專利名稱：神經(jīng)生長(zhǎng)因子制品在制備治療視神經(jīng)病變藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及從生物材料中提取的神經(jīng)生長(zhǎng)因子制品的用途，確切地說(shuō)是從生物材料中提取的神經(jīng)生長(zhǎng)因子制品在制備治療視神經(jīng)病變藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
目前，神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)可以從雄性小鼠、人胎盤腦髓、人胎盤及蛇毒等組織中提取，也可以通過(guò)基因工程的方法制備。在現(xiàn)有的技術(shù)中，神經(jīng)生長(zhǎng)因子是迄今為止發(fā)現(xiàn)的唯一不僅對(duì)中樞及外周神經(jīng)的正常神經(jīng)細(xì)胞有營(yíng)養(yǎng)因子作用，而且具有調(diào)節(jié)損傷神經(jīng)修復(fù)機(jī)能的生物活性分子。它能促進(jìn)中樞及外周神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和分化，維持神經(jīng)系統(tǒng)的正常功能，加快神經(jīng)系統(tǒng)損傷后的修復(fù)。目前研究表明中樞膽堿能神經(jīng)元和某些運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元在損傷(缺氧、神經(jīng)毒、病毒感染、機(jī)械損傷)時(shí)，NGF可以保護(hù)、減輕傷害的程度，并且促進(jìn)相應(yīng)神經(jīng)纖維的再生和功能的恢復(fù)。其作用的機(jī)理主要是NGF進(jìn)入機(jī)體后，與末梢上相應(yīng)NGF受體結(jié)合后進(jìn)入軸突，再逆轉(zhuǎn)行軸漿轉(zhuǎn)運(yùn)至胞體，在某些過(guò)程中引起的一系列的生物效應(yīng)，如誘導(dǎo)突起生長(zhǎng)、損傷神經(jīng)的修復(fù)、促進(jìn)某些蛋白和酶的合成。在臨床上有重大的應(yīng)用價(jià)值，目前的適應(yīng)癥主要包括各種外周神經(jīng)病、脊椎損傷、顱腦損傷、中樞神經(jīng)系統(tǒng)缺氧和缺血造成的損傷及早老性癡呆等。但是大多數(shù)的報(bào)道和相關(guān)的試驗(yàn)數(shù)據(jù)主要是介紹其在外周神經(jīng)病、脊椎損傷、顱腦損傷、中樞神經(jīng)系統(tǒng)缺氧。
公知的神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)具體提取方法如下1、頜下腺細(xì)胞的破碎與離心取60-90天齡昆明種二級(jí)小白鼠，健康雄性，頸椎脫臼法處死，局部用碘酒和75％酒精消毒后，無(wú)菌條件下迅速取下兩側(cè)頜下腺，放入無(wú)菌無(wú)熱原冰浴玻璃器皿中-20℃保存。取頜下腺在預(yù)冷注射用水中勻漿，離心收上清，重復(fù)一次，合并上清，勻漿液4℃～8℃條件貯存?zhèn)溆谩?br> 2、除去等電點(diǎn)大于6.8的雜蛋白上清對(duì)0.25mol/L的pH6.8磷酸緩沖液透析16小時(shí)后上CM-52I柱，用0.02mol/L的pH6.8磷酸緩沖液洗脫，收集波長(zhǎng)280nm吸收值大于0.5的未吸收的蛋白組分。
3、酸化，使沉降系數(shù)為7的神經(jīng)生長(zhǎng)因子(7S NGF)解離為α、β、γ亞基。
CM-52I柱的收集液對(duì)注射用水透析16小時(shí)后，加入的pH4.0的乙酸鹽緩沖液，使pH值迅速降至4.0，再加入0.4mol/L的NaCl，這時(shí)7S NGF打開鏈解離為α、β、γ亞基，靜置后離心，收集上清。
4、過(guò)CM-52II柱，分離出沉降系數(shù)為2.5的神經(jīng)生長(zhǎng)因子(2.5S NGF)CM-52II柱，用含0.4mol/L NaCl的0.05mol/L、pH4.0的乙酸鹽緩沖液平衡，上樣后先用相同的平衡液洗脫；再用不含NaCl的0.05mol/L、pH4.0的乙酸鹽緩沖液洗柱；吸附的蛋白質(zhì)用0.05mol/L、pH9.0Tris-HCl緩沖液洗脫；當(dāng)流出液pH值升至8左右時(shí)，有一個(gè)淺黃色雜蛋白組分被洗脫。再用含0.4mol/L NaCl的0.05mol/L、pH9.0Tris-Hcl緩沖液洗脫下NGF組分。CM-52柱的收集液對(duì)注射用水透析16小時(shí)后，用濾膜過(guò)濾除菌。
5、過(guò)SephadexG75柱，精制2.5S NGF將上述神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)組分冷凍干燥后，溶于1N的醋酸溶液(HAC)，經(jīng)SephadexG75柱分離，平衡液體及洗脫液為1N的HAc，收集神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)活性峰，注射用水4℃透析后用濾膜過(guò)濾除菌，得神經(jīng)生長(zhǎng)因子原液制品。
神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)凍干產(chǎn)品的制備。
1000ml成品分裝液各成分含量如下含有500AU～8000AU/ml神經(jīng)生長(zhǎng)因子原液制品、重量百分比為0.5％～2％的白蛋白和或0.5％～10％的甘露醇以及注射用水；神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)原液制品經(jīng)檢查合格后，按上述處方配制，過(guò)濾除菌，無(wú)菌灌裝于西林瓶中，冷凍干燥、壓塞、軋蓋即得凍干神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)產(chǎn)品。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種神經(jīng)生長(zhǎng)因子制品的新用途，即在臨床上的新應(yīng)用。
具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及從生物材料中提取的神經(jīng)生長(zhǎng)因子制品在制備治療視神經(jīng)病變藥物中的應(yīng)用。
視神經(jīng)一般分為顱內(nèi)段、管內(nèi)段、眶內(nèi)段、眼內(nèi)段四個(gè)部分。
視神經(jīng)病變包括視神經(jīng)炎、視神經(jīng)萎縮、視神經(jīng)挫傷等相關(guān)臨床病癥。
1.視神經(jīng)炎視神經(jīng)眶內(nèi)段的炎癥，通常為單側(cè)性。很多病例由多發(fā)性硬化引起，少數(shù)病例的病因與視乳頭炎的病因相同，但特發(fā)性病例在球后視神經(jīng)炎中較之視乳頭炎者更為常見(jiàn)。主要癥狀為視力迅速減退(與視乳頭炎相同)和眼球轉(zhuǎn)動(dòng)時(shí)疼痛。眼底通常正常，不過(guò)偶見(jiàn)輕度視乳頭充血者?？稍?～8周內(nèi)自然緩解，視力恢復(fù)正常。有些病例可殘留中心暗點(diǎn)和視乳頭顳側(cè)蒼白。大多數(shù)病例可改善，但不可能恢復(fù)到正常。本病可復(fù)發(fā)，多發(fā)性硬化引起者尤然。每次復(fù)發(fā)使視力損害和顳側(cè)蒼白加重，并可導(dǎo)致視神經(jīng)萎縮和永久性的視力全部喪失。
2.視神經(jīng)萎縮視神經(jīng)萎縮是指視神經(jīng)纖維發(fā)生退行性變性和傳導(dǎo)功能障礙。所有造成視神經(jīng)損害的疾病均可導(dǎo)致視神經(jīng)萎縮。
此病病因較復(fù)雜，臨床上根據(jù)其發(fā)病情況將其分為下述二大類(1)原發(fā)性視神經(jīng)萎縮 某些顱內(nèi)占位性病變或視神經(jīng)損傷者為原發(fā)性或單純性視神經(jīng)萎縮。
(2)繼發(fā)性視神經(jīng)萎縮 其中包括炎性、變性或遺傳性三類。主要包括視乳頭炎或視網(wǎng)膜炎后的上行性萎縮。球后病變的下行性萎縮，視網(wǎng)膜色素變性，缺氧性視乳頭水腫，視網(wǎng)膜中央動(dòng)脈阻塞等變性萎縮，以及遺傳性視神經(jīng)萎縮。
3.視神經(jīng)挫傷產(chǎn)生視神經(jīng)挫傷有兩種主要的因素。其一為眼球受挫傷時(shí)在外力的作用下極度扭轉(zhuǎn)，導(dǎo)致視神經(jīng)(尤其是球后段)的撕裂傷。其二是在外傷時(shí)，眼眶內(nèi)容物的擠壓而損傷視神經(jīng)，也可能眶后壁骨折而挫傷骨內(nèi)段視神經(jīng)。
視神經(jīng)病變傳統(tǒng)的治療要點(diǎn)在常規(guī)的治療上早期應(yīng)用可試用皮質(zhì)類固醇以減輕視神經(jīng)水腫，血管擴(kuò)張劑、能量合劑、維生素B族、及高血氧治療；如有視神經(jīng)萎縮，可靜滴腦活素。必要時(shí)作眶內(nèi)或視神經(jīng)開放減壓術(shù)。對(duì)于本病變的治療目前主要以糖皮質(zhì)激素、維生素及其他的相關(guān)的輔助治療措施進(jìn)行治療，療效不能肯定，而且會(huì)造成全身性的不可逆轉(zhuǎn)的毒副作用。
發(fā)明人在研究中發(fā)現(xiàn)神經(jīng)生長(zhǎng)因子對(duì)視神經(jīng)挫傷等視神經(jīng)病變有明顯的治療效果，隨即進(jìn)行了深入的研究，即進(jìn)行該藥物的臨床前和臨床的研究試驗(yàn)。
發(fā)明人在臨床前和臨床試驗(yàn)中做了大量的數(shù)據(jù)和試驗(yàn)，結(jié)果表明對(duì)大鼠的視神經(jīng)挫傷等視神經(jīng)病變及人視神經(jīng)挫傷等視神經(jīng)病變病例的治療取得了很好的療效。
在第一個(gè)實(shí)施例中，給40只Wistar成年大鼠腹腔注射二硫化碳、復(fù)制了視神經(jīng)損害的模型，分高(NGF1000AU/KG)、中(200AU/KG)、低(20AU/KG)劑量組及對(duì)照組，每組10只，雌雄各半。給藥組球后注射神經(jīng)生長(zhǎng)因子，每天1次，每周6次，共3周；空白對(duì)照組球后注射等量生理鹽水。于治療前、后測(cè)定了大鼠模式翻轉(zhuǎn)和閃光視覺(jué)誘發(fā)電位。試驗(yàn)結(jié)果表明，高、中劑量組大鼠在治療10天和20天時(shí)各波潛伏比對(duì)照組有明顯或非常明顯的縮短，而低劑量組(除P1外)未見(jiàn)明顯差異。由此證實(shí)，神經(jīng)生長(zhǎng)因子注射液對(duì)大鼠視神經(jīng)損害有明顯的治療作用。
在第二個(gè)實(shí)施例中，用注射用神經(jīng)生長(zhǎng)因子對(duì)93名視神經(jīng)挫傷等視神經(jīng)病變的病例治療的臨床試驗(yàn)中表明神經(jīng)生長(zhǎng)因子對(duì)視神經(jīng)挫傷等視神經(jīng)病變的療效是確切的。
從以上結(jié)果，可以得出本發(fā)明的有益效果在于A、本發(fā)明對(duì)神經(jīng)生長(zhǎng)因子制品發(fā)掘了新的臨床用途，開拓了一個(gè)新應(yīng)用領(lǐng)域。
B、本發(fā)明的神經(jīng)生長(zhǎng)因子制品，安全無(wú)毒，藥效明顯，是一種治療視神經(jīng)病變的特效藥物，預(yù)示著很好的市場(chǎng)前景。
C、本發(fā)明的神經(jīng)生長(zhǎng)因子原料來(lái)源豐富、制備工藝成熟，可制成水針劑和凍干粉針劑等，實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化。
具體實(shí)施例方式
為了更好地理解本發(fā)明的實(shí)質(zhì)，下面通過(guò)實(shí)施例即用鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子制品的藥理試驗(yàn)及結(jié)果來(lái)說(shuō)明其在制藥領(lǐng)域中的新用途。
實(shí)施例1用二硫化碳給成年大鼠腹腔注射造成了大鼠視神經(jīng)損害的模型，觀察了鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子對(duì)大鼠的視神經(jīng)挫傷等視神經(jīng)病變恢復(fù)的治療作用。
試驗(yàn)藥品神經(jīng)生長(zhǎng)因子制品由安徽金大陸生物制藥有限公司生產(chǎn)，1000AU/ml(凍干粉針劑)，批號(hào)950105。2-8℃保存，臨用前用生理鹽水稀釋。
按前述提取方法提取神經(jīng)生長(zhǎng)因子，按下述處方制備凍干粉針劑。
制備方法如下處方2.4×106AU神經(jīng)生長(zhǎng)因子、10g白蛋白、50g甘露醇以及注射用水1000ml制備神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)原液經(jīng)檢查合格后，按上述處方配制，過(guò)濾除菌，無(wú)菌灌裝于西林瓶中，每支0.5ml，冷凍干燥、壓塞、軋蓋。即得凍干神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)1000AU/支的制品。
試驗(yàn)動(dòng)物Wistar健康成年大鼠120只，體重240-340g，雌雄各半，購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院試驗(yàn)動(dòng)物繁育場(chǎng)，動(dòng)物生產(chǎn)合格證京動(dòng)字01-3008。
儀器英國(guó)Medlec公司生產(chǎn)的MS92a型肌電圖儀、ST10型感覺(jué)誘發(fā)電位儀。
試劑丙烯酰胺 廣州化學(xué)試劑廠生產(chǎn)二硫化碳 北京52952化工廠生產(chǎn)戊巴比妥鈉 購(gòu)自醫(yī)藥公司分組說(shuō)明因?yàn)槟壳皣?guó)內(nèi)、外尚無(wú)療效確切或公認(rèn)的治療視神經(jīng)損害的已知藥物，故本研究中未設(shè)陽(yáng)性對(duì)照組。
試驗(yàn)方法1、分組 取Wistar大鼠40只，雌雄各半，體重240-340g，隨機(jī)分為高、中、低劑量給藥組和空白對(duì)照組，共4組，每組10只。
2、給藥量 臨用前用生理鹽水將神經(jīng)生長(zhǎng)因子稀釋至實(shí)驗(yàn)所需濃度的注射液。高劑量組，給大鼠球后注射NGF1000AU/KG；中劑量組球后注射NGF200AU/KG；空白對(duì)照組球后注射等量的生理鹽水。
3、視覺(jué)誘發(fā)電位的測(cè)定方法3.1先將40只大鼠在戊巴比妥鈉(30mg/kg，2％溶液)麻醉后，暴露顱骨，按下屬部位埋入自制的不銹鋼螺紋電極(1mm)；引導(dǎo)電極位于前鹵后6mm，矢狀壯縫右側(cè)旁3.5mm處；參考電極位于前鹵2mm，矢狀壯縫左側(cè)旁開2mm處；地電極位于前鹵2mm，矢狀壯縫左側(cè)旁開2mm處。埋入電極后，用自凝牙托粉固定在顱骨上。
3.2給大鼠手術(shù)后兩周描記下述兩種視覺(jué)誘發(fā)電位(FEP和PREP)。然后按300mg/kg劑量腹腔注射二硫化碳油溶液三周，至出現(xiàn)視覺(jué)誘發(fā)電位潛伏時(shí)限明顯延長(zhǎng)。
3.3將視神經(jīng)受損大鼠隨機(jī)分為4組，給高、中、低三個(gè)劑量組大鼠分別按上述劑量球后注射NGF；而空白對(duì)照組，球后注射等量生理鹽水，每天1次，每周6次，共治療3周。于治療10天和20天分別記錄視覺(jué)誘發(fā)電位，判斷治療效果。
閃光視覺(jué)誘發(fā)電位(FEP)測(cè)定方法將清醒已埋好電極的大鼠進(jìn)行固定，置于視覺(jué)信號(hào)發(fā)生器熒光屏前20cm處，給以閃光頻率1次/S，刺激時(shí)程10ms，分析時(shí)間500ms，平均疊加100次，濾波2-100Hz。
模式翻轉(zhuǎn)誘發(fā)電位(PREP)測(cè)定方法其視覺(jué)刺激信號(hào)為寬9cm的垂直條柵、黑百轉(zhuǎn)換2次/S，其他條件同F(xiàn)EP。
FEP和PREP潛伏時(shí)系指一刺激信起始至出現(xiàn)N1、P1、N2或P2峰所需的時(shí)間(ms)，來(lái)表示各波的潛伏時(shí)。對(duì)所測(cè)結(jié)果用F檢驗(yàn)和t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，觀察神經(jīng)生長(zhǎng)因子對(duì)受損神經(jīng)的治療作用。
4、試驗(yàn)的結(jié)果治療前、后大鼠體重和一般狀況無(wú)明顯變化。從球后注射神經(jīng)生長(zhǎng)因子的大鼠模式翻轉(zhuǎn)視覺(jué)誘發(fā)電位測(cè)定結(jié)果(表1)中表明，高劑量組治療10天時(shí)P1波潛伏時(shí)比對(duì)照組明顯縮短(P＜0.05)，N2波潛伏時(shí)比比對(duì)照組明顯縮短(P＜0.01)，而治療20天時(shí)N1、P1和N2波潛伏時(shí)則有非常明顯的縮短(P＜0.01)；中劑量組大鼠治療10天和20天時(shí)P1和N2潛伏時(shí)的變化與高劑量組的基本相同；低劑量組大鼠各波潛伏時(shí)與對(duì)照組無(wú)顯著差別。
從NGF注射液對(duì)受損視神經(jīng)大鼠閃光誘發(fā)電位(FEP)的影響結(jié)果(表2)看來(lái)，高劑量組大鼠在治療10天時(shí)N1、P2波潛伏時(shí)與對(duì)照組比較，有明顯縮短(P＜0.05)，而N2波的潛伏時(shí)則有明顯縮短(P＜0.01)，治療20天時(shí)N2、P2和N2波的變化與治療10天相似，但P1波潛伏時(shí)比對(duì)照組出現(xiàn)顯著的縮短(P＜0.05)；中劑量組在治療10天時(shí)僅有P2和N2波潛伏時(shí)明顯縮短(P＜0.05)，于治療20天時(shí)P2和N2波潛伏時(shí)有明顯縮短(P＜0.05)，而N2波為非常明顯縮短(P＜0.01)；然而低劑量組大鼠僅在治療20天時(shí)P1波潛伏時(shí)比對(duì)照組有明顯縮短(P＜0.05)。
5、結(jié)論二硫化碳可致視神經(jīng)損害，二硫化碳染毒大鼠的視神經(jīng)屬腫大，充滿結(jié)構(gòu)破壞的微絲；微絲和肌動(dòng)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)加速等病理變化。視覺(jué)誘發(fā)單位可以反映視神經(jīng)傳導(dǎo)徑路完整性和受損狀況，因而采用PREP和FEP兩種視覺(jué)誘發(fā)電位各波潛伏時(shí)反應(yīng)視神經(jīng)的功能變化。從神經(jīng)生長(zhǎng)因子注射液的治療中，可以看見(jiàn)高、中劑量組兩種視覺(jué)誘發(fā)電位各波潛伏時(shí)有顯著好轉(zhuǎn)，顯示受損視神經(jīng)功能的恢復(fù)、在治療20天時(shí)低劑量組大鼠個(gè)別波潛伏時(shí)也有顯著縮短。
球后注射NGF10天和20天時(shí)，經(jīng)視覺(jué)誘發(fā)電位測(cè)定表明，高、中劑量組可明顯改善視神經(jīng)功能，低劑量組呈現(xiàn)某些治療作用，并具有一定劑量-反應(yīng)關(guān)系。由此表明NGF對(duì)視神經(jīng)損害有較好治療作用。神經(jīng)生長(zhǎng)因子作為治療視神經(jīng)挫傷等視神經(jīng)病變藥物的新用途。
表1 NGF注射液對(duì)視神經(jīng)受損大鼠模式翻轉(zhuǎn)誘發(fā)電位(PREP)的影響

注與對(duì)照組比較*P＜0.05，**P＜0.01表2 NGF注射液對(duì)視神經(jīng)受損大鼠模式閃光誘發(fā)電(FEP)的影響


注與對(duì)照組比較*P＜0.05，**P＜0.01實(shí)施例2神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)的II期臨床試驗(yàn)的對(duì)視神經(jīng)損傷患者的治療效果分析，用以證明神經(jīng)生長(zhǎng)因子作為治療視神經(jīng)挫傷等視神經(jīng)病變藥物的新用途。
試驗(yàn)藥品鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子由安徽金大陸制藥有限公司生產(chǎn)，含量1000AU/支(凍干粉針劑)。4℃保存，臨用前用生理鹽水稀釋。
鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子的制備方法按具體實(shí)施例1的方法制備試驗(yàn)用藥品。
一、各中心計(jì)劃病例數(shù)與完成病例數(shù)

其中用以進(jìn)入統(tǒng)計(jì)分析的有效病例為93例。
二、各有關(guān)療效指標(biāo)評(píng)分綜合療效的判斷

總有效率比較

從上述統(tǒng)計(jì)分析的結(jié)果可以看出在組間的比較上差異很大，特別是高劑量組的有效率占的比率很高，而低劑量組的療效也非常的確切，而對(duì)照組的有效率就很低。其中在總有效率中高劑量組的有效率三周為62.96％，而到六周是達(dá)到64.29％；低劑量組有效率三周為44.12％，六周時(shí)已上升到61.76％；因此證明神經(jīng)生長(zhǎng)因子具有作為治療視神經(jīng)挫傷等視神經(jīng)病變藥物的新用途。
1、分三組比較高劑量組為2000AU/支、低劑量組為1000AU/支、對(duì)照組為空白安慰劑。目前無(wú)陽(yáng)性對(duì)照，故不設(shè)陽(yáng)性對(duì)照組。
總分

療效等級(jí)

權(quán)利要求
1.神經(jīng)生長(zhǎng)因子制品在制備治療視神經(jīng)病變藥物中的應(yīng)用，其特征在于神經(jīng)生長(zhǎng)因子制品在制備治療視神經(jīng)病變藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及神經(jīng)生長(zhǎng)因子制品的新用途，具體地說(shuō)是神經(jīng)生長(zhǎng)因子制品在制備治療視神經(jīng)病變藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明對(duì)神經(jīng)生長(zhǎng)因子制品發(fā)掘了新的臨床用途，開拓了一個(gè)新應(yīng)用領(lǐng)域。本發(fā)明制品，安全無(wú)毒，藥效明顯，是一種治療視神經(jīng)病變的特效藥物，其原料來(lái)源豐富、制備工藝成熟，可制成水針劑和凍干粉針劑等，實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化。
文檔編號(hào)A61P25/00GK1824297SQ20051009734
公開日2006年8月30日 申請(qǐng)日期2005年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月30日
發(fā)明者陳薇, 陳萬(wàn)象, 黃小楓, 徐曉紅 申請(qǐng)人:安徽金大陸生物制藥有限公司