GST還可以在結(jié)合柱上從融合蛋白上移除，從而得到感興趣的蛋白[32]。GST標(biāo)簽的缺點是表達的融合蛋白容易形成包涵體，由于GST與谷胱甘肽的結(jié)合需要三維結(jié)構(gòu)，所以還要將包涵體復(fù)性才能得到純化。另外就是GST標(biāo)簽比較大，而且還容意形成二聚體，會對融合蛋白的功能活性有所影響。
麥芽糖結(jié)合蛋白-MBP標(biāo)簽?zāi)軌蚓幋aMBP融合蛋白的E. Coli表達系統(tǒng)pMAL在1988年建立[35]。麥芽糖結(jié)合蛋白分子量45kDa，可以促進融合蛋白的表達量和可溶性。MBP融合蛋白一般用商業(yè)化的淀粉交聯(lián)柱來親和純化，和谷胱甘肽柱一樣，細胞裂解液也能減少淀粉交聯(lián)柱的使用壽命，一般可以只使用3-5次。和GST—樣，由于MBP分子量比較大，也會對融合蛋白的功能活性有影響。另外，MBP不能直接在純化柱上切下，只能在游離的蛋白中切除，隨后去除游離MBP有增加了蛋白純化的復(fù)雜度。幾丁質(zhì)內(nèi)含子結(jié)合蛋白(Intem-Chitin Binding Domain, Intein-CBD)Intein-CBD是可以自我剪切而不需要外加蛋白酶就可以得到原生蛋白的蛋白標(biāo)簽，來自與幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白的內(nèi)含子。Intein-CBD大腸桿菌表達質(zhì)粒系統(tǒng)在1997年建立[36]。CBD融合蛋白可以通過和幾丁質(zhì)樹脂結(jié)合而得到純化，商業(yè)化的幾丁質(zhì)樹脂可以至少重復(fù)利用五次，非特異性的結(jié)合可以用高鹽或去垢劑洗除。幾丁質(zhì)內(nèi)含子的剪切需要在50mM DTT條件下4攝氏度過夜。Avi標(biāo)簽:AviTag蛋白是含有15個氨基酸的肽段，可以被體內(nèi)或體外的生物素連接酶生物素化，而且抗生物素蛋白或鏈霉親和素可以專一地與生物素結(jié)合，基于這兩個反應(yīng)，AviTag 技術(shù)可以應(yīng)用于蛋白的固定，純化和顯影[37，38]。固定化的AviTag標(biāo)簽融合蛋白的應(yīng)用廣泛，包括從高通量篩選到表面等離子體共振檢測蛋白間相互作用等方面。與抗生物素或鏈霉親和素結(jié)合之后，AviTag標(biāo)簽融合蛋白就可以被多種方法檢測，例如Western Blots和T細胞染色與分選中的MHC四聚體。SNAP標(biāo)簽SNAP蛋白標(biāo)簽是分子量為20kDa 06-烷基鳥嘌呤-DNA烷基轉(zhuǎn)移酶的突變蛋白，可以用06-烷基鳥嘌呤來共價標(biāo)記。和其他標(biāo)記標(biāo)簽相比，SNAP在細胞內(nèi)特異性標(biāo)記不受細胞分區(qū)的影響，并且不需要添加額外的試劑[40]。SNAP所帶的活性巰基位點可以接受了苯甲基鳥嘌呤所攜帶的側(cè)鏈苯甲基基團，釋放出了鳥嘌呤，這種新的硫醚鍵共價結(jié)合使SNAP所帶的目的蛋白攜帶上了苯甲基基團所帶的標(biāo)記物。苯甲基鳥嘌呤在生化條件下穩(wěn)定，并且沒有其他蛋白會和這類物質(zhì)作用，所以SNAP標(biāo)簽反應(yīng)是高特異的[41]。除了熒光標(biāo)記，還可以事先將SNAP標(biāo)簽的底物一苯甲基鳥嘌呤固定在基質(zhì)表面或純化柱上，然后混合提取液中的融合蛋白即可特異與底物作用，形成共價鍵，融合蛋白間接固定在了基質(zhì)表面或純化出蛋白[42]。Halo標(biāo)簽HaloTag 標(biāo)簽蛋白是一種齒化烷脫齒素酶的遺傳修飾衍生物，原生酶的分子量為33KDa的單體蛋白，可以切除鹵代脂肪族化合物中的碳鹵鍵，通過鹵代烷烴對酶Aspl06位的親核攻擊從而在Halo配體和Halo蛋白之間形成共價酯鍵，由于Halo蛋白在催化三聯(lián)體中有一個關(guān)鍵突變(His272突變?yōu)镻he)從而使此酯鍵不會水解而得到穩(wěn)定[43]。Halo蛋白標(biāo)簽?zāi)苋诤显谥亟M蛋白的N端或C端,并在原核或真核系統(tǒng)中表達。Halo標(biāo)簽的配體由兩個關(guān)鍵組分組成一個通用的HaloTag反應(yīng)聯(lián)結(jié)子,結(jié)合HaloTag蛋白；另一個是功能基團，例如熒光 染料或親和媒介，從而使Halo標(biāo)簽具有蛋白定位顯影標(biāo)記和富集等作用[44，45]。在文章[30]中作者將Tag-底物和His6-SUMO的表達克隆轉(zhuǎn)染進選定的細胞株內(nèi)，培養(yǎng)36h后裂解細胞，用Ni+柱將SUMO及其SUMO結(jié)合物純化下來，并用抗-tag或感興趣蛋白的抗體western檢測目的條帶的遷移可以確定待檢測蛋白是否具有被修飾的能力。由于6His標(biāo)簽和Ni +柱的結(jié)合是非共價結(jié)合，用此種方法拉下來的總蛋白中總會有沒有被SUMO化修飾的蛋白，比如說含有SIM(SUMO-Interaction-Motif)的蛋白和與SUMO修飾蛋白相互作用的蛋白[27]。在文章[27]中，作者在變性的條件下用6His和Ni+柱純化體系來去除非特異性結(jié)合蛋白，但是此條件下有可能降低Ni+純化效率。這個問題的一個解決辦法就是通過采用共價結(jié)合方法來富集總蛋白的標(biāo)簽來和SUMO融合從而在變性條件下去除非與SUMO非共價結(jié)合的雜蛋白并且不會影響被修飾總蛋白的富集效果。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種如下所示的融合蛋白Tag-SUMO其中，Tag表示蛋白標(biāo)簽，選自Avi標(biāo)簽，SNAP標(biāo)簽和Halo標(biāo)簽，SUMO即類泛素化小蛋白，所述融合蛋白具有SUMO化能力。實施方式之一中，所述融合蛋白包含有柔性連接肽，如下所示Tag-L-SUMO其中，L表示柔性連接肽。柔性連接肽的作用在于避免蛋白標(biāo)簽和SUMO之間在空間上相互干擾，是融合蛋白技術(shù)中的常用技術(shù)和常用元素，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在大量現(xiàn)成的柔性連接肽中進行選擇，也可根據(jù)普遍原則和具體需要方便地自行設(shè)計。例如，本發(fā)明采用9個氨基酸的柔性連接肽。實施方式之一中，本發(fā)明選用了 SSGLVPRGS所示的柔性連接肽。如前所述，SUMO分子在結(jié)構(gòu)上與高度一致，具有相同的修飾機理。因此，本發(fā)明SUMO可選用任一類泛素化小蛋白，尤其是其成熟形式。實施方式之一中，SUMO部分是人類SUMOl的成熟形式(NCBI登錄號NP_001005781的蛋白質(zhì)，登錄號NM_001005781的編碼核酸(mRNA)，http://www. ncbi. nlm. nih. gov/protein/54792065 from = l&to = 97&report=gpwithparts)其編碼核苷酸序列為atgtctgaccaggaggcaaaaccttcaactgaggacttgggggataagaaggaaggtgaatatattaaactcaaagtcattggacaggatagcagtgagattcacttcaaagtgaaaatgacaacacatctcaagaaactcaaagaatcatactgtcaaagacagggtgttccaatgaattcactcaggtttctctttgagggtcagagaattgctgataatcatactccaaaagaactgggaatggaggaagaagatgtgattgaagtttatcaggaacaaacggggggt (SEQ IDNO 12)。本發(fā)明還提供一種核酸分子，可以是編碼本發(fā)明融合蛋白的核酸分子或其互補鏈。本發(fā)明還提供一種載體，加載了以上所述的核酸分子，優(yōu)選表達載體，例如原核生物表達載體，即能夠在原核宿主細胞內(nèi)表達目標(biāo)蛋白的載體，和哺乳動物表達載體，即能夠在哺乳動物細胞內(nèi)表達目標(biāo)蛋白的載體，這些都是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟悉的。本發(fā)明還提供一種在體外SUMO化修飾體系中檢測SUMO化的方法，包括在體外SUMO化修飾體系中，將被檢測蛋白與本發(fā)明的Tag-L-SUMO融合蛋白接觸，然后檢測被檢測蛋白的SUMO化產(chǎn)物。體外SUMO化修飾體系之前已經(jīng)建立，是將SUMO化修飾酶體系中的Ubl激活酶(El)(脊椎動物中的SaeI和SaeII)與Ubl轉(zhuǎn)移酶(E2) (Ubc9)分別體外純化，最后將SUMOl和待檢測的靶蛋白加入該體系進行反應(yīng)[46] 檢測蛋白SUMO化產(chǎn)物的方法也是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟悉的，例如免疫沉淀(IP)、質(zhì)譜(MS)、WesternBlot檢測、時間分辨熒光共振能量轉(zhuǎn)移法(TR-FRET)、電泳、蛋白質(zhì)或肽或其它標(biāo)簽法、親和及其它層析、免疫熒光，以及它們的聯(lián)用等。本發(fā)明還提供一種體外檢測SUMO化的系統(tǒng)，包含本發(fā)明的Tag-L-SUMO融合蛋白，純化的Ubl激活酶(El)，Ubl轉(zhuǎn)移酶(E2)和Ubc9,以及SUMO化反應(yīng)緩沖液[30]?？梢詫⑺鱿到y(tǒng)包裝為試劑盒的形式，其中包括裝有上述組分的容器和關(guān)于使用該試劑盒體外檢測SUMO化的說明。本發(fā)明還提供一種細胞內(nèi)檢測SUMO化的方法，包括用編碼本發(fā)明的Tag-L-SUMO融合蛋白的核酸分子，可選的編碼Ubc9的核酸分子和/或可選的編碼待檢測蛋白的核酸分子共轉(zhuǎn)染宿主細胞，培養(yǎng)宿主細胞，裂解細胞，檢測被檢測蛋白的SUMO化產(chǎn)物。生理條件下檢測蛋白SUMO化是不需要共轉(zhuǎn)染過表達Ubc9和待測蛋白的，如參考文獻[39，Kim, 2006]和[13，Tatham, 2009]所述。所述宿主細胞優(yōu)選動物細胞，例如Hela細胞。轉(zhuǎn)染動物細胞的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟悉，例如Lip0-Plus轉(zhuǎn)染法。實施方式之一中，還包括在檢測蛋白SUMO化產(chǎn)物之前通過免疫沉淀或親和層析步驟處理細胞裂解物。通過用免疫沉淀\親和層析\磁珠純化方法處理細胞裂解液可以進一步的富集待檢測底物，便于后續(xù)的檢測。實施方式之一，細胞內(nèi)檢測SUMO化的方法包括(I).將被檢測蛋白的ORF裝載到表達載體中，優(yōu)選Mll，⑵.將步驟⑴制備的載體同本發(fā)明的Tag-L-SUMO融合蛋白和Ubc9的表達載體一同轉(zhuǎn)染到宿主細胞中，優(yōu)選Hela細胞，所述融合蛋白優(yōu)選SNAP-L-SUM0或Halo-L-SUMO融合蛋白，(3).培養(yǎng)細胞以獲得各蛋白的表達，⑷.收細胞后檢測被檢測蛋白的SUMO化產(chǎn)物，例如通過電泳(例如PAGE膠)和免疫熒光方法鑒定是否有蛋白條帶遷移來檢測SUMO化產(chǎn)物。本發(fā)明還提供一種檢測細胞內(nèi)SUMO化的系統(tǒng)，包含編碼本發(fā)明的Tag-L-SUMO融合蛋白的表達質(zhì)粒，可選的編碼Ubc9的表達質(zhì)粒和轉(zhuǎn)染試劑。所述融合蛋白優(yōu)選SNAP-L-SUM0或Halo-L-SUMO融合蛋白。所述轉(zhuǎn)染試劑指完成轉(zhuǎn)染所需的各種輔劑，例如轉(zhuǎn)染誘導(dǎo)劑、強化劑等，例如Lip0-Plus轉(zhuǎn)染法中的Iipo轉(zhuǎn)染劑和plus轉(zhuǎn)染劑?？梢詫⑺鱿到y(tǒng)包裝為試劑盒的形式，其中包括裝有上述組分的容器和關(guān)于使用該試劑盒體外檢測SUMO化的說明。本發(fā)明還提供一種篩選SUMO化蛋白底物的方法，包括提供作為SUMO化底物的候選蛋白，優(yōu)選在高置信條件下用預(yù)測蛋白的被SUMO化能力的分析軟件篩選作為SUMO化底物的候選蛋白，檢測候選蛋白的SUMO化，所述檢測采用本發(fā)明所述在體外SUMO化修飾體系中檢測SUMO化的方法，或者采用本發(fā)明所述細胞內(nèi)檢測SUMO化的方法，或者兩者的聯(lián)用，若檢測到候選蛋白的SUMO化產(chǎn)物，表明候選蛋白是SUMO化蛋白底物。本發(fā)明還提供一種檢測細胞內(nèi)可被SUMO修飾的靶蛋白的方法，包括
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在細胞內(nèi)重組表達SNAP-SUM0融合蛋白，將細胞裂解液與結(jié)合、優(yōu)選共價結(jié)合所述融合蛋白中標(biāo)簽的載體接觸，所述載體優(yōu)選微載體，例如珠?？蛇x性地包括在變性條件下去除非特異非共價結(jié)合的雜蛋白，所述變性條件是指在純化過程中可以使用任何嚴(yán)格的條件使非共價結(jié)合的蛋白洗除得到低背景的質(zhì)譜結(jié)果。這樣的變形條件是本領(lǐng)域技術(shù)人員所知道的，例如SNAP使用中的變性條件[見前文]。His等非共價純化則不能使用此條件。分析與載體接觸的祀蛋白信息,例如采用WesternBlot或者MS等方法。本發(fā)明所述Tag-L-SUMO融合蛋白或編碼本發(fā)明Tag-L-SUMO融合蛋白的核酸分子可用于制造診斷SUMO化相關(guān)疾病的制劑的用途，所述疾病例如癌癥、亨廷頓癥、阿爾茨海默病、帕金森、脊髓小腦性共濟失調(diào)和肌萎縮側(cè)壁增生。本發(fā)明采用的是不同于6His純化的標(biāo)簽Avi，SNAP和Halo。Avi生物素化后有非常強的親和力，甚至強于某些共價鍵；SNAP和Halo是最近常用的細胞內(nèi)顯影蛋白標(biāo)簽，可以和底物形成共價鍵從而得以純化和標(biāo)記。用共價鍵純化系統(tǒng)要比His變性體系方法步驟簡單并且理論上有更少的假陽性。本發(fā)明建立了 SNAP標(biāo)簽融合SUMO蛋白的方法來檢測可被SUMO修飾的靶蛋白。SNAP標(biāo)簽在生物學(xué)上可用于顯色標(biāo)記、蛋白純化，本方法的基本原理為在細胞內(nèi)表達SNAP-SUM0融合蛋白一段時間后用可與SNAP標(biāo)簽共價結(jié)合的珠粒(Beads)拉出所有被SNAP-SUM0修飾的靶蛋白，然后用WesternBlot或者MS進行分析可得到所有靶蛋白信息。相較于其他檢測蛋白SUMO化的方法，此方法在細胞內(nèi)能夠高效的對蛋白進行SUMO化修飾，并能夠利用成熟方法拉出(pull-down)所有被融合蛋白SUMO化修飾的革巴蛋白，還能夠在變性條件下有效去除非特異非共價結(jié)合的其他雜蛋白，從而得到比較準(zhǔn)確的檢測結(jié)果。同時還可以將此方法與質(zhì)譜連用，能夠高通量檢測全細胞蛋白的SUMO化修飾。利用建立的SNAP-SUM0融合蛋白的檢測方法小規(guī)模的從14個轉(zhuǎn)錄因子中篩選出F0XP2和ESXl兩個可以被SUMOl修飾的蛋白，并在體外進行了驗證，第一次闡釋了 SUMO化修飾可能在這兩個蛋白所參與的人類語言形成和生殖系統(tǒng)發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。由此可以預(yù)見，可以通過調(diào)控F0XP2和ESXl的SUMO化來調(diào)控人類語言形成和生殖系統(tǒng)發(fā)育過程。例如，可以預(yù)見，F(xiàn)0XP2和ESXl的SUMO化調(diào)節(jié)劑可用于制備人類語言和精子發(fā)生的藥物。本發(fā)明將Avi，SNAP和Halo標(biāo)簽技術(shù)應(yīng)用到SUMO翻譯后修飾檢測體系中，并且首次在細胞內(nèi)和體外闡釋了這三種標(biāo)簽SUMO融合蛋白對靶蛋白修飾能力和效率的影響。在Hela細胞過表達體系中，用已知的靶蛋白RANGAP1和SARTl作為陽性底物結(jié)果顯示，成熟形式的Avi-L-SUMOl，SNAP-L-SUM01和Halo-L-SUMOl都能夠?qū)Π械鞍仔揎?，而且和不帶蛋白?biāo)簽的SUMOl相比，SNAP-L-SUMOI與Halo-L-SUMOl對底物的修飾能力更強(圖3)，甚至在不用富集的條件下就可以看到修飾的遷移條帶，在Hela細胞過表達體系中四種SUMOl的修飾能力關(guān)系為SNAP-L-SUM01 > Halo-L-SUMOl > Avi-L-SUMOl = SUMOl。用在大腸桿菌中純化的Ubl激活酶(El)，Ubl轉(zhuǎn)移酶(E2)，SUMOls建立的體外修飾體系結(jié)果表明，不帶標(biāo)簽(除去純化標(biāo)簽6His，后同)的SUMOl對每種陽性底物都有很好的修飾活性，但是Avi-L-SUMOl，SNAP- L-SUMO I和Halo-L-SUMOl的修飾依據(jù)底物不同有所改變，比如對Topl-I的修飾能力和SUMOl相當(dāng)，對SARTl的修飾能力弱于SUM01，但對RANGAPI的幾乎檢測不到遷移的修飾條帶(圖2)。這和在Hela細胞過表達的情況差別很大，也決定了此三種標(biāo)簽融合蛋白不適合用于體外SUMO化修飾的檢測，但是可以輔佐證明細胞實驗的結(jié)果。本發(fā)明在Hela細胞過表達體系中證明了 SNAP/Halo-L-SUMOl可以用于SUMO化修飾檢測，并且與SUMOl相比SNAP/Halo-L-SUMOl修飾效率高以至于不用富集直接用裂解液Western就可以檢測到蛋白修飾遷移條帶。此檢測體系相比其它反應(yīng)體系更加簡單通用，很適合小批量的檢測SUMO化底物。本發(fā)明選用效率最高的SNAP-L-SUM01小范圍的篩選SUMO化底物進一步證明該高表達體系的作用。用SUM0sp2.0根據(jù)一些原則選出了 14個人轉(zhuǎn)錄因子(表3)，分別和SNAP-L-SUM01和E2共轉(zhuǎn)染進Hela細胞，篩選到兩個轉(zhuǎn)錄因子F0XP2和ESXl有遷移條帶，進一步用SUMO特異的Ulpl酶切和體外反應(yīng)體系驗證確實是被SNAP-L-SUM01 修飾(圖 4)。F0XP2 (Forkhead Box P2)位于人類染色體7q31，主要剪切體是具有715個氨基酸的Forkhead家族轉(zhuǎn)錄因子。突變的F0XP2能引起嚴(yán)重的遺傳性說話和語言障礙[47]，而同源基因FOXPI，F(xiàn)0XP3, F0XP4在癌癥中起作用[48]。人和黑猩猩的F0XP2在進化中有兩個氨基酸的差別，目前認(rèn)為正是這兩個氨基酸的突變促進了人類的進化加速。馬普人類進化學(xué)院的Svante Paabo通過將人F0XP2兩個氨基酸位點引入到小鼠Foxp2，這些小鼠大體上健康，但是卻有不同性質(zhì)的超聲發(fā)音[49]。相比黑猩猩F0XP2，人類F0XP2在人神經(jīng)細胞中可以顯著的上調(diào)了 61個基因和下調(diào)55geneS，這些基因可能參與人與黑猩猩言語差異的分子機制[50]。有實驗證據(jù)顯示W(wǎng)nt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的Lefl可以與foxP2基因增強子結(jié)合，在CNS發(fā)育過程中Lefl對于foxP2的表達是必須的，說明F0XP2的上游受wnt信號調(diào)控[51] ο Foxp2還可與Nkx2. I的homeodomain相互作用從而抑制了 Nkx2. I介導(dǎo)的SP-C的轉(zhuǎn)錄[52]?，F(xiàn)在發(fā)現(xiàn)了 F0XP2有SUMO化修飾，進一步可以確定SUMO化修飾的具體位點，研究SUMO化可能會改變F0XP2的空間定位或與蛋白質(zhì)相互作用從而控制下游基因的轉(zhuǎn)錄或其它行為，乃至影響到人類語言的形成。人 ESXl (Extraembrionic spermatogenesis homeobox lgene, Xq22. 2)選擇性表達在睪丸、胎盤、腦和肺組織中[53，54]，基因敲除雄性小鼠在精子發(fā)生沒有明顯的缺陷，但是會影響雌性小鼠的胚胎發(fā)育和胎盤大小[55]。人源ESXl和鼠源的Esxl都含有谷氨酸富集的具有同源異形結(jié)構(gòu)域N端和脯氨酸富集的C端。全長的ESX165kDa,可以酶水解為N端45kDa和C端20kDa的兩條肽,N端蛋白定位在核中作為轉(zhuǎn)錄因子而C端肽端在細胞質(zhì)中穩(wěn)定Cyclin[56]。ESXl人和鼠之間有34%的序列差異，這些差異大部分都在C端。生物信息學(xué)分析表明在靈長類動物中ESXlC端的進化速率大于X染色體上的進化速率，屬于陽性選擇，這也表明了 ESXl參與雄性生殖。人源ESXl在培養(yǎng)細胞中能夠阻止有絲分裂Cyclin降解，ESXl的過表達可以使CyclinA和CyclinBI的聚集從而使細胞靜息在M期[57]。ESXl作為SUMO化靶蛋白這一發(fā)現(xiàn)對ESXl進一步的研究提供了新的方向，暗示了 SUMO可能在生殖系統(tǒng)調(diào)控上也發(fā)揮重要作用。用SNAP-L-SUM01在細胞過表達體系中檢測出兩個SUMO化修飾靶蛋白F0XP2和ESXl，在低通量水平上證明了 SNAP-L-SUM01可以用于SUMO化底物的檢測。用SNAP純化珠將過表達細胞體系中所有SNAP-L-SUMO修飾的蛋白富集下來并用質(zhì)譜方法分析可以在高通量水平上檢測整個基因組在特定條件下的SUMO化修飾靶蛋白?？紤]到SNAP的共價親和特性，這種高通量方法理論上比6His標(biāo)簽檢測體系更為精確。


圖I :Tag-L-SUM01s融合蛋白在Hela細胞的表達和在大腸桿菌中的表達純化； (A)顯示 SUMO I、Avi-L-SUMO I、SNAP-L-SUMO I 和 Halo-L-SUMO I 在 Hela 中的過表達，LacZ 為陰性對照；(B)、(C)和(D)分別顯示 Avi-L-SUMOl、SNAP-L-SUMO I 和 Halo-L-SUMOl體外的表達與純化，其中，CC :對照細胞；IC :誘導(dǎo)表達細胞；CS :細胞上清；CP :細胞沉淀；Ft :穿出液；WS :洗脫液；10 :用含濃度為IOmM咪唑的洗脫緩沖液沖洗Beads流出液；250 用含濃度為250mM咪唑的洗脫緩沖液沖洗Beads流出液。圖2 :用體外SUMO化體系檢測SUM01融合蛋白的SUMO化修飾能力。A :檢測SUM01，Avi-L-SUMOl、SNAP-L-SUMO K Halo-L-SUMOl 對靶蛋白 Topl-1-flag 的 SUMO 化修飾能力，SI 為不帶標(biāo)簽蛋白的 SUM01，Avi/SNAP/Halo-Sl 分別表示 Avi-L-SUMO I、SNAP-L-SUMOI、Halo-L-SUMO I ;B :檢測 SUMO 1，Avi-L-SUMO I、SNAP-L-SUMO K Halo-L-SUMOl 對靶蛋白 Flag-SARTl 的 SUMO 化修飾能力；C :檢測 SUM01，Avi-L-SUMOl, SNAP-L-SUM0KHalo-L-SUMOl 對靶蛋白 Flag-RANGAPl 的 SUMO化修飾能力；D :f Iag-RANGAPl 和 Flag-SARTl在體外的表達與純化，其中，CC :對照細胞；IC :誘導(dǎo)表達細胞；CS :細胞上清；CP :細胞沉淀；Ft :穿出液；WS :洗脫液；10 :用含濃度為IOmM咪唑的洗脫緩沖液沖洗Beads流出液；250 :用含濃度為250mM咪唑的洗脫緩沖液沖洗Beads流出液。圖3 :Hela細胞過表達實驗檢測標(biāo)簽-SUM01融合蛋白的SUMO化修飾能力。A :檢測SUM01, Avi-L-SUMOl,SNAP-L-SUM0KHaIo-L-SUMOI 對靶蛋白 Flag-SARTl 的 SUMO 化修飾能力，其中，-:LacZ 質(zhì)粒，SI :無標(biāo)簽 SUM01，Avi-Sl =Avi-L-SUMO 1，SNAP-S I SNAP-L-SUM0LHalo-S I Halo-L-SUM0 I ;B :檢測 SUMO LAvi-L-SUMO I、SNAP-L-SUMO UHalo-L-SUMOI對靶蛋白Flag-RanGAP I的SUMO化修飾能力，其中，-LacZ質(zhì)粒，NT :無標(biāo)簽SUM01，Avi Avi-L-SUMOl, SNAP SNAP-L-SUMO I, Halo Halo-L-SUM0 I。圖4 :在Hela細胞系與體外SUMO化修飾體系證明F0XP2和ESXl可以被SUMO化。A :在Hela細胞過表達體系中Flag-F0XP2可以被SNAP-L-SUM01修飾；B :體外驗證Flag-F0XP2 的 SUMO 化修飾。NT :無標(biāo)簽 SUM01，SNAP SNAP-L-SUMO I ；C :在 Hela 細胞過表達體系中Flag-ESXl可以被SNAP-L-SUM01修飾；D :體外驗證Flag_F0XP2的SUMO化修飾。SNAP-SUM0 I :SNAP-L-SUM0 I。
本發(fā)明的實施方式除非特別說明，本發(fā)明所用術(shù)語的含義均按照相關(guān)領(lǐng)域公知的廣義含義來理解。I.材料與方法I. I質(zhì)粒的構(gòu)建
I. I. I.材料與產(chǎn)物將SUMOl成熟蛋白的編碼序列以EcoRl/XhoI雙酶切位點分別裝載到pET28a和M02 中得到質(zhì)粒 SUM01-pET28a 與質(zhì)粒 SUM01_M02Rx。以 SUM01-M02Rx 為模板用引對 P1/P2PCR 得 linker-SUMOl (人類 SUM01NG011679的成熟形式)的0RF，然后以限制性內(nèi)切酶對ACC65I/NotI消化并分別裝載到預(yù)先酶切好的 M05、M24. Ix 和 M49x 載體中，從而得到 Iinker-SUMO I-MO 5、linker-SUM01_M24· Ix、linker-SUM01-M49x?！發(fā)inker” 或縮寫 “L” 表示柔性連接肽 Avi-1 inker-SUMO l_pET28a、SNAP-Iinker-SUM01-pET28a、Halo-Iinker-SUM01-pET28a 貝丨J 是以 linker-SUM01_M05、linker-SUM01-M24. lx、linker-SUM01_M49x 質(zhì)粒為模板用引物對 P3/P2、P4/P2、P5/P2PCR后限制性內(nèi)切酶消化后裝載到pET28a后得到。人類基因RANGAP1 (NM_002883. I)、F0XP2 (NM_148899)、ESXl (AK097704. I)，SARTl (BC001058. 2)基因模板均從Genecopoeia公司獲得，分別通過引物對P6/P7，P8/P9，P10/P11 裝載到 Mll 和 flag-pET28a 載體中得到質(zhì)粒 FLAG-RANGAPl-pET28a，RANGAPl-Mll，F(xiàn)LAG-ESXI-pET28a,FLAG-F0XP2-pET28aο FLAG_SARTl_pET28a 和 SART1-M11 則通過直接酶切亞克隆獲得。其他質(zhì)粒均從Genecopoeia 公司得到，包括 DID01-M11，EPASl-MlI,MGC29891-M11, MYBL2-M11， NFIL3-M11， L3MBTL-M11, MYEF2-M1I, ESRRG-MlI, ERG-MlI,MLXb-Mll, F0XA2-M11, CREB5-M11, ATF4-M11, F0XM1-M11, LCORL-Ml I, ATF6-M11,FAM48A-M11。載體信息pET28a Jnvitrogen公司，帶6His蛋白標(biāo)簽,用于在大腸桿菌株BL21中用IPTG誘
導(dǎo)蛋白表達純化。MO2Rx :Genecopoeia公司，不帶標(biāo)簽,哺乳動物細胞表達載體,本發(fā)明中用于轉(zhuǎn)染Hela細胞。MO5 Genecopoeia公司，帶N端Avi標(biāo)簽,哺乳動物細胞表達載體，本發(fā)明中用于轉(zhuǎn)染Hela細胞。Mil :Genecopoeia公司，帶N端flag標(biāo)簽,哺乳動物細胞表達載體,本發(fā)明中用于轉(zhuǎn)染Hela細胞。M24. Ix =Genecopoeia公司，帶N端SNAP標(biāo)簽，哺乳動物細胞表達載體，本發(fā)明中用于轉(zhuǎn)染Hela細胞。M49x Genecopoeia公司，帶N端Halo標(biāo)簽,哺乳動物細胞表達載體，本發(fā)明中用于轉(zhuǎn)染Hela細胞。引物信息
權(quán)利要求
1.一種如下所示的融合蛋白Tag-SUMO 其中，Tag表示蛋白標(biāo)簽，選自Avi標(biāo)簽、SNAP標(biāo)簽和Halo標(biāo)簽， SUMO即類泛素化小蛋白； 所述融合蛋白具有SUMO化能力。
2.如權(quán)利要求I所述的融合蛋白，如下所示Tag-L-SUMO 其中，L表示柔性連接肽。
3.如權(quán)利要求2所述的融合蛋白，L是9個氨基酸的柔性連接肽，例如SSGLVPRGS所示的柔性連接肽。
4.如權(quán)利要求I所述的融合蛋白，所述SUMO是人類SUMOl的成熟形式。
5.一種核酸分子，選自編碼權(quán)利要求1-4中任一項所述融合蛋白的核酸分子或其互補鏈。
6.—種載體，加載了權(quán)利要求5所述的核酸分子,優(yōu)選表達載體,例如原核生物載體和哺乳動物表達載體。
7.一種在體外SUMO化修飾體系中檢測SUMO化的方法，包括 在體外SUMO化修飾體系中，將被檢測蛋白與權(quán)利要求1-4中任一項所述的 融合蛋白接觸， 檢測被檢測蛋白的SUMO化產(chǎn)物。
8.—種體外檢測SUMO化的系統(tǒng)，包含權(quán)利要求1-4中任一項所述的融合蛋白，純化的Ubl激活酶(El)，Ubl轉(zhuǎn)移酶(E2)和Ubc9，以及SUMO化反應(yīng)緩沖液，所述系統(tǒng)優(yōu)選試劑盒形式。
9.一種細胞內(nèi)檢測SUMO化的方法，包括 (1)用編碼權(quán)利要求1-4中任一項所述融合蛋白的核酸分子轉(zhuǎn)染宿主細胞； (2)培養(yǎng)宿主細胞，獲得蛋白表達； (3)裂解細胞； (4)檢測被檢測蛋白的SUMO化產(chǎn)物。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其中，步驟I)還包括用編碼Ubc9的核酸分子轉(zhuǎn)染宿主細胞。
11.如權(quán)利要求9所述的方法，其中，步驟I)還包括用編碼待檢測蛋白的核酸分子轉(zhuǎn)染宿主細胞。
12.如權(quán)利要求9所述的方法，其中，還包括在步驟4)之前通過免疫沉淀或親和層析步驟處理步驟3)所得細胞裂解物。
13.如權(quán)利要求9所述的方法，包括 (1).將被檢測蛋白的ORF裝載到表達載體中，所述載體優(yōu)選Mll， (2).將步驟(I)制備的載體、權(quán)利要求1-4中任一項所述融合蛋白的表達載體和Ubc9的表達載體一同轉(zhuǎn)染到宿主細胞中，優(yōu)選Hela細胞，所述融合蛋白優(yōu)選SNAP-L-SUM0或Halo-L-SUMO融合蛋白， (3).培養(yǎng)細胞，獲得各蛋白的表達，(4).收細胞后檢測被檢測蛋白的SUMO化產(chǎn)物，例如用WesternBlot法、電泳、免疫熒光或其組合來檢測。
14.一種細胞內(nèi)檢測SUMO化的系統(tǒng)，包含編碼權(quán)利要求1-4中任一項所述融合蛋白的表達質(zhì)粒，和轉(zhuǎn)染試劑，，優(yōu)選試劑盒形式。
15.如權(quán)利要求14所述細胞內(nèi)檢測SUMO化的系統(tǒng)，還包含編碼Ubc9的表達質(zhì)粒。
16.如權(quán)利要求14所述細胞內(nèi)檢測SUMO化的系統(tǒng)，所述融合蛋白是SNAP-L-SUM0或Halo-L-SUMO融合蛋白。
17.—種篩選SUMO化蛋白底物的方法， 提供作為SUMO化底物的候選蛋白，例如在高置信條件下用預(yù)測蛋白的被SUMO化能力的分析軟件篩選作為SUMO化底物的候選蛋白， 檢測候選蛋白的SUMO化，所述檢測采用權(quán)利要求7所述體外SUMO化修飾體系中檢測SUMO化的方法，或者采用權(quán)利要求9至13中任一項所述細胞內(nèi)檢測SUMO化的方法，或者兩者的聯(lián)用， 若檢測到候選蛋白的SUMO化產(chǎn)物，表明候選蛋白是SUMO化蛋白底物。
18.一種檢測細胞內(nèi)SUMO修飾的靶蛋白的方法，包括 (1)在細胞內(nèi)重組表達權(quán)利要求1-4中任一項所述的融合蛋白； (2)將細胞裂解液與結(jié)合、優(yōu)選共價結(jié)合所述融合蛋白中標(biāo)簽的載體接觸，所述載體例如微載體，例如珠粒； (3)分析與載體接觸的祀蛋白信息，例如WesternBlot或者MS分析。
19.如權(quán)利要求18所述的方法，步驟(3)之前還包括在變性條件下去除非特異非共價結(jié)合的雜蛋白。
20.權(quán)利要求1-4中任一項所述融合蛋白或權(quán)利要求5所述核酸分子用于制造診斷SUMO化相關(guān)疾病的制劑的用途，所述疾病例如癌癥、亨廷頓癥、阿爾茨海默病、帕金森、脊髓小腦性共濟失調(diào)和肌萎縮側(cè)壁增生。
21.F0XP2和ESXl的SUMO化調(diào)節(jié)劑用于制備人類語言和精子發(fā)生的藥物的用途。
全文摘要
本發(fā)明提供含蛋白標(biāo)簽的SUMO融合蛋白及其應(yīng)用，尤其是在體外和體內(nèi)系統(tǒng)中檢測SUMO化以及篩選和檢測SUMO化底物的應(yīng)用。
文檔編號A61P25/00GK102766214SQ20111011467
公開日2012年11月7日 申請日期2011年5月5日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月5日
發(fā)明者楊淑偉, 焦少灼 申請人:中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院