專利名稱：副溶血性弧菌類毒素疫苗的制備方法與用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種海洋微生物和海產(chǎn)養(yǎng)殖的交叉領(lǐng)域，特別是一種副溶血性弧菌類毒素疫苗的制備方法；本發(fā)明還涉及前述方法制備的副溶血性弧菌類毒素疫苗的用途。
背景技術(shù)：
副溶血弧菌iyibrio parahaemotytifus, Vp)為革蘭氏陰性菌，隸屬于弧菌科弧菌屬，形態(tài)呈球桿狀、桿狀、弧狀、絲狀等多形性，分散排列，常兩端濃染，無芽抱，菌體一端有單鞭毛，運動活潑，為嗜鹽性細菌，是一種人畜共患病菌。主要存在于近海岸的海水、海底沉積物及魚貝類等海產(chǎn)品中，可引起食物中毒和腹瀉。副溶血弧菌侵害的水產(chǎn)動物主要是海水魚類、蝦類、貝類、蟹類等。可導(dǎo)致海鯛、九孔鮑、斑節(jié)蝦、對蝦及文蛤等水產(chǎn)經(jīng)濟動物致病，間接影響人類的健康。病害已成為水產(chǎn)動物健康養(yǎng)殖和可持續(xù)發(fā)展的制約因素。在己查明的水產(chǎn)動物細菌性疾病中，副溶血弧菌是主要致病菌之一，病魚以體表潰瘍?yōu)橹饕卣?，魚體肝、脾腫大，腸道嚴重出血，出現(xiàn)大量血性積水，7-8月份為此病高發(fā)期，給水產(chǎn)動物養(yǎng)殖造成了巨大損失，成為困擾和阻礙沿海海水網(wǎng)箱養(yǎng)殖行業(yè)發(fā)展的因素之一。2002年6月，山東海陽、榮成地區(qū)養(yǎng)殖牙鲆大量死亡。鏡檢發(fā)現(xiàn)體表和內(nèi)臟均有大量運動細菌。經(jīng)分離、純化和分類，又經(jīng)科赫法則鑒定，確定導(dǎo)致該疾病的細菌為致病性副溶血弧菌。因此，有效防治副溶血弧菌病將是水產(chǎn)動物健康養(yǎng)殖的關(guān)鍵一環(huán)。污染了大量該菌而又未經(jīng)良好加工處理的海產(chǎn)品被人類食用后，會引發(fā)突發(fā)性食物中毒，可導(dǎo)致患者出現(xiàn)腹瀉、腸痙攣、惡心、嘔吐、發(fā)燒等典型胃腸炎反應(yīng)。是沿海地區(qū)引起食物中毒的重要病原菌。由其引起的食物中毒在日本居首位，約占日本全國食物中毒例數(shù)的30%，食物中毒總?cè)藬?shù)的20%左右，因此日本學(xué)者對有關(guān)副溶血性弧菌的研究報道較多。據(jù)我國1983 — 1984年沿海部分地區(qū)細菌性食物中毒流行情況資料統(tǒng)計，在412起食物中毒中，副溶血性弧菌居首位，占26%。浙江省1993 — 2002年在調(diào)查確診病原因子或病種的所有食物中毒中，有29%為副溶血性弧菌食物中毒。目前研究認為，與副溶血性弧菌致病力相關(guān)的主要毒力因子為溶血素類， 包括耐熱直接溶血素(^erfflO1Sia似e々irecTDH)、TDH-相關(guān)溶血素 {TDH-reIatecI Hemolysin, TRH)和不耐熱直接溶血素斤si/ , TLH)， 它們分別由 逾、irA Itl基因編碼，tdh陽性菌株可以使氯化鈉血瓊脂平板產(chǎn)生β-溶血現(xiàn)象，而irA陽性菌株一般表現(xiàn)為脲酶陽性，W基因的表型特征還未見報道。副溶血弧菌通過水產(chǎn)品為進入人體引發(fā)人類疾患，反之，人類的不良行為又加劇了自然界中弧菌數(shù)量的增長。眾所周知，早前我國沿海特別是近岸、河口、內(nèi)灣等處水體污染、營養(yǎng)富集化程度較重，這和人類未經(jīng)處理的生活污水、工業(yè)廢水大量傾注入海和高密度養(yǎng)殖區(qū)的失控發(fā)展造成的自污染有很大關(guān)系。再加上養(yǎng)殖生產(chǎn)中抗生素的濫用，造成了自然水域中菌群失衡，當環(huán)境條件適合副溶血弧菌的生長時，就會大量繁殖，加之養(yǎng)殖個體抗逆能力降低時， 就會引發(fā)各種水產(chǎn)動物病害的發(fā)生。
魚用疫苗具有安全、衛(wèi)生、高效的特點，能夠有效克服化學(xué)藥物在魚病防治中的多種局限，在生產(chǎn)中前景廣闊。而在魚用疫苗中，研究的最多且應(yīng)用最廣的是滅活疫苗。相關(guān)研究表明，在由革蘭氏陰性菌制備的滅活疫苗中，能激發(fā)機體產(chǎn)生免疫保護作用的主要抗原成分為位于細胞壁上的脂多糖。Kawai等用從鰻弧菌(Ka/^wiBar )中提取的脂多糖對香魚的口服免疫，Mlati等使用從及菌中提取的脂多糖對日本鰻鱺C^^/iWaj^^flica)肌肉注射免疫的結(jié)果都表明使用一定量的脂多糖，對于魚類非但沒有毒性，反而能使魚類產(chǎn)生顯著的免疫反應(yīng)，從而獲得對該種病原較強的免疫能力。目前，水產(chǎn)動物養(yǎng)殖業(yè)上普遍使用藥物來控制副溶血性弧菌引起的各種病害，在一定程度上發(fā)揮了積極作用，但是抗生素等化學(xué)藥物的長期使用，會使該病原對這些藥物產(chǎn)生抗藥性，而且對環(huán)境會造成嚴重的污染和破壞，另外，藥物殘留還會對食用者構(gòu)成潛在的威脅。隨著對綠色環(huán)保食品和環(huán)境保護的要求及免疫學(xué)技術(shù)的發(fā)展，國內(nèi)外已有通過接種疫苗進行水生生物疾病控制的報道。近年來，國內(nèi)外對副溶血性弧菌毒力因子及免疫疫苗的研究基本都集中于溶血毒素基因克隆及全菌滅活疫苗、細胞胞外產(chǎn)物、脂多糖疫苗方面，而利用毒素基因表達產(chǎn)物作為免疫原，研究其對海洋水產(chǎn)動物的免疫效應(yīng)，特別是在用毒素基因表達產(chǎn)物免疫動物獲取抗體，研究水產(chǎn)養(yǎng)殖動物免疫保護率方面，迄今為止未見報道。由于副溶血性弧菌可以引起人類食物中毒，故目前國內(nèi)外對副溶血性弧菌的研究較為集中于醫(yī)學(xué)方面，對水產(chǎn)經(jīng)濟動物免疫效應(yīng)方向研究極少。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種新的、可操作性強的副溶血性弧菌類毒素疫苗的制備方法，用該方法制得的副溶血性弧菌類毒素疫苗可以用于魚類免疫。本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是通過以下的技術(shù)方案來實現(xiàn)的。本發(fā)明是一種副溶血性弧菌類毒素疫苗的制備方法，其特點是其步驟如下
(1)擴增目的基因tdh
引物 1 :5’ -GCGAATTC ATGAAGTACCGATATTTTGCA-3，， 引物 2 :5，-GCAAGCTTTTATTGTTGATGTTTACATTC-3，，
在引物1、2的5’端分別引入EC0RI、HindIII酶切位點；以副溶血性弧菌基因組DNA為模板，擴增副溶血性弧菌溶血毒素基因；反應(yīng)體系為50 μ ，引物各200 nmol / L，dNTP 各 50 Mmol / L，模板 50 ng，95 °C預(yù)變性 5 min，然后按 94 °C 30 秒、53 °C 40 秒、72 °C 50秒循環(huán)35次，72°C終止延伸10分鐘，產(chǎn)物割膠回收，得到目的基因片段；
(2)克隆表達將目的基因片段tdh克隆至載體pET-28，構(gòu)建表達載體pET-28-TDH， pET-28-TDH質(zhì)粒轉(zhuǎn)入表達菌株BL21 ；接種于LB培養(yǎng)液中，37 °C、180r/min過夜，次日將該菌液以2%比例接種于5ml LB培養(yǎng)基中，37 °C、180r/min培養(yǎng)2小時后，取Iml菌液，0D600 為0.5-0. 7測吸光度，并收集菌體作為誘導(dǎo)表達前的對照菌體，其余菌液中加0. Imol / L 的IPTG至終濃度為lmmol / L，20°C、200r/min誘導(dǎo)10小時后，5000r/min、5min收集菌體；用ΙΟΟμΙ重蒸水懸浮菌體，加等體積2Χ蛋白上樣緩沖液，沸水浴10分鐘，進行10% SDS-PAGE電泳分析；以沒有克隆tdh的pET-觀空質(zhì)粒及未經(jīng)誘導(dǎo)表達的質(zhì)粒作為陰性對照；誘導(dǎo)表達后，離心收集沉淀，超聲波破壁，按非變性條件抽提純化蛋白過程進行純化，聚乙二醇8000濃縮后，測其0擬60、0擬80，計算蛋白含量；得克隆表達產(chǎn)物；(3)斑點印跡反應(yīng)檢測取10μ1克隆表達產(chǎn)物滴加在醋酸纖維膜上，50°C烘干10分鐘，后用5%脫脂牛奶封閉1小時；TBS緩沖液洗3次后，晾干；用封閉液稀釋第一抗體 His-tag，稀釋倍數(shù)為1 :5000，37°C下脫色搖床上緩慢搖動1小時；用TBS洗膜三次，每次5 分鐘；封閉液稀釋第二抗體堿性磷酸酯酶標記的羊抗鼠抗體IgG，稀釋比例為1 :20000，37 ！下脫色搖床上緩慢搖動1小時；TBS洗膜一次；AP底物緩沖液洗膜二次；在10 mL AP底物緩沖液中加入BCIP 33 μ1、ΝΒΤ 66μ1，顯色至斑點清楚，確認克隆表達產(chǎn)物為TDH蛋白； 該TDH蛋白即為副溶血性弧菌毒素；將TDH蛋白經(jīng)0. 3%甲醛脫毒處理，得到副溶血性弧菌類毒素；
(4)疫苗制備將副溶血性弧菌類毒素與等體積的弗氏完全佐劑混合均勻，即得副溶血性弧菌類毒素疫苗。本發(fā)明所述的tdh為公知基因，該基因在Genbank的登錄號為XM341。本發(fā)明以上方法制備的副溶血性弧菌類毒素疫苗可以用于受到副溶血性弧菌攻擊的海洋魚類的免疫藥物的用途。所述的海洋魚類可以為真鯛、墨魚、海魚、海蝦、海蟹或者海蜇等容易受到副溶血性弧菌攻擊的海洋魚類。副溶血性弧菌是一種危害魚類的重要的條件性病原菌，溶血毒素TDH被認為是副溶血性弧菌的主要致病因子之一。本發(fā)明首先針對目的基因設(shè)計特異性擴增引物，接著以副溶血性弧菌為模板，通過聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)調(diào)出目的溶血毒素()基因，通過限制性內(nèi)切酶的酶切，連接到克隆載體后，進一步將目的基因克隆至表達載體，進行大腸桿菌融合表達，經(jīng)變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)證實，表達的TDH融合蛋白在相對分子質(zhì)量約為21 kDa處有表達條帶，與tdh編碼融合蛋白的理論推算值得到相對分子質(zhì)量完全一致。TDH的成功表達，為利用常規(guī)的基因工程技術(shù)表達純化TDH蛋白、研制其多克隆抗體和抗副溶血性弧菌的保護性疫苗等研究提供了理論依據(jù)。用純化后的TDH蛋白作為免疫原，輔以免疫佐劑注射海洋魚類，一段時間后，血清中的各種免疫活性因子都有升高，表明TDH蛋白有效激活了動物體內(nèi)的免疫系統(tǒng)。在病原菌的攻毒試驗中，TDH類毒素抗原的抗血清效價遠遠高于對照組，TDH蛋白免疫后的動物能夠抵抗病原菌的感染，存活率明顯提高。魚類的體液免疫系統(tǒng)由非特異性免疫(主要由體液因子參與)和特異性免疫(主要由抗體分子參與)兩部分組成，在病原感染的早期階段，魚類主要依賴非特異性體液免疫因子作為抵御各種微生物及其有毒有害物質(zhì)等感染與侵蝕的第一道防線。本發(fā)明中，真鯛在注射副溶血性弧菌類毒素后，免疫后5小時、12小時的SOD活性與對照組略有增加，48小時達到最高，72小時下降到與對照同等水平。在正常情況下，SOD清除活性氧自由基，保護動物免受自由基傷害；注射免疫原后，誘導(dǎo)產(chǎn)生大量的自由基，SOD酶活性也在自由基的誘導(dǎo)下隨之升高，以清除過量的自由基。由于免疫原刺激機體，真鯛體內(nèi)引起呼吸爆發(fā)，導(dǎo)致血液中ACP、AKP、CAT酶活性在5-48小時內(nèi)均有不同程度的升高，24小時均達到最高點，分別高于對照組328%、75%、381%，特別是ACP、CAT酶活性在12小時已有顯著增加，實驗結(jié)果認為，副溶血性弧菌的類毒素對真鯛的免疫系統(tǒng)具有較強的刺激作用。本發(fā)明研究類毒素免疫原對副溶血性弧菌病原攻毒的免疫保護作用，實驗結(jié)果表明，其免疫保護率達50%左右。


圖 1 為 PCR 擴增{tdh)結(jié)果圖；其中=UDNA Marke (EcoRI/Hindlll) ；2、PCR 結(jié)果 (570 bp)；
圖 2 為重組質(zhì)粒 PCR 鑒定結(jié)果圖；其中1. DNA Marke (EcoRI/Hindlll) ；2. pET-28 M 粒；3. tdh基因；
圖3為SDS — PAGE鑒定結(jié)果圖；其中1、重組質(zhì)粒(pET-28 -TDH)經(jīng)誘導(dǎo)(IPTG);2、重組質(zhì)粒(pET-28 -TDH)未誘導(dǎo)；3、蛋白Marke ；
圖4為斑點印跡反應(yīng)檢測結(jié)果圖；其中1、經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達；2、未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達； 3、空質(zhì)粒樣品(pET-32a)；
圖5為類毒素免疫后SOD活性的變化圖； 圖6為類毒素免疫后ACP活性的變化圖； 圖7為類毒素免疫后AKP活性的變化圖； 圖8為類毒素免疫后CAT活性的變化圖； 圖9為真鯛抗血清效價檢測圖； 圖10為疫苗對副溶血性弧菌攻毒的保護效率圖。
具體實施例方式以下參照附圖，進一步描述本發(fā)明的具體技術(shù)方案，以便于本領(lǐng)域的技術(shù)人員進一步地理解本發(fā)明，而不構(gòu)成對其權(quán)利的限制。實施例1，一種副溶血性弧菌類毒素疫苗的制備方法，其步驟如下
(1)擴增目的基因tdh
引物 1 :5’ -GCGAATTC ATGAAGTACCGATATTTTGCA-3，， 引物 2 :5，-GCAAGCTTTTATTGTTGATGTTTACATTC-3，，
在引物1、2的5’端分別引入EC0RI、HindIII酶切位點；以副溶血性弧菌基因組DNA為模板，擴增副溶血性弧菌溶血毒素基因；反應(yīng)體系為50 μ ，引物各200 nmol / L，dNTP 各 50 Mmol / L，模板 50 ng，95 °C預(yù)變性 5 min，然后按 94 °C 30 秒、53 °C 40 秒、72 °C 50秒循環(huán)35次，72°C終止延伸10分鐘，產(chǎn)物割膠回收，得到目的基因片段；
(2)克隆表達將目的基因片段tdh克隆至載體pET-28，構(gòu)建表達載體pET-28-TDH， pET-28-TDH質(zhì)粒轉(zhuǎn)入表達菌株BL21 ；接種于LB培養(yǎng)液中，37 °C、180r/min過夜，次日將該菌液以2%比例接種于5ml LB培養(yǎng)基中，37 °C、180r/min培養(yǎng)2小時后，取Iml菌液，0D600 為0.5-0. 7測吸光度，并收集菌體作為誘導(dǎo)表達前的對照菌體，其余菌液中加0. Imol / L 的IPTG至終濃度為lmmol / L，20°C、200r/min誘導(dǎo)10小時后，5000r/min、5min收集菌體；用ΙΟΟμΙ重蒸水懸浮菌體，加等體積2Χ蛋白上樣緩沖液，沸水浴10分鐘，進行10% SDS-PAGE電泳分析；以沒有克隆tdh的pET-觀空質(zhì)粒及未經(jīng)誘導(dǎo)表達的質(zhì)粒作為陰性對照；誘導(dǎo)表達后，離心收集沉淀，超聲波破壁，按非變性條件抽提純化蛋白過程進行純化，聚乙二醇8000濃縮后，測其0擬60、0擬80，計算蛋白含量；得克隆表達產(chǎn)物；
(3)斑點印跡反應(yīng)檢測取10μ1克隆表達產(chǎn)物滴加在醋酸纖維膜上，50°C烘干10分鐘，后用5%脫脂牛奶封閉1小時；TBS緩沖液洗3次后，晾干；用封閉液稀釋第一抗體 His-tag，稀釋倍數(shù)為1 :5000，37°C下脫色搖床上緩慢搖動1小時；用TBS洗膜三次，每次5分鐘；封閉液稀釋第二抗體堿性磷酸酯酶標記的羊抗鼠抗體IgG，稀釋比例為1 :20000，37 ！下脫色搖床上緩慢搖動1小時；TBS洗膜一次；AP底物緩沖液洗膜二次；在10 mL AP底物緩沖液中加入BCIP 33 μ1、ΝΒΤ 66μ1，顯色至斑點清楚，確認克隆表達產(chǎn)物為TDH蛋白； 該TDH蛋白即為副溶血性弧菌毒素；將TDH蛋白經(jīng)0. 3%甲醛脫毒處理，得到副溶血性弧菌
類毒素；
(4)疫苗制備將副溶血性弧菌類毒素與等體積的弗氏完全佐劑混合均勻，即得副溶血性弧菌類毒素疫苗。實施1所述的方法制得的副溶血性弧菌類毒素疫苗用于受到副溶血性弧菌攻擊的海洋魚類的免疫藥物的用途。所述的海洋魚類包括真鯛、墨魚、海魚、海蝦、海蟹或者海蜇等容易受到副溶血性弧菌攻擊的海洋魚類。實施例2，副溶血性弧菌類毒素疫苗的制備方法實驗。1 材料和方法 1.1材料
1.1.1實驗材料
副溶血性弧菌(Kzlrio ParahaemotytifusdDH Q00027)購自江蘇省疾病控制中
心；
pET-28質(zhì)粒、大腸桿菌BL21均為本室保存；健康真鯛(平均250 g)購自連云港市贛榆東方水產(chǎn)養(yǎng)殖有限公司，飼養(yǎng)條件水溫14-16 V ；光照室內(nèi)弱光；鹽度25/1000 ；循環(huán)水養(yǎng)殖，每天傍晚投喂一次人工配合軟顆粒飼料(購自山東華隆生物科技有限公司)，投餌率3% (相對于體重)。1. 1. 2 試齊[J
pMD18-T-Vector、DNAMarker, ProteinMarker、限制性內(nèi)切酶、DNA 連接酶、購自大連寶生物有限公司(TaKaRa) ；DNA膠回收試劑盒、PCR產(chǎn)物回收試劑盒、Taq DNA polymerase購自申能博彩生物科技有限公司；PCR產(chǎn)物測序由上海申能博彩生物科技有限公司完成；超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、酸性磷酸酶(ACP)和堿性磷酸酶(AKP)檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所；實驗用常規(guī)化學(xué)試劑均為分析純，各種緩沖液由本室配置。1.1.3培養(yǎng)基LB培養(yǎng)基 1. 2方法
1.2.1 PCR 擴增
據(jù)Genbank發(fā)表的序列(登錄號ΧΜ341)設(shè)計引物； 引物 1 :5，GAATTC ATGAAGTACCGATATTTTGCA-3，，
弓丨物 2 :5，-GC AAGCTT TTATTGTTGATGTTTACATTC-3，，在引物 1、2 的 5，端分別引入 EcoRI, HindIII酶切位點。以VP基因組DNA為模板，擴增 ，反應(yīng)體系為50 μ ，引物各 200 nmol / L，dNTPs 各 50 Mmol / L，模板 50 ng，95 °C預(yù)變性 5 min，然后按 94 "C 30 S、 53 V 40 S,72 V 50 S循環(huán)；35次，72°C終止延伸10 min，產(chǎn)物割膠回收，得到目的基因。1. 2. 2原核表達載體(pET-28 -TDH)構(gòu)建與鑒定
回收的PCR產(chǎn)物經(jīng)上海申能博彩生物科技有限公司測序。將測序正確目的基因片段 ( )，克隆至載體pET-觀，構(gòu)建表達載體(pET-28 -TDH)，PCR分析鑒定。
1. 2. 3 TDH融合表達及SDS—PAGE電泳分析檢測及純化
鑒定準確的PETjS-TDH質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21中，LB/Amp抗性平板篩選。從轉(zhuǎn)化平板上挑取轉(zhuǎn)化子單克隆菌落搖床培養(yǎng)過夜，次日按1 :100比例轉(zhuǎn)接至200 mL LB/Amp中， 于37 "C 200 r/min搖菌培養(yǎng)，培養(yǎng)至0D600=0. 5_0. 7時，加IPTG至終濃度0. 4 mmol/L， 并改為20 °C誘導(dǎo)10 h。吸取1 mL菌液5000 r/min離心5 min收集菌體，棄上清，50 μ ddH20懸浮沉淀，加30 μ 2XSDS上樣緩沖液，進行SDS-PAGE電泳。大量誘導(dǎo)表達后，離心收集沉淀，超聲波破壁，按非變性條件抽提純化蛋白過程進行純化。聚乙二醇8000濃縮后， 測其0擬60/0擬80，計算蛋白含量。1. 2. 4抗原制備及免疫真鯛實驗
融合蛋白經(jīng)0.3%甲醛脫毒，與等量的弗氏完全佐劑(Sigma)混合，以3 Pg/g腹腔注射真鯛，對照組注射等量無菌生理鹽水。注射后5 h、24 h、48 h、72 h，尾椎取血法分別收集血淋巴于1.5 mL于無菌印pondorf管中，4 "C >24 h析出血清，5000 r/min,4 °C離心10 min，上層血清保存于-20 ！冰箱中。1.2.5血清中免疫活性因子測定
血清中過氧化氫酶(CAT)、酸性磷酸酶(ACP)、超氧化物歧化酶(SOD)和堿性磷酸酶 (AKP)活性測定采用江蘇省南京建成生物研究所生產(chǎn)的試劑盒，測定方法參考說明書進行。1. 2. 6攻毒實驗及免疫保護效率檢測 1.2.6.1免疫接種
每組取20尾真鯛，共3組。其中一組免疫類毒素(3 Pg/g腹腔注射真鯛)；一組注射等量PBS溶液(3 PL/g腹腔注射)；一組注射等量生理鹽水(3 PL/g腹腔注射)。三周后同等劑量加強免疫。1. 2. 6. 2 ELISA測定抗血清效價
取TDH類毒素免疫過的真鯛血清10倍稀釋后，與等量的弗氏完全佐劑(Sigma)混合， 采用皮下多點(頸、背、后肢內(nèi)側(cè))注射免疫法對兩只新西蘭白兔(平均體重1. 2 kg，連云港市第一人民醫(yī)院分子免疫實驗室提供)進行初次免疫(注射量為0.2 mL),7 d后加強免疫一次，劑量同首免，用弗氏不完全佐劑(Sigma)乳化，加強免疫后7 d,由耳靜脈采血 0.3 mL,分離血清，用ELISA法進行兔血清抗體的效價檢測。取TDH類毒素抗原，配成1 10稀釋液，加抗原液100 μ 包被酶標板，置4 °C 過夜、洗滌(PBST)。分別用封閉液(1%脫脂牛奶)、二倍系列稀釋的魚血清、兔抗魚血清(自制)和辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔抗體(Sigma)分步孵育、洗滌；最后加底物溶液(磷酸鹽-檸檬酸鹽緩沖液，pH5. 0 ；OPD 0. 4 mg/ mL ；H2O2 1. 5 μ / mL)，置室溫暗處顯色 20 min ；每孔加終止液O mol/ L H2SO4 50 μ ),然后于酶標儀上測定490 nm處的OD 值。同時設(shè)陰性對照，樣品設(shè)置平行孔，測定結(jié)果取平均值。以樣品孔的OD值(P)與陰性對照孔的OD值(N)之比大于2 (即P/ N > 2)時定為陽性。1.2.6.3病原菌攻毒試驗
加強免疫三周后，以副溶血性弧菌菌懸液(濃度為IO7-IO8,注射量500 μι)腹腔注射免疫魚，并設(shè)對照，每2 d觀察一次死魚情況，持續(xù)20 d。2結(jié)果與分析2.1 PCR擴增目的基因(似力)
按1. 2. 1方法進行PCR擴增，tdh的PCR產(chǎn)物經(jīng)0. 7%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果表明大小與預(yù)期的570 bp相符，參見圖1。2.2原核表達載體(pET-28 -TDH)構(gòu)建與鑒定
測序結(jié)果經(jīng)Dnastar軟件分析，與GenBank (CAA38229)的序列完全一致。目的基因片段( )克隆至載體pET-觀，構(gòu)建表達載體(pET-28 -TDH)，PCR法對重組質(zhì)粒鑒定，電泳檢測，結(jié)果表明所插入片段與預(yù)期的一致，參見圖2。2. 3 SDS — PAGE電泳分析及斑點反應(yīng)檢測
SDS-PAGE電泳顯示經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后的重組質(zhì)粒有表達條帶，表達條帶的相對分子質(zhì)量約為21 kDa，與 編碼融合蛋白的理論推算值一致，結(jié)果見圖3、圖4。2. 4血清中免疫活性因子測定 2. 4. 1 SOD活性測定
用TDH類毒素免疫真鯛后，血清中的SOD自12 h逐漸上升，至48 h達到最高點， 高出對照組7796，后逐漸下降；72 h恢復(fù)至對照組水平；注射生理鹽水組，SOD值至第 12 h略有上升，24 h下降至對照組水平，基本沒有變化。經(jīng)分析顯示第對h、48 h實驗組與對照組相比具顯著性差異(P < 0. 05)，參見圖5。2. 4. 2 ACP 活性測定
圖6顯示，類毒素免疫組ACP活性自12 h開始有升高，在Mh達到最高，與生理鹽水對照組相比高出3 后開始下降，72 h恢復(fù)至對照組水平。第12、24、48 h三組結(jié)果，實驗組與對照組相比具顯著性差異(P < 0. 05)，其它兩組差異性均不顯著。2. 4. 3 AKP 活性測定
類毒素免疫組AKP活力自5 h就有明顯上升趨勢，5、12、M、48 h均高于對照組，至 24 h達到最高，高出對照組7596，后開始下降，72 h恢復(fù)至對照組水平。第5、12、24、48 h 四組結(jié)果，實驗組與對照組相比具顯著性差異(P <0.05)，72 h差異性不顯著，結(jié)果參見圖7。2. 4. 4 CAT 活性測定
TDH類毒素免疫真鯛后CAT活性增強，據(jù)圖7可知，CAT活力在12、24、48 h均高于對照組，至M h達到最高，高出對照組381%，后開始降低，至72 h恢復(fù)至對照組水平。 第12、24、48 h三組結(jié)果，實驗組與對照組相比具顯著性差異(P <0.05)，72 h無差異性，參見圖8。2. 5攻毒實驗及免疫保護效率檢測
圖9顯示ELISA測定抗血清效價結(jié)果，TDH類毒素抗原的抗血清效價達到1 10 240, 稀釋度為10、20、40倍時，吸光度均在1.81以上(SE分別為±0.014,0.015,0. 02. n=3)，稀釋度為5120、10240倍時，吸光度達0.63、0. 58 (SE分別為士0. 01、0. 02. n=3)。經(jīng) 檢驗分析，每個稀釋度的實驗組與對照組相比均具顯著性差異Od < 0. 05)。圖10顯示類毒素疫苗免疫真鯛后對副溶血性弧菌攻毒具有明顯的保護，保護率與對照組相比高達50%左右。
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權(quán)利要求
1.一種副溶血性弧菌類毒素疫苗的制備方法，其特征在于其步驟如下(1)擴增目的基因tdh引物 1 :5’ -GCGAATTC ATGAAGTACCGATATTTTGCA-3，，引物 2 :5，-GCAAGCTTTTATTGTTGATGTTTACATTC-3，，在引物1、2的5’端分別引入EC0RI、HindIII酶切位點；以副溶血性弧菌基因組DNA為模板，擴增副溶血性弧菌溶血毒素基因；反應(yīng)體系為50 μ ，引物各200 nmol / L，dNTP 各 50 Mmol / L，模板 50 ng，95 °C預(yù)變性 5 min，然后按 94 °C 30 秒、53 °C 40 秒、72 °C 50秒循環(huán)35次，72°C終止延伸10分鐘，產(chǎn)物割膠回收，得到目的基因片段；(2)克隆表達將目的基因片段tdh克隆至載體pET-28，構(gòu)建表達載體pET-28-TDH， pET-28-TDH質(zhì)粒轉(zhuǎn)入表達菌株BL21 ；接種于LB培養(yǎng)液中，37 °C、180r/min過夜，次日將該菌液以2%比例接種于5ml LB培養(yǎng)基中，37 °C、180r/min培養(yǎng)2小時后，取Iml菌液，0D600 為0.5-0. 7測吸光度，并收集菌體作為誘導(dǎo)表達前的對照菌體，其余菌液中加0. Imol / L 的IPTG至終濃度為lmmol / L，20°C、200r/min誘導(dǎo)10小時后，5000r/min、5min收集菌體；用ΙΟΟμΙ重蒸水懸浮菌體，加等體積2Χ蛋白上樣緩沖液，沸水浴10分鐘，進行10% SDS-PAGE電泳分析；以沒有克隆tdh的pET-觀空質(zhì)粒及未經(jīng)誘導(dǎo)表達的質(zhì)粒作為陰性對照；誘導(dǎo)表達后，離心收集沉淀，超聲波破壁，按非變性條件抽提純化蛋白過程進行純化，聚乙二醇8000濃縮后，測其0擬60、0擬80，計算蛋白含量；得克隆表達產(chǎn)物；(3)斑點印跡反應(yīng)檢測取10μ1克隆表達產(chǎn)物滴加在醋酸纖維膜上，50°C烘干10分鐘，后用5%脫脂牛奶封閉1小時；TBS緩沖液洗3次后，晾干；用封閉液稀釋第一抗體 His-tag，稀釋倍數(shù)為1 :5000，37°C下脫色搖床上緩慢搖動1小時；用TBS洗膜三次，每次5 分鐘；封閉液稀釋第二抗體堿性磷酸酯酶標記的羊抗鼠抗體IgG，稀釋比例為1 :20000，37 ！下脫色搖床上緩慢搖動1小時；TBS洗膜一次；AP底物緩沖液洗膜二次；在10 mL AP底物緩沖液中加入BCIP 33 μ1、ΝΒΤ 66μ1，顯色至斑點清楚，確認克隆表達產(chǎn)物為TDH蛋白； 該TDH蛋白即為副溶血性弧菌毒素；將TDH蛋白經(jīng)0. 3%甲醛脫毒處理，得到副溶血性弧菌類毒素；(4)疫苗制備將副溶血性弧菌類毒素與等體積的弗氏完全佐劑混合均勻，即得副溶血性弧菌類毒素疫苗。
2.一種用權(quán)利要求1所述的方法制得的副溶血性弧菌類毒素疫苗用于受到副溶血性弧菌攻擊的海洋魚類的免疫藥物的用途。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的用途，其特征在于所述的海洋魚類為真鯛、墨魚、海魚、海蝦、海蟹或者海蜇。
全文摘要
本發(fā)明是一種副溶血性弧菌類毒素疫苗的制備方法，其特征在于先擴增目的基因tdh再將目的基因片段tdh克隆至載體pET-28，構(gòu)建表達載體pET-28-TDH，pET-28-TDH質(zhì)粒轉(zhuǎn)入表達菌株BL21；培養(yǎng)，誘導(dǎo)表達后，得克隆表達產(chǎn)物；對克隆表達產(chǎn)物斑點印跡反應(yīng)檢測，得到副溶血性弧菌類毒素；將副溶血性弧菌類毒素與等體積的弗氏完全佐劑混合均勻，即得副溶血性弧菌類毒素疫苗。本發(fā)明方法制得的副溶血性弧菌類毒素疫苗可用于受到副溶血性弧菌攻擊的海洋魚類的免疫藥物的用途，其免疫保護率可達50%左右。
文檔編號A61K39/106GK102274494SQ20111025678
公開日2011年12月14日 申請日期2011年9月1日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月1日
發(fā)明者成明, 李信書, 李士虎, 王洪斌 申請人:淮海工學(xué)院