專利名稱：一種制備用于體內(nèi)遞送藥理活性物質(zhì)的蛋白納米粒的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種制備用于體內(nèi)遞送藥理活性物質(zhì)的蛋白納米粒的方法，屬于藥理 活性物質(zhì)的體內(nèi)遞送及其臨床應(yīng)用領(lǐng)域。具體來說，本發(fā)明是一種利用蛋白及多肽展開與 再折疊或自組裝的方法將藥理活性物質(zhì)包入蛋白，形成納米粒的方法。
背景技術(shù)：
靜脈注射給藥能夠快速直接地作用于機(jī)體。為了降低靜脈注射給藥的副作用，有 效的方法之一就是將藥理活性物質(zhì)包入微米或納米級(jí)的粒子中。一方面，靜脈注射的粒子 可以緩釋藥理活性物質(zhì)并延長(zhǎng)藥理活性物質(zhì)的半衰期；另一方面，靶向材料可以將粒子中 的藥理活性物質(zhì)靶向地釋放。在現(xiàn)有技術(shù)涉及的蛋白粒子的制備方法中，如Abraxane 的制備方法(美國(guó)專利No. 6，749，868，美國(guó)專利No. 5，560，933)，將蛋白溶液與有機(jī)溶劑 均勻混合形成乳化液，高壓勻漿，形成以紫杉醇為核心的白蛋白納米粒。除了這種制備方法 比較復(fù)雜之外，還需要用高壓及相應(yīng)的高溫來去除有機(jī)溶劑，從而獲得納米粒。二氯甲烷， 乙腈等有機(jī)溶劑具有毒性，需要控制其殘留量。此外，這些方法包載藥理活性物質(zhì)的能力是 有限的。同時(shí)，由于制備過程中的高壓和剪切力，蛋白和多肽還可能失去生物活性。蛋白粒子還被眾多文獻(xiàn)報(bào)道作為藥理活性物質(zhì)和診斷試劑的載體。其中，白蛋 白微球可以用熱交聯(lián)和化學(xué)交聯(lián)的方法來制備。熱交聯(lián)微球是在100 150°C下從乳化 混合物(如白蛋白、需包載的藥理活性物質(zhì)和適當(dāng)?shù)挠拖?中制備。然后微球用適當(dāng)?shù)娜?劑洗滌并保存。Leucuta等報(bào)道了熱交聯(lián)微球的制備方法[International Journal of Pharmaceutics Vol. 41:213-217 (1988)];化學(xué)交聯(lián)微球的制備，如文獻(xiàn)[Science Vol. 213:233-235 (1981)]所報(bào)道，用戊二醛交聯(lián)蛋白，然后洗滌并保存。而且，現(xiàn)有技術(shù)中蛋白納米粒的制備方法很難保持蛋白的生物活性。而且，難溶 于水的藥理活性物質(zhì)也很難被包入蛋白納米粒中，因?yàn)檫@種方法本身依靠乳化液的水相交 聯(lián)。水溶性藥理活性物質(zhì)因其溶于含蛋白的水相而能夠被交聯(lián)進(jìn)入蛋白陣列，而水溶性差 或脂溶性藥理活性物質(zhì)難以進(jìn)入這種方法所形成的蛋白陣列中。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的技術(shù)目的在于提供一種制備用于體內(nèi)遞送藥理活性物質(zhì)的蛋白納米粒 的方法，以解決某些藥理活性物質(zhì)由于其疏水的性質(zhì)而導(dǎo)致無法體內(nèi)遞送，以及形成納米 粒之后的蛋白質(zhì)活性喪失的問題。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為一種制備用于體內(nèi)遞送藥理活性物質(zhì)的蛋白納米粒的方法，包括以下步驟(a)用第 一種溶劑溶解蛋白獲得蛋白溶液；(b)在變性劑或者適合的變性條件中將藥理活性物質(zhì)加 入步驟(a)中所述的蛋白溶液中，使蛋白展開與再折疊或自組裝，把藥理活性物質(zhì)包入蛋 白，形成蛋白納米粒。
本發(fā)明技術(shù)方案中所述的蛋白納米粒平均粒徑為5 2000 nm，優(yōu)化的為25 500 nm，最優(yōu)的為50 300 nm。本發(fā)明技術(shù)方案中所述的蛋白納米?？砂d占蛋白納米?？傊亓?% 40%的藥 理活性物質(zhì)。本發(fā)明技術(shù)方案所述的藥理活性物質(zhì)是疏水性藥理活性物質(zhì)，如抗腫瘤藥物，心 血管藥物，抗炎藥物，降糖藥物，中樞神經(jīng)系統(tǒng)藥物，免疫抑制藥物，以及抗病毒藥物。其中，所述的疏水性藥理活性物質(zhì)是紫杉醇、多西紫杉醇、伊立替康、5-氟尿嘧啶、 卡莫司汀、阿霉素、苯芥膽留醇、哌泊舒凡、他莫昔芬、洛莫司汀、藤黃酸、冬凌草甲素、鬼臼 毒素、阿托伐他汀、斯伐他汀、非諾貝特、硝苯地平、布洛芬、吲哚美辛、吡羅昔康、格列本脲、 地西泮、利哌利酮、齊拉西酮、他克莫司、雷帕霉素、茚地那韋、利托那韋、TelapreviKCAS號(hào) 4(^957-28-2)、洛匹那韋、或它們的組合。其中，優(yōu)選的疏水性藥理活性物質(zhì)是紫杉醇或多西紫杉醇。本發(fā)明技術(shù)方案所述的藥理活性物質(zhì)是親水性藥理活性物質(zhì)。其中，所述的親水性藥理活性物質(zhì)是環(huán)磷酰胺、博萊霉素、道諾霉素、表柔比星、甲 氨蝶呤、5-氟尿嘧啶或其類似物、鉬或其類似物、長(zhǎng)春堿或其類似物、高三尖杉酯堿或其衍 生物、放線菌素-D、絲裂霉素-C、依托泊苷、或它們的組合。本發(fā)明技術(shù)方案中所述的蛋白是白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、胰島素、血管內(nèi)皮抑素、血紅 蛋白、肌紅蛋白、溶菌酶、免疫球蛋白、α-2-巨球蛋白、纖維連接蛋白、纖層蛋白、膠原蛋白、 明膠、人造多肽與蛋白，或者它們的組合。其中，優(yōu)選的蛋白是白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、胰島素、血管內(nèi)皮抑素或血紅蛋白。本發(fā)明技術(shù)方案所述的步驟(a)的第一種溶劑是水，生理鹽水，糖，凍干保護(hù)劑或 蛋白穩(wěn)定劑。其中，所述的凍干保護(hù)劑是磷酸鹽，醋酸鹽，甘氨酸，三羥甲基氨基甲烷，過氧 化氫，谷胱甘肽，葡萄糖、或它們的組合。所述的蛋白穩(wěn)定劑是海藻糖，甘露醇，蔗糖，乙酰色 氨酸，辛酸鈉或者它們的組合。其中，所述的第一種溶劑優(yōu)選水，磷酸鹽，醋酸鹽，乙酰色氨酸，辛酸鈉或生理鹽 水。本發(fā)明技術(shù)方案中所述的步驟(a)的操作溫度為-20 100°C;優(yōu)選為50 85°C; 最優(yōu)為55 75°C。本發(fā)明技術(shù)方案中所述的步驟(a)的操作pH值為pH3 9 ；優(yōu)選為pH5 8. 5 ；最 優(yōu)為pH6 8。本發(fā)明技術(shù)方案中所述的步驟(b)的變性劑或者適合的變性條件包括水、強(qiáng)酸、 強(qiáng)堿、無機(jī)鹽、有機(jī)溶劑、結(jié)構(gòu)展開劑或表面活性劑。其中，所述的強(qiáng)酸強(qiáng)堿包括鹽酸，硫酸， 氫氧化鈉等。所述的有機(jī)溶劑是甲醇，乙醇，異丙醇，福爾馬林，氯仿，丙酮，硫化氫或它們的 組合。所述的結(jié)構(gòu)展開劑是水，2-巰基乙醇，二硫蘇糖醇，鹽酸胍，尿素，高氯酸，三丁基膦， 甲巰丙脯氨酸，過甲酸，青霉胺，谷胱甘肽，甲硫咪唑，乙酰半胱氨酸或它們的組合。所述的 無機(jī)鹽是水，氯化鈉，磷酸鹽，醋酸鹽，甘氨酸，三羥甲基氨基甲烷，過氧化氫，谷胱甘肽，葡 萄糖，蔗糖，甘露醇，海藻糖，乙酰色氨酸，辛酸鈉或它們的組合。其中，優(yōu)選的變性劑或者適合的變性條件是水，磷酸鹽，醋酸鹽，甘氨酸，三羥甲基 氨基甲烷，氯化鈉，葡萄糖，乙醇，丙酮，硫化氫，2-巰基乙醇，尿素或它們的組合。
本發(fā)明技術(shù)方案中所述的變性劑或者適合的變性條件的pH值為pH3 9 ；優(yōu)選為 ρΗ5· 5 8. 5。本發(fā)明技術(shù)方案中所述的步驟(b)還包括外力操作以輔助蛋白展開。其中，所述的外力包括變化溫度、變化壓力、施加機(jī)械力或輻射。其中，所述的變化壓力為對(duì)反應(yīng)施加10 100，000 psi的壓力；優(yōu)選的對(duì)反應(yīng)施 加2000 60，000 psi的壓力。本發(fā)明的技術(shù)方案的方法進(jìn)一步包括(c)將蛋白納米粒透析除去多余的小分子 化合物或者進(jìn)一步濃縮。本發(fā)明的技術(shù)方案的方法進(jìn)一步包括(d)將透析后的蛋白納米粒經(jīng)過脫水步驟 制備成藥物制劑。其中，所述的脫水的步驟是冷凍干燥、噴霧干燥或減壓蒸餾。下面是對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的進(jìn)一步描述除上述總的技術(shù)方案以外，本發(fā)明進(jìn)一步提出了一種制備用于體內(nèi)遞送疏水性藥理活 性物質(zhì)的納米粒制備方法，所述方法包含以下幾個(gè)步驟(a)在-20 100°C，pH3 9的條 件下，用第一種溶劑溶解所述蛋白獲得蛋白溶液；(b)在變性劑或者適合的變性條件下，將 疏水性藥理活性物質(zhì)加入步驟(a)中所述的蛋白溶液，從而引起蛋白展開與再折疊或自組 裝，把藥理活性物質(zhì)包入蛋白。形成的納米粒平均粒徑為5 500 nm，可包載占粒子總重量 約1 40%的疏水性藥理活性物質(zhì)。這里的疏水性藥理活性物質(zhì)可以包括但不局限于紫杉 醇、多西紫杉醇、伊立替康、卡莫司汀、阿霉素、苯芥膽留醇、哌泊舒凡、他莫昔芬、洛莫司汀、 藤黃酸、冬凌草甲素、鬼白毒素、阿托伐他汀、斯伐他汀、非諾貝特、硝苯地平、布洛芬、吲哚 美辛、吡羅昔康、格列本脲、地西泮、利哌利酮、齊拉西酮、他克莫司、雷帕霉素、茚地那韋、利 托那韋、Telaprevir、洛匹那韋，以及它們的組合。本技術(shù)方案的方法中的蛋白一般可以包括但不局限于白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、胰島素、 內(nèi)皮抑素、血紅蛋白、肌紅蛋白、溶菌酶、免疫球蛋白、α-2-巨球蛋白、纖維連接蛋白、纖層 蛋白、膠原蛋白、明膠、人造肽與蛋白，以及它們的組合。本實(shí)施方案的方法中的第一種溶劑 可以包括水、生理鹽水、磷酸鹽、醋酸鹽、甘氨酸、三羥甲基氨基甲烷、過氧化氫、谷胱甘肽、 葡萄糖、海藻糖、甘露醇、蔗糖、乙酰色氨酸、辛酸鈉，以及它們的組合。此外，本實(shí)施方案的 方法中的變性劑或者適合的變性條件可以包括水，氯化鈉，磷酸鹽，醋酸鹽，甘氨酸，三羥甲 基氨基甲烷，過氧化氫，谷胱甘肽，甲醇，乙醇，異丙醇，福爾馬林，氯仿，丙酮，硫化氫，2-巰 基乙醇，二硫蘇糖醇，鹽酸胍，尿素，高氯酸，三丁基膦，甲巰丙脯氨酸，過甲酸，青霉胺，谷胱 甘肽，甲硫咪唑，乙酰半胱氨酸以及它們的組合。其中，所述的納米粒子的平均直徑優(yōu)選為25 nm 500 nm ；最優(yōu)為50 nm 300 nm。所述步驟(a)優(yōu)選在50°C 85°C進(jìn)行，最優(yōu)在55°C 75°C進(jìn)行。pH優(yōu)選在5 8. 5 的條件下進(jìn)行，最優(yōu)在6 8的條件下進(jìn)行。所述變性劑或者適合的變性條件是水，氯化鈉，磷酸鹽，醋酸鹽，甘氨酸，三羥甲基 氨基甲燒，乙醇，丙酮，硫化氧，2-巰基乙醇，尿素或它們的組合。其中，所述的變性劑或者適合的變性條件的pH值為3 9，優(yōu)選為5. 5 8. 5。上述方法進(jìn)一步包括(c)將納米粒透析除去多余的小分子化合物或者進(jìn)一步濃 縮。還進(jìn)一步包括(d)將透析后的納米粒經(jīng)過脫水步驟制備成藥物制劑。其中，所述的脫水步驟是凍干，減壓蒸餾或噴霧干燥。本發(fā)明技術(shù)方案再進(jìn)一步提出了一種制備用于體內(nèi)遞送紫杉醇蛋白納米粒的方 法，所述方法包含以下幾個(gè)步驟(a)在55 75°C，pH6 8的條件下，用第一種溶劑溶解 所述蛋白獲得蛋白溶液；(b)在變性劑或者適合的變性條件下，將紫杉醇加入步驟(a)中所 述的蛋白溶液，從而引起蛋白展開與再折疊或自組裝，把紫杉醇包在所述蛋白中；(c)將納 米粒透析除去多余的小分子化合物或者進(jìn)一步濃縮；(d)對(duì)所得溶液進(jìn)行脫水作用，制得 能夠保存的藥物劑型。這里制得的納米粒平均粒徑為50 300 nm，可包載占粒子總重量約 1 40%的藥理活性物質(zhì)。本實(shí)施方案的方法中的變性劑或者適合的變性條件可以從水， 氯化鈉，磷酸鹽，醋酸鹽，甘氨酸，三羥甲基氨基甲烷，過氧化氫，谷胱甘肽，甲醇，乙醇，異丙 醇，福爾馬林，氯仿，丙酮，硫化氫，2-巰基乙醇，二硫蘇糖醇，鹽酸胍，尿素，高氯酸，三丁基 膦，甲巰丙脯氨酸，過甲酸，青霉胺，谷胱甘肽，甲硫咪唑，乙酰半胱氨酸以及它們的組合中 選擇。此外，本實(shí)施方案的方法中的蛋白可以從白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、胰島素、內(nèi)皮抑素、血紅 蛋白中選擇。本發(fā)明技術(shù)方案再進(jìn)一步提出了一種將多西紫杉醇包入蛋白用于體內(nèi)遞送的納 米粒制備方法，這種方法包含以下幾個(gè)步驟(a)在55 75°C，pH6 8的條件下用第一種 溶液溶解所述蛋白獲得蛋白溶液；(b)在變性劑或者適合的變性條件下，將多西紫杉醇加 入到步驟(a)中所述的蛋白溶液，從而引起展開與再折疊或自組裝，把多西紫杉醇包入蛋 白；(c)將納米粒透析除去多余的小分子化合物或者進(jìn)一步濃縮；(d)將透析后的納米粒 經(jīng)過脫水步驟制備成藥物制劑；這里制得的納米粒平均粒徑為約50 300 nm，可包載占粒 子總重量約1 40%的多烯紫杉醇。本實(shí)施方案的方法中的變性劑或者適合的變性條件 可以從水，氯化鈉，磷酸鹽，醋酸鹽，甘氨酸，三羥甲基氨基甲烷，過氧化氫，谷胱甘肽，甲醇， 乙醇，異丙醇，福爾馬林，氯仿，丙酮，硫化氫，2-巰基乙醇，二硫蘇糖醇，鹽酸胍，尿素，高氯 酸，三丁基膦，甲巰丙脯氨酸，過甲酸，青霉胺，谷胱甘肽，甲硫咪唑，乙酰半胱氨酸以及它們 的組合中選擇。此外，本實(shí)施方案的方法中的蛋白可以從白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、胰島素、內(nèi)皮抑 素、血紅蛋白中選擇。本發(fā)明技術(shù)方案再進(jìn)一步提出了一種蛋白包載藥理活性物質(zhì)用于體內(nèi)遞送的納 米粒，制備這種納米粒的方法包含以下幾個(gè)步驟(a)在-20 100°C，pH3 9的條件下， 用第一種溶劑溶解所述蛋白獲得蛋白溶液；(b)在變性劑或者適合的變性條件下，將藥理 活性物質(zhì)加入到步驟(a)所述的蛋白溶液中，使蛋白展開與再折疊或自組裝，將藥物包裹 在所述蛋白中。本發(fā)明技術(shù)方案再進(jìn)一步提出了一種蛋白包載紫杉醇用于體內(nèi)遞送的納米粒，制 備這種納米粒的方法包含以下幾個(gè)步驟(a)在55 75°C，pH6 8的條件下，用第一種溶 劑溶解所述蛋白獲得蛋白溶液；(b)在變性劑或者適合的變性條件下，將紫杉醇加入到步 驟(a)所述的蛋白溶液中，使蛋白展開與再折疊或自組裝，將藥物包裹在所述蛋白中；(c) 透析形成的納米粒溶液以去除過剩的物質(zhì)，得到高濃度的溶液；(d)對(duì)所得溶液進(jìn)行脫水 作用，制得能夠保存的藥品劑型。本發(fā)明技術(shù)方案再進(jìn)一步提出了一種蛋白包載多西紫杉醇用于體內(nèi)遞送的納米 粒，制備這種納米粒的方法包含以下幾個(gè)步驟(a)在55 75°C，pH6 8的條件下，用第 一種溶劑溶解所述蛋白獲得蛋白溶液；(b)在變性劑或者適合的變性條件下，將多西紫杉醇加入到步驟(a)所述的蛋白溶液中，使蛋白展開與再折疊或自組裝，將藥物包裹在所述 蛋白中；(c)透析形成的納米粒溶液以去除過剩的物質(zhì)，得到高濃度的溶液；(d)對(duì)所得溶 液進(jìn)行脫水作用，制得能夠保存的藥品劑型。對(duì)本發(fā)明所述技術(shù)方案的說明本發(fā)明所述的“納米?！?，指的是小的單位，而在轉(zhuǎn)運(yùn)和性質(zhì)方面特指為一個(gè)整體。本發(fā) 明所制備的蛋白納米粒平均粒徑分布于5 nm到2000 nm之間。一個(gè)更好的區(qū)間是25 nm 到500 nm，再一個(gè)更好的區(qū)間是50 nm到300 nm。而且，本發(fā)明所制備的納米粒能夠結(jié)合 高達(dá)40%的藥理活性物質(zhì)。本發(fā)明中所述的將藥理活性物質(zhì)包入蛋白，指的是藥理活性物質(zhì)可以通過蛋白的 展開和再折疊，進(jìn)入蛋白中心區(qū)域。一般來說，藥理活性物質(zhì)包括在給病人服用時(shí)，能夠產(chǎn) 生藥理反應(yīng)的任何的物質(zhì)。本發(fā)明中的藥理活性物質(zhì)包括疏水和親水的化合物。本領(lǐng)域技 術(shù)人員清楚疏水性藥理活性物質(zhì)的水溶性不好，親水性藥理活性物質(zhì)能夠優(yōu)化的溶解在水 中。疏水性的藥理活性物質(zhì)包括如下的化合物，但是不僅僅限于此抗腫瘤藥物，心血管藥 物，抗炎藥物，降糖藥物，中樞神經(jīng)系統(tǒng)藥物，免疫抑制藥物，以及抗病毒藥物。本發(fā)明涉及的疏水性藥理活性物質(zhì)可以包括，但是不僅僅局限于此紫杉醇、多西 紫杉醇、伊立替康、卡莫司汀、阿霉素、苯芥膽留醇、哌泊舒凡、他莫昔芬、洛莫司汀、藤黃酸、 冬凌草甲素、鬼白毒素、阿托伐他汀、斯伐他汀、非諾貝特、硝苯地平、布洛芬、吲哚美辛、吡 羅昔康、格列本脲、地西泮、利哌利酮、齊拉西酮、他克莫司、雷帕霉素、茚地那韋、利托那韋、 Telaprevir、洛匹那韋，以及它們的組合。更優(yōu)化的說，具有藥理活性的疏水性物質(zhì)包括抗腫瘤藥理活性物質(zhì)如紫杉醇， 多西紫杉醇，伊立替康，卡氯芥，阿霉素，膽留醇對(duì)苯乙酸氮芥，哌泊舒凡，他莫昔芬，環(huán)己亞 硝脲，藤黃酸，冬凌草素甲，鬼白毒素以及它們的衍生物，以及它們的組合。在一個(gè)更優(yōu)化的范圍中，疏水性藥理活性物質(zhì)包括紫杉醇和多西紫杉醇。上述的 藥理活性物質(zhì)包括晶體形式和無定形形式，其晶體形式包括帶有結(jié)晶水和不帶有結(jié)晶水的 形式。本發(fā)明所涉及的藥理活性物質(zhì)還包括親水性物質(zhì)。親水性物質(zhì)可以包括如下化合物，但是不僅僅局限于此環(huán)磷酰胺、博萊霉素、道 諾霉素、表柔比星、甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶及其類似物、鉬及其類似物、長(zhǎng)春堿及其類似物、 高三尖杉酯堿及其衍生物、放線菌素-D，絲裂霉素-C，依托泊苷以及它們的組合。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠理解本發(fā)明中使用的藥理活性物質(zhì)的量會(huì)根據(jù)蛋白的量的 變化而變化，同時(shí)根據(jù)納米粒的量的變化而變化。同時(shí)，有經(jīng)驗(yàn)的人能夠意識(shí)到本發(fā)明中使 用的藥理活性物質(zhì)，可以是純的物質(zhì)，或者是混合物，這些都沒有背離本發(fā)明的范圍。本發(fā)明中，可以選擇不同的蛋白去形成本領(lǐng)域技術(shù)人員所感興趣的納米粒子。本 發(fā)明中所涉及的蛋白包括所有的能夠展開并結(jié)合藥理活性物質(zhì)的蛋白或者多肽。合適的蛋 白的例子包括如下，但是不僅僅局限于此白蛋白，轉(zhuǎn)鐵蛋白，胰島素，血管內(nèi)皮抑素，血紅 蛋白，肌球蛋白，溶菌酶，免疫球蛋白，α -2-巨球蛋白，纖連蛋白，核纖層蛋白，膠原蛋白，明 膠，人造蛋白以及它們的組合。在一個(gè)更優(yōu)化的范圍，適合于本發(fā)明的蛋白包括如下白蛋白，轉(zhuǎn)鐵蛋白，胰島素， 血管內(nèi)皮抑素，血紅蛋白以及它們的組合物。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)清楚本發(fā)明方法中所使用的蛋白的量隨著活性物質(zhì)的量和納米粒的量的變化而變化[Armalytical Biochemistry Vol. 72:248-254(1976)].本發(fā)明方法中的步驟(a)為用第一種溶劑溶解所述蛋白獲得蛋白溶液。這里的蛋白溶 液指的是溶液中包括蛋白和能夠溶解蛋白的溶劑，在蛋白展開之后，能夠再折疊或者自組 裝。這里使用的再折疊指的是一個(gè)解折疊或者變性的蛋白能夠再折疊恢復(fù)到合適的三維結(jié) 構(gòu)的過程。這里使用的自組裝指的是再折疊的蛋白結(jié)合到一起形成納米粒的過程。本領(lǐng)域 技術(shù)人員清楚蛋白的再折疊過程可以通過很多條件完成。在蛋白溶液中使用的第一種溶液 舉例如下，但不僅僅局限于此水，生理鹽水，糖，凍干保護(hù)劑和蛋白穩(wěn)定劑，在更精確的范 圍，溶劑包括水，氯化鈉溶液，磷酸鹽溶液，醋酸溶液，甘氨酸溶液，三羥甲基氨基甲烷溶液， 過氧化氫水溶液，谷胱甘肽水溶液，葡萄糖溶液，海藻糖溶液，甘露醇溶液，蔗糖溶液，乙酰 色氨酸溶液，辛酸鈉溶液，以及它們的混合物。在一個(gè)更加精確的范圍，蛋白溶液中的溶劑包括水，磷酸鹽，醋酸鹽和氯化鈉溶 液。本發(fā)明中所使用的蛋白溶液中的溶劑的濃度只要適合溶解蛋白和蛋白再折疊，都是可 行的?？傮w上來說，蛋白溶液中溶劑的含量范圍從0.001 M到1.6 M0優(yōu)化的范圍，從0.03 M到1.5 M0再優(yōu)化的范圍，從0.05 M到0.8 M。一個(gè)更加優(yōu)化的范圍，從0. 1 M到0. 3 M。 本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠明白用來溶解蛋白的溶劑的量會(huì)根據(jù)蛋白的量和蛋白溶液濃度的變 化而變化。實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明中的步驟(a)中的反應(yīng)參數(shù)對(duì)于形成納米粒來說，是非常重要 的。一般來說，要獲得一個(gè)理想的結(jié)果，本發(fā)明中的步驟(a)須在-20°C到100°C范圍之間 反應(yīng)。一個(gè)比較精確的范圍是從50°C到85°C。一個(gè)更加精確的范圍是從55°C到75°C。實(shí) 驗(yàn)已經(jīng)證明，要獲得一個(gè)比較理想的結(jié)果，本發(fā)明中步驟(a)的pH須在3到9之間，一個(gè)比 較精確的范圍是從5到8. 5，在一個(gè)更加精確的范圍是從6到8。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠清楚 步驟(a)需要一段時(shí)間以使得蛋白充分的溶解。一般來說，時(shí)間的長(zhǎng)短依賴于所使用的蛋 白的種類，蛋白的使用量，使用溶劑的種類，溶劑的含量，溶劑的濃度和其他的一些因素。一 般來說，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠充分意識(shí)到，反應(yīng)過程和反應(yīng)過程的每一個(gè)步驟都需要充足 的時(shí)間，舉一個(gè)例子，反應(yīng)過程需要5分鐘到8小時(shí)不等。本發(fā)明的第二個(gè)步驟即步驟(b)包括在變性劑或者適合的變性條件下，將藥理活 性物質(zhì)加入到經(jīng)過步驟(a)所述的蛋白溶液中，使蛋白展開與再折疊或者自組裝。這里使 用的變性劑或者適合的變性條件指的是能誘導(dǎo)蛋白或者多肽改變它們的三維或者二維結(jié) 構(gòu)的溶液。一般來說，這里提到的變性劑或者適合的變性條件能夠誘導(dǎo)蛋白溫和的變性。本 領(lǐng)域技術(shù)人員能夠充分意識(shí)到溫和變性指的是在蛋白解折疊/變性之后，能夠在某些條件 下(如使用再折疊溶液)再折疊成合適的結(jié)構(gòu)。變性劑或者適合的變性條件可以提供一個(gè)環(huán) 境來破壞蛋白的二硫鍵，形成氫鍵，以使得水能夠干擾蛋白內(nèi)部的疏水作用。本領(lǐng)域技術(shù)人 員能夠充分意識(shí)到許多溶液能夠充當(dāng)變性劑或者適合的變性條件。這里所述的變性劑或 者適合的變性條件括水，強(qiáng)酸，強(qiáng)堿，無機(jī)鹽，有機(jī)溶劑，結(jié)構(gòu)展開劑和表面活性劑。合適的 變性劑或者適變性條件舉例如下，但是不僅僅局限于此水，氫氧化鈉，鹽酸，硫酸，甲醇溶 液，乙醇溶液，異丙醇，福爾馬林，氯仿，丙酮，硫化氫，2-巰基乙醇，二硫蘇糖醇，胍，尿素， 高氯酸，三正丁基膦，甲巰丙脯酸，過甲酸，青霉胺，谷胱甘肽，甲硫咪唑，乙酰半胱氨酸，氯 化鈉溶液，磷酸鹽溶液，醋酸鹽溶液，甘氨酸溶液，三羥甲基氨基甲烷溶液，過氧化氫，谷胱甘肽，葡萄糖，蔗糖，甘露醇，海藻糖，乙酰色氨酸，辛酸鈉以及它們的混合物。在一個(gè)更精確 的范圍，變性劑或者適合的變性條件包括水，磷酸鹽，醋酸鹽，甘氨酸，三羥甲基氨基甲烷， 乙醇，丙酮，硫化氫，2-巰基乙醇，尿素。實(shí)驗(yàn)證明，當(dāng)變性劑或者適合的變性條件的PH在 3 9之間，獲得的結(jié)果是令人滿意的。一個(gè)更加精確的pH范圍是從5. 5到8. 5。另外，除了變性劑，本發(fā)明中蛋白解折疊還可以使用外加壓力。一般來說，外加壓 力包括能夠致蛋白解折疊的力量。外加力包括溫度，壓力變化，機(jī)械力，輻射。外加力包括 從10到100，000 psi的壓力，一個(gè)更合適的范圍是從2000到60000 psi。本發(fā)明可能另外需要一個(gè)步驟(C)將納米粒子透析除去多余的小分子化合物或 者進(jìn)一步濃縮。一般來說，這個(gè)步驟包括任意的能夠?qū)⑿》肿訌募{米粒中分離出去的方 法，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠充分意識(shí)到分離的方法包括任意的能夠純化蛋白或者多肽的方 法。這些方法可包括鹽沉淀，透析，層析以及它們的組合，這些方法可以適當(dāng)?shù)倪x擇。一個(gè) 更加精細(xì)的范圍，透析是可行的。本發(fā)明可能還需要一個(gè)步驟(d)將透析后的納米粒經(jīng)過脫水步驟制備成藥物制 劑。一般來說，保護(hù)的方法包括給納米粒脫水以方便儲(chǔ)存和運(yùn)輸，以致獲得合適的劑型。本 發(fā)明所涉及的保護(hù)的方法包括離心，減壓干燥，凍干，噴霧干燥。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠意識(shí)到本發(fā)明的范圍和精髓是變動(dòng)的。解折疊的物質(zhì)是變化 的，同時(shí)許多的藥理活性物質(zhì)是可使用的，許多的蛋白和合成的多肽也是可以用來作為載 體的。本發(fā)明將會(huì)在下面的實(shí)施例中得到更加明確和清晰地描述。本發(fā)明的有益效果在于首先，經(jīng)本發(fā)明提供的方法形成的納米粒子可以達(dá)到90%的包封率，超過現(xiàn)有技術(shù)，形 成了一種高效低耗的方法；其次，本發(fā)明所提供的方法能夠獲得最高達(dá)40%的載藥量，即納 米粒中含有40%的藥理活性物質(zhì)。由于有更高的載藥量，在治療時(shí)，可以獲得更小的用藥體 積，更短的用藥時(shí)間，對(duì)病人更方便。較高的載藥量降低了遞送藥理活性物質(zhì)時(shí)蛋白的使用 量，提高了產(chǎn)品的成本效率；最后，現(xiàn)有技術(shù)提供的較低載藥能力不能滿足高劑量給藥，因 為高劑量的給藥需要很大的給藥體積。然而，本實(shí)驗(yàn)發(fā)明的具有高載藥能力的納米粒不會(huì) 受給藥體積的限制。通過本發(fā)明制備的納米粒的另一個(gè)有益效果是，納米粒能夠特異性的遞送藥理活 性物質(zhì)。通過本發(fā)明制備的納米粒子能夠靶向一些身體器官和系統(tǒng)。比如，當(dāng)用白蛋白作 為載體時(shí)，通過改變納米粒子的大小，靶向肝臟，肺，脾臟或者淋巴系統(tǒng)等。當(dāng)用轉(zhuǎn)鐵蛋白或 者胰島素作為載體的時(shí)候，它們的受體在細(xì)胞表面高表達(dá)，通過載體和腫瘤細(xì)胞表面的親 和性，可以特異性的將藥理活性物質(zhì)輸送到腫瘤組織。當(dāng)載體是血管內(nèi)皮抑素的時(shí)候，它的 受體分布于血管細(xì)胞，由于腫瘤組織中存在大量的血管的緣故，納米粒子能夠大量的在腫 瘤組織中蓄積。總之，不同的蛋白載體可以靶向不同的組織或者器官。因此可以說，本發(fā)明 提供了一種高效低耗的方法來輸送藥理活性物質(zhì)到身體的不同部位。


圖1為不同pH對(duì)本發(fā)明中納米粒粒徑大小的影響(15%投藥，藥物/蛋白) 圖2為本發(fā)明中白蛋白-紫杉醇納米粒的粒徑分布3為本發(fā)明中白蛋白-紫杉醇納米粒的透射電子顯微鏡圖像(載藥量10. 59%)圖4為紫杉醇-白蛋白納米粒的高分辨率TEM照片其中，(a)白蛋白-紫杉醇納米粒；(b)放大的空載的白蛋白納米粒；(c)放大的游離的 紫杉醇；(d)放大的白蛋白-紫杉醇納米粒圖5為白蛋白-紫杉醇納米粒的X射線粉末衍射圖像其中，(a)紫杉醇；(b)空白的白蛋白納米粒；(c)紫杉醇-白蛋白納米粒(載藥量 12. 9%) ； (d)白蛋白和紫杉醇的物理混合物(12. 9%)圖6為白蛋白-紫杉醇納米粒與藥品Abraxane 的再分散其中，(a) 2 mg/mL白蛋白-紫杉醇納米粒溶液；(b) 2 mg/mL Abraxane 溶液；(c) 20 mg/mL白蛋白-紫杉醇納米粒溶液；(d) 20 mg/mL Abraxane 溶液；(e) 50 mg/mL白蛋 白-紫杉醇納米粒溶液；(f)50 mg/mL Abraxane⑧溶液。
具體實(shí)施例方式以下均是基于本發(fā)明的代表性實(shí)施例，但下述實(shí)施例不會(huì)在任何方面限制本發(fā)明 的保護(hù)范圍。實(shí)施例1.紫杉醇-白蛋白納米粒的制備100 mgHSA溶于10 mL pH6的含0. 5 mg/mL EDTA和0. 05 M巰基乙醇的磷酸鹽緩沖 液，55°C反應(yīng)持續(xù)兩小時(shí)，結(jié)束后用5%的三氯乙酸沉淀并洗滌蛋白，加入1.6 mLlO mg/ mL的紫杉醇(乙醇溶解)溶液到沉淀中，混合2分鐘，加入50 mL的0. 08 M的磷酸鹽緩沖 液攪拌，溶解混合物。得到的懸液透明，而且載藥粒子的平均粒徑為80 200 nm, (BIC 90plus Particle Size Analyzer) 0用反相C18柱測(cè)定紫杉醇的包封率，流動(dòng)相為乙腈 水(60:40)，檢測(cè)波長(zhǎng)227 nm。HPLC分析表明本實(shí)驗(yàn)的紫杉醇包封率達(dá)到90%以上。實(shí)驗(yàn)中三氯乙酸還可以用其他變性劑代替，比如水，強(qiáng)酸(鹽酸和硫酸)，強(qiáng)堿(氫 氧化鈉)，過氧化氫，谷胱甘肽等。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，5%的三氯乙酸可以達(dá)到較窄的粒徑分布(50 300 nm)。實(shí)施例2.紫杉醇-白蛋白納米粒的制備100 mg HSA溶于50 mL pH7. 4的TRIS緩沖液中，37°C水浴，加入；350 μ L 2-巰基乙 醇，反應(yīng)持續(xù)10分鐘，加入2 mL 10 mg/mL的紫杉醇(乙醇溶解)。30分鐘后，樣品用pH7. 4 的TRIS緩沖液透析M小時(shí)，所得樣品凍干48小時(shí)。所得凍干后的塊狀樣品能夠很容易的 用水或生理鹽水復(fù)溶為原溶液，且納米粒粒徑保持不變。凍干后粒徑主要分布在80 200 nm(BIC 90plus Particle Size Analyzer)，HPLC分析表明本實(shí)驗(yàn)的紫杉醇包封率達(dá)到90% 以上。實(shí)施例3.紫杉醇-白蛋白納米粒的制備100 mg紫杉醇溶解在10 mL pH4. 8的緩沖液中，冰水浴30分鐘，滴加7. 5 mL 0°C預(yù)冷 的丙酮，繼續(xù)冰浴1小時(shí)。離心，收集沉淀，向沉淀中加入1 mL 10 mg/mL的紫杉醇(丙酮溶 解)，超聲混勻，加入50 mL生理鹽水，磁力攪拌，形成懸液。用BIC 90plus Particle Size Analyzer進(jìn)行粒徑分析，結(jié)果為150 220 nm。凍干的樣品能復(fù)溶，HPLC分析載藥量為 8. 34%ο附加實(shí)驗(yàn)表明甘氨酸，甘露醇，乳糖和海藻糖均能作為凍干保護(hù)劑，且用乳糖做凍 干保護(hù)劑得到的粒徑最小。
在制備過程中，我們考察了不同的緩沖液(水，生理鹽水，磷酸鹽緩沖液，醋酸鹽緩 沖液，甘氨酸，三羥甲基氨基甲烷，海藻糖，甘露醇，蔗糖，乙酰色氨酸，辛酸鈉和葡萄糖溶液 等)以及不同的PH對(duì)粒徑和載藥量的影響，結(jié)果表明pH在8.0較好。但是pH又不能超過 8. 5，因?yàn)樗幚砘钚晕镔|(zhì)在pH超過8. 5的時(shí)候會(huì)分解。實(shí)施例4.紫杉醇-轉(zhuǎn)鐵蛋白納米粒的制備100 mg轉(zhuǎn)鐵蛋白溶于50 mL pH7. 4的TRIS緩沖液中，75°C攪拌，加入350 μ L 2-巰基 乙醇，反應(yīng)持續(xù)10分鐘，緩慢加入1 mL 10 mg/mL的紫杉醇(乙醇溶解)。測(cè)得粒徑分布在 154. 4 nm (BIC 90plus Particle Size Analyzer)。在制備過程中，我們考察了不同溫度對(duì)粒徑和載藥量的影響，結(jié)果表明溫度在0°C 到100°C之間均能夠形成納米粒，在55 75°C形成的納米粒更好。實(shí)施例5.多烯紫杉醇-轉(zhuǎn)鐵蛋白納米粒的制備100 mg轉(zhuǎn)鐵蛋白溶于50 mL pH7. 4的TRIS緩沖液中，65°C攪拌，加入350 μ L 2-巰基 乙醇，反應(yīng)持續(xù)10分鐘，加入5 mL 10 mg/mL的多烯紫杉醇(乙醇溶解)。測(cè)得平均粒徑為 177. 1 nm (BIC 90plus Particle Size Analyzer)。若2-巰基乙醇和其他無機(jī)鹽配合使用，可以得到更好的粒徑結(jié)果，比如水，氯化 鈉，磷酸鹽，醋酸鹽，甘氨酸，三羥甲基氨基甲烷，過氧化氫，谷胱甘肽，葡萄糖，蔗糖，甘露 醇，海藻糖，乙酰色氨酸和辛酸鈉等。當(dāng)這些無機(jī)鹽與2-巰基乙醇混合作為變性劑時(shí)，粒 子直徑分布更窄，其中，三羥甲基氨基甲烷，乙酰色氨酸和辛酸鈉的粒子分布最窄，大約為 80 130 nm。實(shí)施例6.藤黃酸-白蛋白納米粒的制備100 mg HSA溶于10 mL純水中。55°C攪拌，所得溶液和等體積的5%三氯乙酸溶液混 合并且離心，除去上清。加入含有藤黃酸的乙醇溶液混合，然后加入50 mL pH8.0的TRIS， 攪拌直至蛋白沉淀完全溶解。所得的納米粒粒徑為110 nm (BIC 90plus Particle Size Analyzer)。實(shí)施例7.紫杉醇-血紅蛋白納米粒的制備-20°C條件下，向10 mL3%的血紅蛋白水溶液中緩慢加入300 mL含有3 mL 2 M的HCl的 丙酮溶液。溶液強(qiáng)力攪拌15分鐘，然后離心15分鐘。待殘余的丙酮蒸發(fā)掉以后，收集沉淀， 溶解在冷的去離子水里，在2°C條件下用去離子水透析5個(gè)小時(shí)，然后用0.0016 M NaHCO3 透析30小時(shí)，過濾得到珠蛋白溶液。取7 mL上述的珠蛋白溶液加入28 mL水，得到1 mg/mL的蛋白溶液。在2 8°C 條件下加入0.7 mL含10 mg/mL紫杉醇的乙醇溶液，攪拌直至形成淺藍(lán)色溶液。所得粒子 平均粒徑為 308. 1 nm (BIC 90plus Particle Size Analyzer)。實(shí)施例8.pH對(duì)納米粒粒徑的影響考察本發(fā)明考察了不同PH的磷酸鹽緩沖液以及它們對(duì)納米粒粒徑的影響。所有的蛋白溶 液組中均加入15%的紫杉醇(10 mg/mL)，粒徑在恒溫條件下測(cè)定，結(jié)果如圖1所示。實(shí)施例9.紫杉醇-白蛋白納米粒的動(dòng)態(tài)光散射(dynamic light scaterring, DLS)分析對(duì)按照本發(fā)明的方法制備的紫杉醇-白蛋白納米粒進(jìn)行粒徑分析，所用儀器為BIC 90plus Particle Size Analyzer。結(jié)果如圖4所示，平均粒徑為121 nm，且粒徑分布在較窄的范圍內(nèi)。實(shí)施例10. 紫杉醇-白蛋白納米粒的透射電鏡(Transmission Electron Microscopy, TEM)表征按照本發(fā)明制備載藥量為10. 59%的紫杉醇-白蛋白納米粒進(jìn)行透射電鏡的分析。所 用儀器為EM 2100型200KV高分辨率透射電鏡(日本)。結(jié)果如圖2所示，顯示納米粒子呈 球形。實(shí)施例11. 復(fù)溶的紫杉醇-白蛋白納米粒的穩(wěn)定性研究?jī)龈傻玫降淖仙即?白蛋白塊狀物用生理鹽水，5%的葡萄糖和小牛血清分別溶解成紫 杉醇濃度為5 mg/mL, 5 mg/mL和2 mg/mL的溶液。分別在25°C和37°C放置12小時(shí)后，納 米粒的平均粒徑?jīng)]有變化(DLS，BIC 90plus Particle Size Analyzer)，且沒有沉淀產(chǎn)生。 結(jié)果如表1所示。表1紫杉醇-白蛋白納米粒的穩(wěn)定性研究
權(quán)利要求
1.一種制備用于體內(nèi)遞送藥理活性物質(zhì)的蛋白納米粒的方法，包括以下步驟(a)用第一種溶劑溶解蛋白獲得蛋白溶液；(b)在變性劑或者適合的變性條件下，將藥理活性物質(zhì)加入步驟(a)中所述的蛋白 溶液中，使蛋白展開與再折疊或自組裝，把藥理活性物質(zhì)包入蛋白，形成蛋白納米粒。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的蛋白納米粒的平均粒徑為25nm 500 nm。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的蛋白納米粒的平均粒徑為50nm 300 nm。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的藥理活性物質(zhì)在納米粒中所占的重量比是1% 40%ο
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的藥理活性物質(zhì)是疏水性藥理活性物質(zhì)。
6.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述的疏水性藥理活性物質(zhì)是紫杉醇、多 西紫杉醇、伊立替康、5-氟尿嘧啶、卡莫司汀、阿霉素、苯芥膽留醇、哌泊舒凡、他莫昔芬、洛 莫司汀、藤黃酸、冬凌草甲素、鬼白毒素、阿托伐他汀、斯伐他汀、非諾貝特、硝苯地平、布洛 芬、吲哚美辛、吡羅昔康、格列本脲、地西泮、利哌利酮、齊拉西酮、他克莫司、雷帕霉素、茚地 那韋、利托那韋、Telaprevir、洛匹那韋、或它們的組合。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的藥理活性物質(zhì)是親水性藥理活性物質(zhì)。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于所述的親水性藥理活性物質(zhì)是環(huán)磷酰胺、 博萊霉素、道諾霉素、表柔比星、甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶或其類似物、鉬或其類似物、長(zhǎng)春堿 或其類似物、高三尖杉酯堿或其衍生物、放線菌素-D、絲裂霉素-C、依托泊苷、或它們的組合。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的蛋白是白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、胰島素、 血管內(nèi)皮抑素、血紅蛋白、肌紅蛋白、溶菌酶、免疫球蛋白、α-2-巨球蛋白、纖維連接蛋白、 纖層蛋白、膠原蛋白、明膠、人造多肽與蛋白、或它們的組合。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟(a)的第一種溶劑是水、生理鹽 水、糖、凍干保護(hù)劑或蛋白穩(wěn)定劑。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于所述的凍干保護(hù)劑是磷酸鹽、醋酸鹽、甘 氨酸、三羥甲基氨基甲烷、葡萄糖或它們的組合。
12.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于所述的蛋白穩(wěn)定劑是海藻糖、甘露醇、蔗 糖、乙酰色氨酸、辛酸鈉或它們的組合。
13.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的步驟(a)的操作溫度為-20 100°C。
14.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的步驟(a)的操作溫度為55 75 °C。
15.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的步驟(a)的操作pH值為pH3 9。
16.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的步驟(b)中的變性劑或者適合的變 性條件是水、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、無機(jī)鹽、有機(jī)溶劑、結(jié)構(gòu)展開劑或表面活性劑。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其特征在于所述的無機(jī)鹽是水、氯化鈉、磷酸鹽、醋 酸鹽、甘氨酸、三羥甲基氨基甲烷、過氧化氫、谷胱甘肽、葡萄糖、蔗糖、甘露醇、海藻糖、乙酰 色氨酸、辛酸鈉、或它們的組合。
18.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其特征在于所述的有機(jī)溶劑是甲醇、乙醇、丙醇、異 丙醇、福爾馬林、氯仿、丙酮、硫化氫、或它們的組合。
19..根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其特征在于所述的結(jié)構(gòu)展開劑是水、2-巰基乙醇、 二硫蘇糖醇、鹽酸胍、尿素、高氯酸、三丁基膦、甲巰丙脯氨酸、過甲酸、青霉胺、谷胱甘肽、甲 硫咪唑、乙酰半胱氨酸、三氯乙酸、或它們的組合。
20.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其所述的變性劑或者適合的變性條件是水、磷酸鹽、 醋酸鹽、甘氨酸、三羥甲基氨基甲烷、氯化鈉、葡萄糖、乙醇、丙酮、硫化氫、2-巰基乙醇、尿 素、或它們的組合。
21.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的方法進(jìn)一步包括(c)將納米粒透 析除去多余的小分子化合物或者進(jìn)一步濃縮。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其特征在于所述的方法進(jìn)一步包括(d)將透析后的 納米粒經(jīng)過脫水步驟制備成藥物制劑。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其特征在于所述的脫水步驟是凍干、減壓蒸餾或噴 霧干燥。
24.一種制備用于體內(nèi)遞送疏水性物質(zhì)的蛋白納米粒的方法，包括以下步驟(a)在-20 100°C，pH3 9的條件下，用第一種溶劑溶解所述蛋白獲得蛋白溶液； (b)在變性劑或者合適的變性條件下，將藥理活性物質(zhì)加入到步驟(a)所述的蛋白溶液 中，使蛋白展開與再折疊或自組裝，將藥物包裹在所述蛋白中；所述的納米粒子直徑25 nm 500 nm,所述蛋白納米粒含有1% 40%重量比的疏水 性藥理活性物質(zhì)；所述的疏水性藥理活性物質(zhì)是紫杉醇、多西紫杉醇、伊立替康、卡莫司汀、阿霉素、苯芥 膽甾醇、哌泊舒凡、他莫昔芬、洛莫司汀、藤黃酸、冬凌草甲素、鬼白毒素、阿托伐他汀、斯伐 他汀、非諾貝特、硝苯地平、布洛芬、噴哚美辛、吡羅昔康、格列本脲、地西泮、利哌利酮、齊拉 西酮、他克莫司、雷帕霉素、茚地那韋、利托那韋、Telaprevir、洛匹那韋或它們的組合；所述的蛋白是白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、胰島素、血管內(nèi)皮抑素、血紅蛋白、肌球蛋白、溶菌酶、 免疫球蛋白、α-2-巨球蛋白、纖連蛋白、核纖層蛋白、膠原蛋白、明膠、人造蛋白、或它們的 組合；所述的第一種溶劑是水、氯化鈉、磷酸鹽、醋酸鹽、甘氨酸、三羥甲基氨基甲烷、過氧化 氫、谷胱甘肽、葡萄糖、海藻糖、甘露醇、蔗糖、乙酰色氨酸、辛酸鈉、或它們的組合；所述的變性劑或者適合的變性條件是水、氯化鈉、磷酸鹽、醋酸鹽、甘氨酸、三羥甲基 氨基甲烷、過氧化氫、谷胱甘肽、甲醇、乙醇、異丙醇、福爾馬林、氯仿、丙酮、硫化氫、2-巰基 乙醇、二硫蘇糖醇、鹽酸胍、尿素、高氯酸、三丁基膦、甲巰丙脯氨酸、過甲酸、青霉胺、谷胱甘 肽、甲硫咪唑、乙酰半胱氨酸、三氯乙酸、或它們的組合。
25.根據(jù)權(quán)利要求M所述的方法，其特征在于所述的方法進(jìn)一步包括(c)將納米粒透析除去多余的小分子化合物或者進(jìn)一步濃縮。
26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其特征在于所述方法進(jìn)一步包括(d)將透析后的納米粒經(jīng)過脫水步驟制備成藥物制劑。
27.根據(jù)權(quán)利要求沈所述的方法，其特征在于所述的脫水步驟是凍干、減壓蒸餾或噴霧干燥。
28.一種制備用于體內(nèi)遞送紫杉醇蛋白納米粒的方法，包括以下步驟(a)在55 75°C，pH6 8的條件下，用第一種溶劑溶解所述蛋白獲得蛋白溶液；(b)在變性劑或者適合的變性條件下，將紫杉醇加入到步驟(a)所述的蛋白溶液中， 使蛋白展開與再折疊或自組裝，將紫杉醇包裹在所述蛋白中；(c)將納米粒透析除去多余的小分子化合物或者進(jìn)一步濃縮；(d)將透析后的納米粒經(jīng)過脫水步驟制備成藥物制劑；所述的納米粒子直徑為50 nm 300 nm,所述蛋白納米粒含有1% 40%重量比的紫 杉醇；所述的變性劑或者適合的變性條件是水、氯化鈉、磷酸鹽、醋酸鹽、甘氨酸、三羥甲基氨 基甲烷、過氧化氫、谷胱甘肽、甲醇、乙醇、丙醇、異丙醇、福爾馬林、氯仿、丙酮、硫化氫、2-巰 基乙醇、二硫蘇糖醇、鹽酸胍、尿素、高氯酸、三丁基膦、甲巰丙脯氨酸、過甲酸、青霉胺、谷胱 甘肽、甲硫咪唑、乙酰半胱氨酸、或它們的組合；所述的蛋白是白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、胰島素、血管內(nèi)皮抑素、血紅蛋白、肌球蛋白、溶菌酶、 免疫球蛋白、α-2-巨球蛋白、纖連蛋白、核纖層蛋白、膠原蛋白、明膠、人造蛋白、或它們的 組合。
29.一種制備用于體內(nèi)遞送多西紫杉醇蛋白納米粒的方法，所述方法包括下面步驟(a)在55 75°C，pH6 8的條件下，用第一種溶劑溶解所述蛋白獲得蛋白溶液；(b)在變性劑或者適合的變性條件下，將多西紫杉醇加入到步驟(a)所述的蛋白溶液 中，使蛋白展開與再折疊或自組裝，將多西紫杉醇包裹在所述蛋白中；(c)將納米粒透析除去多余的小分子化合物或者進(jìn)一步濃縮；(d)將透析后的納米粒經(jīng)過脫水步驟制備成藥物制劑；所述的納米粒子直徑為50 nm 300 nm，所述蛋白納米粒含有1% 40%重量比的多西 紫杉醇；所述的變性劑或者適合的變性條件是水、氯化鈉、磷酸鹽、醋酸鹽、甘氨酸、三羥甲基氨 基甲烷、過氧化氫、谷胱甘肽、甲醇、乙醇、丙醇、異丙醇、福爾馬林、氯仿、丙酮、硫化氫、2-巰 基乙醇、二硫蘇糖醇、鹽酸胍、尿素、高氯酸、三丁基膦、甲巰丙脯氨酸、過甲酸、青霉胺、谷胱 甘肽、甲硫咪唑、乙酰半胱氨酸、或它們的組合；所述的蛋白是白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、胰島素、血管內(nèi)皮抑素、血紅蛋白、肌球蛋白、溶菌酶、 免疫球蛋白、α-2-巨球蛋白、纖連蛋白、核纖層蛋白、膠原蛋白、明膠、人造蛋白、或它們的 組合。
30.一種包含有藥理活性物質(zhì)的蛋白納米粒，用于體內(nèi)藥物遞送；其特征在于所述的 納米粒的制備步驟通過以下方法(a)在-20 100°C，pH3 9的條件下，用第一種溶劑溶解所述蛋白獲得蛋白溶液；(b)在變性劑或者適合的變性條件下，將藥理活性物質(zhì)加入到步驟(a)所述的蛋白 溶液中，使蛋白展開與再折疊或自組裝，將藥物包裹在所述蛋白中；所述的納米粒子直徑為5 nm 2000 nm,所述蛋白納米粒含有1% 40%重量比的疏水性藥理活性物質(zhì)；所述的藥理活性物質(zhì)是紫杉醇、多西紫杉醇、伊立替康、卡莫司汀、阿霉素、苯芥膽甾 醇、哌泊舒凡、他莫昔芬、洛莫司汀、藤黃酸、冬凌草甲素、鬼白毒素、阿托伐他汀、斯伐他汀、 非諾貝特、硝苯地平、布洛芬、噴哚美辛、吡羅昔康、格列本脲、地西泮、利哌利酮、齊拉西酮、 他克莫司、雷帕霉素、茚地那韋、利托那韋、Telaprevir、洛匹那韋、或它們的組合；所述的蛋白是白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、胰島素、血管內(nèi)皮抑素、血紅蛋白、肌球蛋白、溶菌酶、 免疫球蛋白、α-2-巨球蛋白、纖連蛋白、核纖層蛋白、膠原蛋白、明膠、人造蛋白、或它們的 組合；所述的第一種溶劑是水、氯化鈉、磷酸鹽、醋酸鹽、甘氨酸、三羥甲基氨基甲烷、過氧化 氫、谷胱甘肽、葡萄糖、海藻糖、甘露醇、蔗糖、乙酰色氨酸、辛酸鈉、或它們的組合；所述的變性劑或者適合的變性條件是水、氯化鈉、磷酸鹽、醋酸鹽、甘氨酸、三羥甲基氨 基甲烷、過氧化氫、谷胱甘肽、甲醇、乙醇、丙醇、異丙醇、福爾馬林、氯仿、丙酮、硫化氫、2-巰 基乙醇、二硫蘇糖醇、鹽酸胍、尿素、高氯酸、三丁基膦、甲巰丙脯氨酸、過甲酸、青霉胺、谷胱 甘肽、甲硫咪唑、乙酰半胱氨酸、或它們的組合。
31.一種包含有紫杉醇的蛋白納米粒，用于體內(nèi)藥物遞送；其特征在于所述的納米粒 的制備步驟通過以下方法(a)在55 75°C，pH6 8的條件下，用第一種溶劑溶解所述蛋白獲得蛋白溶液；(b)在變性劑或者適合的變性條件下，將紫杉醇加入到步驟(a)所述的蛋白溶液中， 使蛋白展開與再折疊或自組裝，將紫杉醇包裹在所述蛋白中；(c)將納米粒透析除去多余的小分子化合物或者進(jìn)一步濃縮；(d)將透析后的納米粒經(jīng)過脫水步驟制備成藥物制劑；所述的納米粒子直徑為50 nm 300 nm,所述蛋白納米粒含有1% 40%重量比的紫 杉醇；所述的變性劑或者適合的變性條件是水、氯化鈉、磷酸鹽、醋酸鹽、甘氨酸、三羥甲基氨 基甲烷、過氧化氫、谷胱甘肽、甲醇、乙醇、丙醇、異丙醇、福爾馬林、氯仿、丙酮、硫化氫、2-巰 基乙醇、二硫蘇糖醇、鹽酸胍、尿素、高氯酸、三丁基膦、甲巰丙脯氨酸、過甲酸、青霉胺、谷胱 甘肽、甲硫咪唑、乙酰半胱氨酸、或它們的組合；所述的蛋白是白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、胰島素、血管內(nèi)皮抑素、血紅蛋白、肌球蛋白、溶菌酶、 免疫球蛋白、α-2-巨球蛋白、纖連蛋白、核纖層蛋白、膠原蛋白、明膠、人造蛋白、或它們的 組合。
32.一種包含有多西紫杉醇的蛋白納米粒，用于體內(nèi)藥物遞送；其特征在于所述的納 米粒的制備步驟通過以下方法(a) 在55 75°C，pH6 8的條件下，用第一種溶劑溶解所述蛋白獲得蛋白溶液；(b)在變性劑或者適合的變性條件下，將多西紫杉醇加入到步驟(a)所述的蛋白溶液 中，使蛋白展開與再折疊或自組裝，將多西紫杉醇包裹在所述蛋白中；(c)將納米粒透析除去多余的小分子化合物或者進(jìn)一步濃縮；(d)將透析后的納米粒經(jīng)過脫水步驟制備成藥物制劑；其中所述的納米粒子直徑為50 nm 300 nm,所述蛋白納米粒含有1% 40%重量比 的多西紫杉醇；所述的變性劑或者適合的變性條件是水、氯化鈉、磷酸鹽、醋酸鹽、甘氨酸、三羥甲基氨 基甲烷、過氧化氫、谷胱甘肽、甲醇、乙醇、丙醇、異丙醇、福爾馬林、氯仿、丙酮、硫化氫、2-巰 基乙醇、二硫蘇糖醇、鹽酸胍、尿素、高氯酸、三丁基膦、甲巰丙脯氨酸、過甲酸、青霉胺、谷胱 甘肽、甲硫咪唑、乙酰半胱氨酸、或它們的組合；所述的蛋白是白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、胰島素、血管內(nèi)皮抑素、血紅蛋白、肌球蛋白、溶菌酶、 免疫球蛋白、α-2-巨球蛋白、纖連蛋白、核纖層蛋白、膠原蛋白、明膠、人造蛋白、或它們的 組合。
全文摘要
本發(fā)明一種制備用于體內(nèi)遞送藥理活性物質(zhì)的蛋白納米粒的方法，屬于藥理活性物質(zhì)的體內(nèi)遞送及其臨床應(yīng)用領(lǐng)域。本發(fā)明利用蛋白及多肽展開與再折疊或自組裝的方法，將藥理活性物質(zhì)包入蛋白納米粒，用于體內(nèi)遞送。
文檔編號(hào)A61K31/337GK102048695SQ20101024788
公開日2011年5月11日 申請(qǐng)日期2010年8月9日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月11日
發(fā)明者丁大偉, 吳錦慧, 湯曉雷, 胡一橋, 袁阿虎 申請(qǐng)人:南京大學(xué)