專利名稱：一種球毛殼菌及其應(yīng)用的制作方法
一種球毛殼菌及其應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于產(chǎn)乙酰膽堿酯酶抑制微生物菌株篩選技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種球毛殼菌及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
近年來(lái)，隨著全世界人口老齡化時(shí)代的到來(lái)，老年癡呆已成為目前老年醫(yī)學(xué)面臨的最嚴(yán)峻的問題之一。因此，如何防治老年癡呆癥已成為全人類的關(guān)注焦點(diǎn)之一。研究發(fā)現(xiàn)乙釀膽堿酯酶(acetyl ch I i nesterase, AchE)存在于中樞突出間隙中，能夠催化降解神經(jīng)遞質(zhì)乙釀膽堿，從而阻止了神經(jīng)信號(hào)的傳遞，引起老年癡呆疾病，即阿爾茨海默氏病 (Alzheimer’ s Disease, AD)。因此，乙釀膽堿酯酶是一^t*酶抑制劑作用￥E點(diǎn)，可以用于治療阿爾茨海默氏病。乙釀膽堿酯酶抑制劑是美國(guó)FDA唯一允許作為治療老年癡呆癥的藥物，且只有4種藥物獲得FDA許可，分別為Tacr ine(他克林)、Donepezi I (多奈哌齊)、 Rivastigmine(利斯的明)、Ga I antami ne (加蘭他敏)。目前防治老年癡呆的藥物價(jià)格昂貴，且具有一定的副作用，不宜長(zhǎng)期服用，加之化學(xué)合成新的藥物難度較大，故天然AchE抑制劑的研究與開發(fā)成為研究的重點(diǎn)。
大自然資源豐富，是開發(fā)乙酰膽堿酯酶抑制劑的寶庫(kù)，現(xiàn)已報(bào)道有很多種植物中具有抑制AChE的活性成分，并且有望用來(lái)治療AD。20世紀(jì)90年代后期，在合成抑制劑和植物來(lái)源的抑制劑開發(fā)的同時(shí)，微生物來(lái)源的抑制劑的研究也在不斷進(jìn)步中。篩選出能夠合成乙酰膽堿酯酶抑制劑的海洋菌株具有重要的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)意義。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種球毛殼菌及其應(yīng)用，即從牡蠣中純化出的一種高產(chǎn)抑制 AchE活性的菌株，從而彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的不足。
本發(fā)明分離的球毛殼菌(Chaetomium globosum)WFWML-4,已于2012年9月11日保藏在位于北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)的中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC NO. 6571。
本發(fā)明的球毛殼菌WFWML-4用于制備菌液制劑，所制得的菌液制劑可以用來(lái)分離乙酰膽堿酯酶抑制物。
本發(fā)明菌株的培養(yǎng)基含有如下質(zhì)量體積百分比的組分20%馬鈴薯，2%蔗糖，O.3%KH2P04,0. 15%MgS04 · 7Η20，0· OOl0ZoVB1 ；ρΗ 為 6. O。
本發(fā)明篩選的毛殼菌的次生代謝產(chǎn)物中具有抑制乙酰膽堿酯酶活性的單體化合物或活性部位，可以作為天然藥物或功能性食品加以開發(fā)利用，替代化學(xué)藥物，降低其毒副作用，同時(shí)利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)，可以很大程度的降低生產(chǎn)成本，具有很好的市場(chǎng)應(yīng)用前旦ο具體實(shí)施方式
下面對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的描繪
一、菌株的篩選
用于分離菌株的牡販(Concha Ostreae)采自黃渤海交界(長(zhǎng)島)海域。將牡販去殼后用75%酒精浸泡5min進(jìn)行表面消毒，剪碎后加3mL無(wú)菌水研磨，然后將原液進(jìn)行梯度稀釋，分別涂布于分離培養(yǎng)基上(分離用培養(yǎng)基馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基PDA，加入終濃度為200U/mL的青霉素鉀和150U/ml硫酸鏈霉素)。將所有的平板放置于恒溫培養(yǎng)箱中， 25°C倒置培養(yǎng)。為了驗(yàn)證表面消毒是否徹底，設(shè)計(jì)對(duì)照實(shí)驗(yàn)對(duì)照1，用清水沖洗后但未進(jìn)行表面消毒未切割的完整牡蠣；對(duì)照2，進(jìn)行表面消毒但未切割未研磨的完整牡蠣。然后將所有平板放置在培養(yǎng)箱內(nèi)，25°C避光培養(yǎng)15d，結(jié)果發(fā)現(xiàn)對(duì)照I的材料周圍長(zhǎng)出很多不同的菌落，而對(duì)照2無(wú)菌落生長(zhǎng)，說明表面消毒非常徹底。待培養(yǎng)至實(shí)驗(yàn)組長(zhǎng)出菌絲時(shí)，采用菌絲尖端切割法對(duì)內(nèi)生真菌進(jìn)行分離純化，將純化好的真菌轉(zhuǎn)于斜面，于4°C冰箱保存?zhèn)溆谩?br> 將牡蠣中分離獲得的株真菌接種到馬鈴薯蔗糖液體培養(yǎng)基中(培養(yǎng)基含有如下質(zhì)量體積百分比的組分:20% 馬鈴薯，2% 蔗糖，O. 3%KH2P04,0. 15%MgS04 · 7Η20，0· OOl0ZoVB1 ；ρΗ 為6. O。)，于25°C，120rpm培養(yǎng)10天。四層紗布過濾，分離發(fā)酵液和菌絲體。將發(fā)酵液用乙酸乙酯萃取3次，將3次乙酸乙酯相合并，然后減壓濃縮得到發(fā)酵液粗萃取物。將粗萃取物用DMSO溶解成5mg/L，采用Ellman法測(cè)定所得真菌的發(fā)酵液萃取物的AchE抑制活性，從中篩選出一株高產(chǎn)抑制AchE活性的菌株。
Ellman法是一種快速測(cè)定乙酰膽堿酯酶抑制劑的方法。其原理為乙酰膽堿酯酶水解底物丁酰硫代膽堿(acetylthiocholine)，生成的產(chǎn)物硫代膽堿再與顯色劑二硫二硝基苯甲酸(DTNB) [5，5 ' -dithiobis- (2-nitrobenzoic acid)]反應(yīng)生成在 412nm 處有特征吸收的化合物2-硝基-5-巰基苯甲酸(5-thio-2_nitrobenzoic acid),通過測(cè)定410nm 處的吸光度的增量可以間接測(cè)定乙酰膽堿酯酶的活性。
Ellman法測(cè)定乙酰膽堿酯酶抑制劑的方法將提取物用二甲基亞砜(DMSO)溶解， 配制成濃度為50mg/mL的溶液。取4支IOmL的試管(I 4)分別標(biāo)注為空白、對(duì)照、樣品、本底放于37°C的恒溫水浴中，向這4支試管中分別添加pH=8. O磷酸緩沖液(2950 μ L、 2880 μ L、2880 μ L、2950 μ L)、乙酰膽堿碘代物20 μ L、顯色劑DTNB100 μ L ;然后向1、2號(hào)試管中各加入DMSOlOOy L，3、4號(hào)試管中各加入待測(cè)樣品溶液100yL，2、3號(hào)試管中再各加入70 μ L的乙酰膽堿酯酶后混勻、在水浴中反應(yīng)4min 20s后再向各試管中分別添加40%的 SDS終止劑100 μ L終止反應(yīng)；最后在412nm下測(cè)其OD值，通過計(jì)算公式計(jì)算出樣品對(duì)乙酰膽堿酯酶的抑制率
AchE抑制率(％)= “照—(Aff品—八4遍)X
將球毛殼菌WFWML-4(Chaetomium globosum),已于2012年9月11日保藏在中國(guó)4微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為號(hào)CGMCCN0. 6571。
二、WFWML-4菌株的發(fā)酵及性質(zhì)鑒定
I、WFWML-4菌株的培養(yǎng)
將4°C冰箱保存的WFWML-4菌株轉(zhuǎn)接到PDA (海水配置)平板上活化，25°C培養(yǎng)5 天；然后轉(zhuǎn)接到馬鈴薯蔗糖液體培養(yǎng)基中，25°C，120rpm，培養(yǎng)3天；將種子液按10%的接種量擴(kuò)大培養(yǎng)，250C，120rpm,培養(yǎng)10天。發(fā)酵完畢后，四層紗布過濾，分離發(fā)酵液和菌絲體。將發(fā)酵液用乙酸乙酯萃取3次，將3次乙酸乙酯相合并，然后減壓濃縮得到發(fā)酵液粗萃取物。將粗萃取物用DMSO溶解成5mg/mL，采用Ellman法測(cè)定所得真菌的發(fā)酵液萃取物的 AchE抑制活性，抑制率可達(dá)47. 8%。
2、抑制AChE的活性成分的分離
將該真菌的次生代謝產(chǎn)物的乙酸乙酯相進(jìn)行分離，獲得乙酰膽堿酯酶抑制活性為 30 80%的極性段。具體操作如下
將真菌WFWML-4大量液體發(fā)酵，經(jīng)乙酸乙酯萃取，得乙酸乙酯相10. 2g。所得產(chǎn)物采用 硅膠柱(IOOg硅膠，200-300目)進(jìn)行分離，采用氯仿/甲醇體系(氯仿甲醇= 100 0,100 1,100 2,100 4,100 8，100 16)進(jìn)行梯度洗脫，獲得 6 個(gè)極性段， 分別測(cè)定每個(gè)極性段對(duì)AchE的抑制率，其抑制率達(dá)30% 80%。其中氯仿甲醇段100 4 活性最強(qiáng)，可達(dá)60 80%。
權(quán)利要求
1.一種球毛殼菌，其特征在于，所述的球毛殼菌的保藏編號(hào)為=CGMCC NO. 6571。
2.一種菌液制劑，其特征在于，所述的菌液為權(quán)利要求I所述的球毛殼菌的活菌菌液。
3.如權(quán)利要求2所述的菌液制劑，其特征在于，所述的球毛殼菌的培養(yǎng)基含有如下質(zhì)量體積百分比的組分20%馬鈴薯，2%蔗糖，O. 3% KH2PO4 ,0. 15% MgSO4 ·7Η20，0· OOPzWB1 ； pH 為 6· O。
4.權(quán)利要求2所述的菌液制劑用來(lái)分離乙酰膽堿酯酶抑制物。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種球毛殼菌WFWML-4(Chaetomium globosum)，已于2012年9月11日保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC NO.6571。本發(fā)明篩選的毛殼菌的次生代謝產(chǎn)物中具有抑制乙酰膽堿酯酶活性的單體化合物或活性部位，可以作為天然藥物或功能性食品加以開發(fā)利用，替代化學(xué)藥物，降低其毒副作用，同時(shí)利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)，可以很大程度的降低生產(chǎn)成本，具有很好的市場(chǎng)應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)A61K36/06GK102911879SQ20121041336
公開日2013年2月6日 申請(qǐng)日期2012年10月25日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月25日
發(fā)明者王鳳舞, 樸美子, 侯竹美, 孟麗媛 申請(qǐng)人:青島農(nóng)業(yè)大學(xué)