專利名稱：杜仲葉提取物及其制備方法和應用的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明屬于中藥領域，具體涉及ー種杜仲葉提取物及其制備方法和應用。
背景技術(shù)：
杜仲為杜仲科植物杜仲(Eucommia ulmoides Oliver)的干燥樹皮,是中國名貴滋補藥材。具補肝腎、強筋骨、降血壓、安胎等諸多功效?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》列為上品。謂其“主治腰膝痛，補中，益精氣，堅筋骨，除陰下癢濕，小便余浙。久服，輕身耐老?！倍胖偈侵袊赜兴幉?，其藥用歷史悠久，在臨床有著廣泛的應用。迄今已在地球上發(fā)現(xiàn)杜仲屬植物多達14種，后來它們在大陸和歐洲相繼滅絕。存在于中國的杜仲是杜仲科杜仲屬僅存的孑遺植物，它不僅有很高的經(jīng)濟價值?！そ陙恚瑖鴥?nèi)外專家對杜仲成分進行了反復細致的研究，發(fā)現(xiàn)杜仲中含有對人體所必須的蘇氨酸，蛋氨酸，異亮氨酸，賴氨酸等17種游離氨基酸，以及鋅，銅，鎂，鐵，鈣，磷，鉀等15種微量元素。杜仲具有補肝腎，強筋骨，清除體內(nèi)垃圾，加強人體細胞物質(zhì)代謝，防止肌肉骨骼老化，平衡人體血壓，分解體內(nèi)膽固醇，降低體內(nèi)脂肪，恢復血管弾性，利尿清熱，廣譜抗菌，興奮中樞神經(jīng)，提高白血球數(shù)量，增強人體免疫力等顯著功效?，F(xiàn)有的杜仲入藥部位為杜仲皮，杜仲皮的采集方法為將栽培10年以上的杜仲，用半環(huán)剝法剝?nèi)淦ず筮M行加工。由于杜仲樹數(shù)量稀少，且為保證藥材的質(zhì)量需要杜仲生長至10年或以上的樹齡才能采集杜仲皮，同時由于杜仲的藥用價值巨大，所以致使其價格
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發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種杜仲葉水和/或低級醇提取物，包括杜仲葉粗提物和杜仲葉精提物。本發(fā)明的又一目的在于提供杜仲葉水和/或低級醇提取物在制備抗骨折藥物中的應用。本發(fā)明的目的可以通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)一種杜仲葉水和/或低級醇提取物，其在于所述的杜仲葉水和/或低級醇提取物包括杜仲葉用水或者低級醇提取，或者用水和低級醇混合提取得到的粗提物，以及所述粗提物精制后得到的精制杜仲葉提取物。水提取杜仲葉制備杜仲葉粗提物的方法杜仲葉藥材干燥粉碎后，用水提取三次，各次所用水的質(zhì)量依次為杜仲葉藥材質(zhì)量的10倍、10倍和9倍，每次提取的回流時間依次為2h、l. 5h和lh，將三次提取液過濾后，合并濾液并濃縮至小體積得到杜仲葉粗提物。こ醇提取杜仲葉制備杜仲葉粗提物的方法杜仲葉藥材干燥粉碎后，用體積百分濃度為45% 55%的こ醇溶液提取三次，各次所用こ醇溶液質(zhì)量依次為杜仲葉藥材質(zhì)量的10倍、8倍和6倍，每次提取的回流時間依次為2h、I. 5h和lh，將三次提取液過濾后合并，回收こ醇，得醇提液；將醇提液濃縮至小體積得到杜仲葉粗提物。
水和こ醇混合提取杜仲葉制備杜仲葉粗提物的方法杜仲葉藥材干燥粉碎后，用體積百分濃度為45% 55%的こ醇溶液提取三次，各次所用こ醇溶液質(zhì)量依次為杜仲葉藥材質(zhì)量的10倍、8倍和6倍，每次提取的回流時間依次為2h、I. 5h和lh，將三次提取液過濾后合井，回收こ醇，得醇提液；こ醇提取后的藥渣加10倍量水煎煮2h，得水提液；將水提液和醇提液 合并后濃縮至小體積得到杜仲葉粗提物。水和こ醇混合提取杜仲葉時，對粗提物進行精制的方法為先將水提液濃縮后用體積百分濃度不低于90%的こ醇沉淀后與所述的醇提液合并，然后依次經(jīng)HPD100大孔樹脂富集和聚酰胺樹脂純化得到精制杜仲葉提取物。所述的HPD100大孔樹脂富集和聚酰胺樹脂純化過程為將こ醇沉淀后的水提液與所述的醇提液合并后加水調(diào)節(jié)濃度為O. Olg藥材/ml，同時調(diào)節(jié)pH = 4，得到上樣液，上HPD100大孔樹脂吸附柱，經(jīng)體積百分濃度為50 60%的こ醇洗脫，減壓回收洗脫液中的こ醇至無醇味，得HPD100大孔樹脂洗脫液；將HPD100大孔樹脂洗脫液調(diào)節(jié)至濃度為O. Olg藥材/ml，上30_60目聚酰胺樹脂柱經(jīng)體積百分濃度為40% 50%的こ醇洗脫得洗脫液，然后減壓回收洗脫液中的こ醇后，繼續(xù)減壓蒸出水溶液，至小體積，為洗脫濃縮液；將洗脫濃縮液經(jīng)65 70°C，在負壓O. OSMpa條件下進行干燥，得精制杜仲葉提取物。精制的杜仲葉提取物中包含4種黃酮類化合物和綠原酸，所述的4種黃酮類化合物為蘆丁、異槲皮苷、紫云英苷、槲皮素-3-0- a -L-吡喃阿拉伯糖基-(I — 2) - β -D-葡萄糖基苷，所述的精制后杜仲葉提取物中4種黃酮類化合物和綠原酸的質(zhì)量百分含量不低于50%。一種促進骨折愈合的藥物，其在于由治療有效量的杜仲葉水和/或低級醇提取物加上藥學上可接受的輔料或輔助性成分制成制劑，所述的制劑包括丸剤、散剤、膠囊、片劑、顆粒劑、注射或復方制劑。上杜仲葉水和/或低級醇提取物在制備促進骨折愈合的藥物中的應用。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明提供杜仲葉提取物可以顯著增加堿性磷酸酶，降低血鈣，増加血磷，増加骨密度，能明顯促進骨折后骨的愈合。另外，研究社仲葉的提取物的應用，可增加杜仲植物的藥用部位，擴大其應用范圍，并由于杜仲葉與杜仲皮相比，更易獲得，可降低杜仲的成本。
具體實施例方式實施例I杜仲葉提取物的制備I.水提取杜仲葉制備杜仲葉粗提物(即杜仲葉水提取液)杜仲葉(無錫市宜興市張渚鎮(zhèn)藥材種植園采集)藥材干燥，剪碎(剪碎粒度I 3mm2)，用水提取三次，各次所用水的質(zhì)量依次為杜仲葉藥材質(zhì)量的10倍、10倍和9倍，每次提取的回流時間依次為2h、l. 5h和lh，將三次提取液過濾后，合并濾液并濃縮至2. 857g生藥/ml,得到杜仲葉粗提物。II.こ醇提取杜仲葉制備杜仲葉粗提物(即杜仲葉醇提取液)杜仲葉(無錫市宜興市張渚鎮(zhèn)藥材種植園采集)藥材干燥，剪碎(剪碎粒度I 3mm2)，按質(zhì)量計，加入10倍量體積百分濃度為50%的こ醇浸泡2h，回流2h，過濾得到第一次提取液；加入8倍量體積百分濃度為50%こ醇回流I. 5h，過濾得到第二次提取液；加入6倍量體積百分濃度為50%こ醇回流lh，過濾得到第三次提取液；合并三次提取液，回收こ醇，并濃縮至2. 857g生藥/ml，得到杜仲葉粗提物。III.水和こ醇混合提取杜仲葉制備杜仲葉粗提物(即杜仲葉醇水混合提取液)杜仲葉(無錫市宜興市張渚鎮(zhèn)藥材種植園采集)藥材干燥，剪碎(剪碎粒度I 3mm2)，按質(zhì)量計，加入10倍量體積百分濃度為50%こ醇浸泡2h，回流2h，過濾得到第一次提取液；加入8倍量體積百分濃度為50%こ醇回流I. 5h，過濾得到第二次提取液；加入6倍量體積百分濃度為50%こ醇回流lh，過濾得到第三次提取液；合并三次提取液，回收こ醇，得醇提液。こ醇提取后的藥渣加10倍量水煎煮2h，得水提液。合并醇提液與水提液，并濃縮至2. 857g生藥/ml,得到杜仲葉粗提物。 IV.制備精制杜仲葉提取物杜仲葉藥材經(jīng)醇、水混合提取后，水提液經(jīng)こ沉淀后與醇提液合并，再經(jīng)HPD100大孔樹脂富集和聚酰胺純化后可以制備得到精制杜仲葉提取物。I.藥材提取方法杜仲葉(無錫市宜興市張渚鎮(zhèn)藥材種植園采集)藥材干燥，剪碎(剪碎粒度I 3mm2)，按質(zhì)量計加入10倍量體積百分濃度為50%的こ醇浸泡2h，回流2h，過濾得到第一次提取液；加入8倍量體積百分濃度為50%的こ醇回流I. 5h，過濾得到第二次提取液；加入6倍量體積百分濃度為50%的こ醇回流lh，過濾得到第三次提取液。合并三次提取液，回收こ醇至無醇味，得醇提液。こ醇提取后的藥渣加10倍量水煎煮2h，得提取液。水浴濃縮，以水定容至濃度為Ig生藥/ml的水提液。2.水提液的こ醇沉淀方法取濃度為Ig生藥/ml的水提液，加入體積百分濃度為95%的こ醇液，使體系中こ醇濃度達到70%，靜置2h，過濾，得濾液。沉淀物用體積百分濃度為50%的こ醇液反復洗滌，合并洗滌液到濾液之中?；厥栅炒贾翢o醇味，得こ醇沉淀后的水提液。3.杜仲葉總提取液的制備方法合并杜仲葉的醇提液和こ醇沉淀后的水提液，得杜仲葉總提取液。4. HPD100大孔樹脂富集方法HPD100大孔樹脂預處理方法將HPD100大孔樹脂適量，用I. 5倍體積的95%こ醇浸泡12h，去掉懸浮物，裝柱，用95%こ醇洗柱，至流出液加水無渾濁為止。換用蒸餾水沖洗，洗至無醇味。柱子的徑高比I 9。上樣液的制備取杜仲葉總提取液，加水調(diào)節(jié)濃度為O. Olg藥材/ml，同時加入適量濃鹽酸，使體系的PH = 4，該液體為HPD100大孔樹脂上樣液。上樣量lg藥材/Ig干樹脂，Ig干樹脂=濕樹脂4. 4ml。即lOOmlHPDlOO大孔樹脂上樣液需要4. 4ml濕樹脂。上樣流速6BV/h。除雜條件使用2BV的pH = 4的鹽酸水溶液除雜，以2BV/h流速沖洗。こ醇洗脫條件用體積百分濃度為55%的こ醇洗脫，速度2BV/h，洗脫體積為6BV。
洗脫液的回收減壓回收洗脫液中的こ醇至無醇味，得HPD100大孔樹脂洗脫液。樹脂再生方法樹脂經(jīng)95%こ醇沖洗至無色，即可再次使用。4.聚酰胺樹脂純化方法30-60目聚酰胺樹脂預處理方法采用I. 5倍量的95%こ醇浸泡12h，去掉懸浮物，裝柱，95%こ醇洗柱，至流出液加水無渾濁。再換用蒸餾水沖洗，至無こ醇流出。柱子的徑高比徑高比為I : 10。上樣液的制備取HPD100大孔樹脂洗脫液，加水調(diào)節(jié)濃度為O. Olg藥材/ml，為30-60目聚酰胺樹脂上樣液。上樣量上樣量為O. 5g藥材/Ig干聚酰胺樹脂，Ig聚酰胺樹脂干樹脂=濕樹脂4.4ml。即100ml30-60目聚酰胺樹脂上樣液需要8. 8ml濕的聚酰胺樹脂。 上樣流速上樣流速為2BV/h。こ醇洗脫條件用體積百分濃度為45%的こ醇洗脫，以4BV/h的流速進行，洗脫液的用量8BV。洗脫液的回收減壓回收洗脫液中的こ醇后，繼續(xù)減壓蒸出水溶液，至小體積，為洗脫濃縮液。干燥經(jīng)65 70°C，在負壓O. OSMpa條件下進行干燥，得精制杜仲葉提取物。樹脂再生方法使用2-3% Na0H2BV浸泡過夜，水溶液洗至中性無色，再用95%こ醇洗至無色，即可再次使用。精制杜仲葉提取物的得率約為3. 5%。實施例2精制杜仲葉提取物中各成分含量檢測方法采用HPLC法，同時檢測杜仲葉提取物中的5種成分的含量，它們分別為綠原酸，槲皮素-3-0-a-L-吡喃阿拉伯糖基-(I — 2)-β-D-葡萄糖基苷(以下簡稱為DY_1)，蘆丁，異槲皮苷，紫云英苷。使用外標一點法計算杜仲葉提取物樣品中各成分含量。I.樣品配制I. I混合對照品的配制精密稱取綠原酸對照品4. 89mg,體積百分濃度為50%的こ醇溶解，定容至10ml，得到濃度為489 μ g/ml的綠原酸對照品溶液；精密稱取DY-I對照品6. 43mg,體積百分濃度為50%的こ醇溶解，定容至10ml，得到濃度為643 μ g/ml的DY-I對照品溶液；精密稱取蘆丁對照品I. 69mg,體積百分濃度為50%的こ醇溶解，定容至10ml，得到濃度為169 μ g/ml的蘆丁對照品溶液；精密稱取異槲皮苷對照品3. 15mg,體積百分濃度為50%的こ醇溶解，定容至10ml，得到濃度為315 μ g/ml的異槲皮苷對照品溶液；、
精密稱取紫云英苷對照品1.23mg，體積百分濃度為50 %的こ醇溶解，定容至10ml，得到濃度為123 μ g/ml的紫云英苷對照品溶液；分別精密吸取綠原酸對照品溶液4. 5ml、DY-I對照品溶液1ml、蘆丁對照品溶液lml、異槲皮苷對照品溶液1ml、紫云英苷對照品溶液I. 5ml、槲皮素對照品溶液O. 3ml、山奈酚對照品溶液O. 2ml至IOml容量瓶，用體積百分濃度為50%的こ醇定容至刻度，即得混合對照品溶液。各對照品濃度分別為綠原酸220. 05 μ g/ml，DY-164. 3 μ g/ml，蘆丁 16. 9 μ g/ml,異槲皮苷31. 5 μ g/ml,紫云英苷18. 45 μ g/ml。I. 2樣品的配制精密稱取實施例IIV制備的精制杜仲葉提取物20. lmg，用體積百分濃度為50%的こ醇溶解，定容至50ml，得到濃度為O. 402mg/ml的精制杜仲葉提取物溶液。2. HPLC色譜條件色譜柱Hedera C18,流動相:溶劑A(0. 1%甲酸こ腈,v/v)和溶劑B(0. 1%甲酸7jC, v/v)梯度洗脫，檢測波長270nm，進樣體積20 μ L，柱溫為30°C，流速I. Oml/min。流動相洗脫梯度變化見下表I。表I流動相洗脫梯度
權(quán)利要求
1.一種杜仲葉水和/或低級醇提取物，其特征在于所述的杜仲葉水和/或低級醇提取物包括杜仲葉用水或者低級醇提取，或者用水和低級醇混合提取得到的粗提物，以及所述粗提物精制后得到的精制杜仲葉提取物。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的杜仲葉水和/或低級醇提取物，其特征在于所述的杜仲葉水和/或低級醇提取物采用如下方法制備杜仲葉藥材干燥粉碎后，用水提取三次，各次所用水的質(zhì)量依次為杜仲葉藥材質(zhì)量的10倍、10倍和9倍，每次提取的回流時間依次為2h、I. 5h和lh，將三次提取液過濾后，合并濾液并濃縮至小體積得到杜仲葉粗提物。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的杜仲葉水和/或低級醇提取物，其特征在于所述的杜仲葉水和/或低級醇提取物采用如下方法制備杜仲葉藥材干燥粉碎后，用體積百分濃度為45% 55%的こ醇溶液提取三次，各次所用こ醇溶液質(zhì)量依次為杜仲葉藥材質(zhì)量的10倍、8倍和6倍，每次提取的回流時間依次為2h、1.5h和lh，將三次提取液過濾后合并，回收こ醇，得醇提液；將醇提液濃縮至小體積得到杜仲葉粗提物。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的杜仲葉水和/或低級醇提取物，其特征在于所述的杜仲葉水和/或低級醇提取物采用如下方法制備杜仲葉藥材干燥粉碎后，用體積百分濃度為45% 55%的こ醇溶液提取三次，各次所用こ醇溶液質(zhì)量依次為杜仲葉藥材質(zhì)量的10倍、8倍和6倍，每次提取的回流時間依次為2h、l. 5h和lh，將三次提取液過濾后合井，回收こ醇，得醇提液；こ醇提取后的藥渣加10倍量水煎煮2h，得水提液；將水提液和醇提液合并后濃縮至小體積得到杜仲葉粗提物。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的杜仲葉水和/或低級醇提取物，其特征在于所述的杜仲葉粗提物采用如下方法進行精制先將水提液濃縮后用體積百分濃度不低于90%的こ醇沉淀后與所述的醇提液合井，然后依次經(jīng)HPD100大孔樹脂富集和聚酰胺樹脂純化得到精制杜仲葉提取物。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的杜仲葉水和/或低級醇提取物，其特征在于所述的HPD100大孔樹脂富集和聚酰胺樹脂純化過程為將こ醇沉淀后的水提液與所述的醇提液合并后加水調(diào)節(jié)濃度為O. Olg藥材/ml,同時調(diào)節(jié)pH = 4，得到上樣液，上HPD100大孔樹脂吸附柱，經(jīng)體積百分濃度為50 60%的こ醇洗脫，減壓回收洗脫液中的こ醇至無醇味，得HPD100大孔樹脂洗脫液； 將HPD100大孔樹脂洗脫液調(diào)節(jié)至濃度為O. Olg藥材/ml，上30-60目聚酰胺樹脂柱經(jīng)體積百分濃度為40% 50%的こ醇洗脫得洗脫液，然后減壓回收洗脫液中的こ醇后，繼續(xù)減壓蒸出水溶液，至小體積，為洗脫濃縮液；將洗脫濃縮液經(jīng)65 70°C，在負壓O. 08Mpa條件下進行干燥，得精制杜仲葉提取物。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的杜仲葉水和/或低級醇提取物，其特征在于所述的精制后杜仲葉提取物中包含4種黃酮類化合物和綠原酸，所述的4種黃酮類化合物為蘆丁、異槲皮苷、紫云英苷、槲皮素-3-0- a -L-吡喃阿拉伯糖基-(I — 2)-β -D-葡萄糖基苷，所述的精制后杜仲葉提取物中4種黃酮類化合物和綠原酸的質(zhì)量百分含量不低于50%。
8.一種促進骨折愈合的藥物，其特征在于由治療有效量的權(quán)利要求I 7中任意ー項所述的杜仲葉水和/或低級醇提取物加上藥學上可接受的輔料或輔助性成分制成制劑，所述的制劑包括丸劑、散劑、膠囊、片劑、顆粒劑、注射或復方制劑。
9.權(quán)利要求I 7中所述的任意一項杜仲葉水和/或低級醇提取物在制備促進骨折愈合的藥物中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開一種杜仲葉水和/或低級醇提取物及其制備方法和應用，包括杜仲葉用水或者低級醇提取，或者用水和低級醇混合提取得到的粗提物，以及所述粗提物精制后得到的精制杜仲葉提取物。該提取物在制備促進骨折愈合藥物中的應用效果顯著。本發(fā)明提供杜仲葉水和/或低級醇提取物可以顯著增加堿性磷酸酶，降低血鈣，增加血磷，增加骨密度，能明顯促進骨折后骨的愈合。另外，研究杜仲葉的提取物的應用，可增加杜仲植物的藥用部位，擴大其應用范圍，并由于杜仲葉與杜仲皮相比，更易獲得，可降低杜仲的成本。
文檔編號A61K127/00GK102670696SQ20121013419
公開日2012年9月19日 申請日期2012年5月3日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月3日
發(fā)明者張欣, 楊中林 申請人:中國藥科大學