專利名稱：Aif1蛋白及抗體在制備近江牡蠣抗感染免疫制劑中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及AIFl基因、蛋白及其抗體在制備牡蠣抗感染免疫制劑中的作用。
背景技術(shù)：
同種異體移植炎癥因子AIF -I (Allograft inflammatory factor-1)是一種分子量約為17kD，可被Y干擾素誘導(dǎo)的鈣結(jié)合蛋白。目前，AIFl已在多種物種中被報(bào)道，其氨基酸序列具有高度的保守性，在結(jié)構(gòu)上含有ー個(gè)保守的EF-hand結(jié)構(gòu)域。研究證明AIFl是巨噬細(xì)胞活化過程中的免疫調(diào)節(jié)因子，能夠促進(jìn)巨噬細(xì)胞的増殖和遷移，并且具有多項(xiàng)生物學(xué)功能，參與機(jī)體免疫排斥、免疫炎癥反應(yīng)、自身炎性和非炎性損傷，并與多項(xiàng)疾病的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。牡蠣是重要的海水養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)貝類，具有“海洋牛奶”之美譽(yù)，其肉質(zhì)細(xì)嫩、肉味鮮美、營養(yǎng)價(jià)值高，是世界性的水產(chǎn)佳肴。我國是水產(chǎn)大國，牡蠣等貝類養(yǎng)殖是我國海水養(yǎng)殖的支柱產(chǎn)業(yè)之一，其中我國牡蠣養(yǎng)殖年產(chǎn)量居世界首位，達(dá)到300多萬噸(濕重)，占我國海水養(yǎng)殖總產(chǎn)量(約1000萬噸)的約三分之一(聯(lián)合國糧農(nóng)組織(FAO)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù))。牡蠣養(yǎng)殖業(yè)的迅速發(fā)展為我國農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)作出了重要的貢獻(xiàn)，也極大的改善了沿海漁民的生活水平，但是近年來，隨著牡蠣種質(zhì)退化，養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大，養(yǎng)殖環(huán)境的惡化和養(yǎng)殖模式的局限性，牡蠣養(yǎng)殖病害頻發(fā)，造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，極大的損害了當(dāng)?shù)貪O民養(yǎng)殖積極性，限制了牡販產(chǎn)業(yè)進(jìn)ー步的發(fā)展。其中研究證實(shí)類立克次體(rickettsia-like organism,簡稱RL0)是其主要病原之一，因此研究牡蠣抗RLO感染相關(guān)細(xì)胞因子及其抗感染機(jī)制顯得尤為重要和迫切，將有助于牡蠣抗感染免疫制劑的開發(fā)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是，克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足之處，提供AIFl基因、蛋白及在制備近江牡蠣抗感染免疫制劑中的應(yīng)用。為解決技術(shù)問題，本發(fā)明是通過這樣的技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明提供了一種近江牡蠣AIFl基因編碼的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)的氨基酸序列如SEQ ID NO 2 所示。本發(fā)明進(jìn)一歩提供了用于編碼前述蛋白質(zhì)的基因，該基因的編碼框核苷酸序列如SEQ ID NO. I 所示。本發(fā)明還掲示了前述蛋白質(zhì)在制備近江牡蠣抗感染免疫制劑中的應(yīng)用，是將所述蛋白質(zhì)免疫新西蘭大白兔進(jìn)而獲得多克隆抗血清。
本發(fā)明還提供了前述蛋白質(zhì)制備的多克隆抗血清(即AIFl蛋白的多克隆兔抗體)在抑制近江牡蠣病原RLO和革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁成分——脂多糖(Lipopolysaccharide,簡稱LPS)引起的炎癥反應(yīng)及細(xì)胞壞死和細(xì)胞凋亡中的應(yīng)用。
本發(fā)明的有益效果在干
本發(fā)明獲得了近江牡蠣AIFl基因編碼框全序列，并通過構(gòu)建原核表達(dá)載體，表達(dá)并純化了可溶性的AIFl蛋白質(zhì)產(chǎn)品，并制備了其多克隆兔抗血清。其多克隆兔抗血清具有抑制近江牡蠣病原RLO和革蘭氏陰性細(xì)菌LPS引起的炎癥反應(yīng)及細(xì)胞壞死和細(xì)胞凋亡的作用。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明的下述實(shí)施例所使用分子生物學(xué)的方法均為已知的技術(shù)。本發(fā)明中近江牡蠣AIFl基因編碼的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)的氨基酸序列如SEQ ID NO2所示。用于編碼前述蛋白質(zhì)的基因的編碼框核苷酸序列如SEQ ID NO. I所示。前述蛋白質(zhì)在制備近江牡蠣抗感染免疫制劑中的應(yīng)用，是將所述蛋白質(zhì)免疫新西蘭大白兔進(jìn)而獲得多克隆抗血清。該多克隆抗血清(即AIFl蛋白的多克隆兔抗體),應(yīng)用在
抑制近江牡販病原RLO和革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁成分-脂多糖(Lipopolysaccharide,
簡稱LPS)引起的炎癥反應(yīng)及細(xì)胞壞死和細(xì)胞凋亡中。本發(fā)明的實(shí)現(xiàn)步驟包括I、以近江牡蠣血淋巴細(xì)胞總RNA為模板，構(gòu)建cDNA文庫，獲得AIFl的基因編碼框核苷酸序列。2、利用DNA重組技術(shù)將AIFl基因編碼框的序列片段克隆到合適的pMD19_T載體(Takara公司，日本)中，再經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切，與經(jīng)同樣酶切的pET_32 (a)原核表達(dá)載體(Novagen公司，德國)連接,獲得重組表達(dá)質(zhì)粒pET_32 (a)-AIFl。3、將陽性重組質(zhì)粒PET-32 (a)-AIFl轉(zhuǎn)化到表達(dá)宿主菌BL21 (DE3 )(天根公司，中國)，異丙基硫代半乳糖苷(IPTG) (Sangon公司，加拿大)誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE )進(jìn)行檢測。4、將陽性表達(dá)菌液擴(kuò)大培養(yǎng)，利用蛋白質(zhì)純化試劑盒分離純化重組蛋白質(zhì)。5、培養(yǎng)近江牡蠣單層血淋巴細(xì)胞，并分別用LPS/RL0刺激，其中部分刺激添加AIFl多克隆兔抗血清，部分刺激添加AIFl免疫前的兔血清。 6、選擇不同的時(shí)間點(diǎn)收集處理過的細(xì)胞，用熒光定量PCR檢測炎癥相關(guān)細(xì)胞因子LITAF (LPS-induced TNF-a factor，脂多糖誘導(dǎo)的腫瘤壞死因子a )的表達(dá)，用流式細(xì)胞儀檢測血淋巴細(xì)胞壞死和凋亡。具體的操作步驟如下I、近江牡蠣血淋巴細(xì)胞cDNA文庫的構(gòu)建及篩選提取近江牡蠣血淋巴細(xì)胞總RNA，根據(jù)In-Fusion SMART cDNA libraryconstruction kit (BD Clotech公司)構(gòu)建cDNA文庫。利用M13引物對文庫陽性質(zhì)粒進(jìn)行PCR擴(kuò)增并測序。2、近江牡蠣AIFl編碼框核苷酸全長序列的獲得通過對文庫篩選，我們得到ー個(gè)和哺乳動(dòng)物AIFl有較高同源性的基因，我們將其命名為Ca-AIFl (Ca代表近江牡蠣)。該基因的編碼框核苷酸全長序列為SEQ ID NO :1。3、PET-32 (a) -AIFl 表達(dá)載體的構(gòu)建以近江牡蠣cDNA為模板擴(kuò)增目的片段，PCR擴(kuò)增Ca-AIFl的反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性5分鐘，然后35個(gè)循環(huán)(94°C變性30秒，53°C退火30秒，72°C延伸45秒)，72°C延伸10分鐘。PCR產(chǎn)物分別連入PMD-19T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a (Takara公司，日本)，涂布LBA篩選平板，挑取若干個(gè)克隆進(jìn)行PCR鑒定及進(jìn)ー步的測序鑒定，將PCR陽性克隆產(chǎn)物用BamHI，XhoI限制性內(nèi)切酶(Takara公司，日本)雙酶切，連接入經(jīng)過同樣雙酶切的PET_32a載體的相應(yīng)位點(diǎn)上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a (天根公司，中國)。PCR篩選陽性克隆，經(jīng)測序鑒定獲得編碼框正確的表達(dá)載體PET-32 (a) -AIFl。
4、重組蛋白質(zhì)的表達(dá)將陽性重組質(zhì)粒PET-32(a)_AIFl轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌E. coli Rossetta (DE3 )感受態(tài)，涂布LBA平板，37°C培養(yǎng)過夜。挑取ー個(gè)單克隆菌落，轉(zhuǎn)入LBA培養(yǎng)液，37°C振搖培養(yǎng)過夜。取適量菌液，按1:100擴(kuò)大培養(yǎng)至0D_為O. 4-0. 5時(shí)，將菌液分為若干等份，不加或分別加入IPTG，使其終濃度在0-1. O mmol/L,繼續(xù)培養(yǎng)6小吋，離心收集宿主菌。細(xì)菌經(jīng)超聲波裂解后(300W，20分鐘，超聲2秒鐘，間隔3秒鐘)離心分離上清液和沉淀，分別上樣，進(jìn)行SDS-PAGE電泳。5、重組蛋白質(zhì)的純化將陽性表達(dá)質(zhì)粒擴(kuò)大培養(yǎng)，按上述方法超聲處理，利用Ni-NTA親和層析柱(Novagen公司，德國)對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行分離純化，并采用12%的SDS-PAGE進(jìn)行鑒定。挑選體重約I. 5 kg的健康新西蘭白雄兔進(jìn)行免疫。經(jīng)過一次初始免疫和三次加強(qiáng)免疫后，頸動(dòng)脈取血，分離血清，存儲(chǔ)于_80°C。6、蛋白質(zhì)定量將純化鑒定過的蛋白質(zhì)按Brad-ford法進(jìn)行定量(Bradford MM. A rapid andsensitive method for the quantitation of microgram quantities of proteinutilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 1976， 72:248-254)o7、Ca-AIFl多克隆兔抗血清制備蛋白質(zhì)定量后，取適量蛋白，挑選2只體重約2 kg的健康新西蘭大白兔(雄兔)，進(jìn)行多克隆抗體制備，用純化所得的PET32a-AIFl為抗原加入等體積的佐劑充分乳化后免疫兔子，采用多點(diǎn)背部皮下注射，共免疫四次。(I)免疫前，從耳靜脈處收集3_5ml正常血清作為檢測抗體時(shí)的陰性對照。(2)用剪刀剪去兔子背部部分兔毛，酒精消毒后進(jìn)行背部皮下多點(diǎn)注射。(3)初次免疫取約I mg抗原，加入等體積的完全弗氏佐劑充分乳化后注射，背部選取8-10個(gè)點(diǎn)，每個(gè)點(diǎn)注射約0. I ml ;(4)第二次免疫間隔14天后進(jìn)行，抗原量為0.5 mg，加入等體積不完全弗氏佐劑充分乳化后注射，方法同上；(5)第三、四次免疫間隔7天后按同樣方法進(jìn)行，第四次免疫后，從耳靜脈采血Iml分離血清，用雙相瓊脂擴(kuò)散法進(jìn)行免疫血清的抗體效價(jià)檢測，效價(jià)應(yīng)達(dá)到1:16以上才能放血；(6)分離血清第四次免疫后第4天，待抗體效價(jià)達(dá)到要求后，進(jìn)行頸動(dòng)脈采血并分離血清。分裝后，-80°C保存。8、Western blot (免疫印跡)檢測抗體效價(jià)
參照Sambrook 等的方法進(jìn)行(Sambrook J, Russell D ff. Molecular Cloning:A Laboratory Manual, 3rd ecu New York: Cold bpring Harbor Laboratory Press,2001)，1:5000稀釋AIFl多克隆兔抗血清檢測抗體效價(jià)，具體步驟如下9、近江牡蠣單層血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)及處理參考Lacoste 和 Canesi 等的報(bào)道(Lacoste A. , Cueff A. and Poulet S. A.,2002. P35-sensitive caspases, MAP kinases and Rho modulate beta-adrenergicinduction of apop tosis in mollusc immune cells. Journal of cell science115, 761-8 ； Cane si L, Lorusso LC, Ciacci C, Betti M, Zampini M, Gallo G.Environmental estrogens can affect the function of mussel hemocytesthrough rapid modulation of kinase pathways. Gen Comp Endocrinol. 2004138:58-69.)，具體步驟如下(I)取10-15只健康、活性良好的牡蠣，實(shí)驗(yàn)室暫養(yǎng)后自來水沖洗外殼；(2)用一次性注射器從圍心腔中抽取10-15 ml血淋巴液；(3)取適量血淋巴液，800 xg，離心5分鐘，上清液用0.22 Mm孔徑的濾膜過濾后得到血清；(4)向每個(gè)培養(yǎng)皿中加入I ml血淋巴液，15°C孵育30分鐘；(5)吸去未貼壁血淋巴細(xì)胞，向每個(gè)培養(yǎng)皿中加入2 ml血清，置于15°C無菌培養(yǎng)箱中備用。(6)培養(yǎng)24小時(shí)后，更換血清，分別做以下處理a)在血淋巴細(xì)胞中加入RLO (lul/106 cells)，部分添加抗AIFl多克隆血清(1:1000)，分別培養(yǎng)0小時(shí)、1. 5小時(shí)、4小時(shí)、8小時(shí)和12小時(shí)，提取總RNA，用于real_timeRT-PCR分析LITAF表達(dá)變化；b)在血淋巴細(xì)胞中加入LPS (100ng/ml)，部分添加抗AIFl多克隆血清(1:1000)，分別培養(yǎng)0小時(shí)、I. 5小時(shí)、4小時(shí)、8小時(shí)和12小時(shí)，提取總RNA，用于real-time RT-PCR分析LITAF表達(dá)變化；c)在血淋巴細(xì)胞中加入RLO (lul/106 cells)，部分添加抗AIFl多克隆血清(1:1000)，部分添加免疫前血清(I: 1000)，培養(yǎng)12小時(shí)后流式細(xì)胞儀檢測血淋巴細(xì)胞凋亡和壞死；d)在血淋巴細(xì)胞中加入LPS (100ng/ml)，部分添加抗AIFl多克隆血清(1:1000)，部分添加免疫前血清(I: 1000)，培養(yǎng)12小時(shí)后流式細(xì)胞儀檢測血淋巴細(xì)胞凋亡和壞死。10、熒光定量PCR按照Takara (日本)熒光定量PCR說明書進(jìn)行，采用28s rDNA序列為內(nèi)參，每個(gè)樣品做3個(gè)重復(fù)樣本，反應(yīng)條件為95°C 3分鐘變性；40個(gè)循環(huán)擴(kuò)增(95°C 20秒，55°C 40秒)。反應(yīng)結(jié)束后，使用Bio-Rad iCycle IQ5熒光定量PCR儀自帶軟件包進(jìn)行溶解曲線分析，得到的數(shù)據(jù)應(yīng)用相對CT法(2_AACT)分析，在使用CT方法前，確定目的基因與看家基因擴(kuò)增效率基本一致，數(shù)據(jù)分析采用學(xué)生t檢驗(yàn)方法。11、流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡分析凋亡分析按照Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒對細(xì)胞進(jìn)行,Annexin V-FITC的綠色熒光通過FITC通道(FLI)檢測，PI紅色熒光通過PI (FL2或FL3)檢測。
具體的實(shí)施例子I、近江牡蠣血淋巴細(xì)胞cDNA文庫的構(gòu)建和篩選提取近江牡蠣血淋巴細(xì)胞總RNA，根據(jù)In-Fusion SMART cDNA libraryconstruction kit (BD Clotech公司)構(gòu)建cDNA文庫。利用M13引物對文庫陽性質(zhì)粒進(jìn)行PCR擴(kuò)增并測序。篩選出近江牡蠣同種異體移植炎癥因子(AIF1)。2、AIF1的原核表達(dá)、純化和鑒定將陽性重組質(zhì)粒PET-32 (a)-AIFl轉(zhuǎn)化到表達(dá)宿主菌BL21 (DE3 )感受態(tài)，涂布LBA平板，37°C培養(yǎng)過夜。挑取ー個(gè)單克隆菌落，轉(zhuǎn)入LBA培養(yǎng)液，37°C振搖培養(yǎng)過夜。取適量菌液，按1:100擴(kuò)大培養(yǎng)至0D_為O. 4-0. 5時(shí)，將菌液分為若干等份，不加或分別加入IPTG，使其終濃度在0-1. O mmol/L,繼續(xù)培養(yǎng)6小吋，離心收集細(xì)菌。細(xì)菌經(jīng)超聲波裂解后 (300W, 20分鐘，超聲2秒鐘，間隔3秒鐘)離心分離上清液和沉淀，分別上樣，進(jìn)行SDS-PAGE電泳。將陽性表達(dá)質(zhì)粒擴(kuò)大培養(yǎng)，利用Ni-NTA親和層析柱對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行分離純化，進(jìn)行12%的SDS-PAGE電泳鑒定純化的蛋白質(zhì)產(chǎn)物。3、AIFl多克隆抗血清制備及效價(jià)檢測用純化的AIFl蛋白免疫健康新西蘭大白兔，取免疫前血清為陰性對照，經(jīng)過一次初始免疫和三次加強(qiáng)免疫后，頸動(dòng)脈取血，分離血清，存儲(chǔ)于_80°C。ffestern-blot 1:5000檢測抗體效價(jià)確定獲得具有較高特異性的AIFl多克隆兔抗血清。4、AIFl多克隆兔抗血清抑制LPS/RL0刺激引起的炎癥相關(guān)因子LITAF的表達(dá)近江牡蠣單層血淋巴細(xì)胞體外培養(yǎng)24小時(shí)后，更換血清后將細(xì)胞分為LPS刺激組；LPS + anti-Ca-AIFl刺激組；RLO刺激組；RLO + anti-Ca-AIFl刺激組。突光定量PCR檢測O小時(shí)，I. 5小時(shí)，4小時(shí)，8小時(shí)和12小時(shí)LITAF mRNA表達(dá)量變化。其中LITAF是ー個(gè)新發(fā)現(xiàn)的重要轉(zhuǎn)錄因子，被認(rèn)為可以調(diào)控腫瘤壞死因子TNF α的表達(dá)，而LPS是革蘭氏陰性菌主要致病成分脂多糖。結(jié)果表明Ca-AIFl多克隆兔抗血清能顯著抑制LPS和RLO刺激引起的LITAF表達(dá)量上調(diào)(LPS + anti-Ca-AIFl, I. 5-12小時(shí)分別降低70. 95%, 84. 18%,39. 49% 和 87. 53% ；RL0 + anti-Ca-AIFl，I. 5-12 小時(shí)分別降低 88. 57%, 84. 80%, 59. 36% 和59. 16%)，說明Ca-AIFl多克隆抗血清具有有效抑制革蘭氏陰性菌和RLO感染引起的炎癥反應(yīng)的作用。因此，Ca-AIFl多克隆抗血清可有效應(yīng)用于近江牡蠣抗RLO和革蘭氏陰性菌等微生物感染的免疫制劑相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)中。5、AIFl多克隆兔抗血清抑制LPS/RL0刺激引起的細(xì)胞凋亡和壞死近江牡蠣單層血淋巴細(xì)胞體外培養(yǎng)24小時(shí)后，更換血清后將細(xì)胞分為LPS刺激組；LPS + anti-Ca-AIFl 刺激組；LPS + 免疫前血清組；RLO 刺激組；RLO + anti-Ca-AIFl刺激組；RLO +免疫前血清組。12小時(shí)后采用Annexin V-FITC/PI雙染流式細(xì)胞技術(shù)檢測血淋巴細(xì)胞凋亡和壞死率，結(jié)果表明添加Ca-AIFl兔抗血清較未添加和添加免疫前血清組，LPS/RL0誘導(dǎo)的細(xì)胞壞死和晩期細(xì)胞凋亡率均顯著降低，細(xì)胞存活率顯著増加(與未添加組和添加免疫前血清組比較，添加Ca-AIFl多克隆抗血清組，RLO刺激晚期細(xì)胞凋亡率均降低了約22%，壞死細(xì)胞率均降低了約41%?；罴?xì)胞數(shù)分別增加了 51%和49% ；LPS刺激組，晚期凋亡細(xì)胞分別減少了約50%和18%，壞死細(xì)胞分別約減少了 18%和44%，活細(xì)胞數(shù)分別增加了約32%和28%)。Ca-AIFl抗血清能夠顯著抑制革蘭氏陰性菌和RLO感染引起的細(xì)胞凋亡和細(xì)胞壞死，顯著增加細(xì)胞存活率，可有效應(yīng)用于近江牡蠣抗RLO和革蘭氏陰性菌等微生物感染的免疫制劑相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)中。 最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的若干具體實(shí)施例框架。顯然，本發(fā)明不限于以上實(shí)施例，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開的內(nèi)容直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.一種近江牡蠣AIFl基因編碼的蛋白質(zhì)，其特征在于，該蛋白質(zhì)的氨基酸序列如SEQID NO 2 所示。
2.用于編碼權(quán)利要求I所述蛋白質(zhì)的基因，其特征在于，該基因的編碼框核苷酸序列如 SEQ ID NO. I 所示。
3.權(quán)利要求I所述蛋白質(zhì)在制備近江牡蠣抗感染免疫制劑中的應(yīng)用，是將所述蛋白質(zhì)免疫新西蘭大白兔進(jìn)而獲得多克隆抗血清。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，旨在提供AIF1蛋白及抗體在制備近江牡蠣抗感染免疫制劑中的應(yīng)用。該蛋白質(zhì)的氨基酸序列如SEQ ID NO2 所示；該基因的編碼框核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述蛋白質(zhì)在制備近江牡蠣抗感染免疫制劑中的應(yīng)用，是將所述蛋白質(zhì)免疫新西蘭大白兔進(jìn)而獲得多克隆抗血清。本發(fā)明獲得了近江牡蠣AIF1基因編碼框全序列，并通過構(gòu)建原核表達(dá)載體，表達(dá)并純化了可溶性的AIF1蛋白質(zhì)產(chǎn)品，并制備了其多克隆兔抗血清。其多克隆兔抗血清具有抑制近江牡蠣病原RLO和革蘭氏陰性細(xì)菌LPS引起的炎癥反應(yīng)及細(xì)胞壞死和細(xì)胞凋亡的作用。
文檔編號A61K39/395GK102649815SQ20121015084
公開日2012年8月29日 申請日期2012年5月15日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月15日
發(fā)明者吳信忠, 許婷 申請人:浙江大學(xué)