專利名稱：一種雙價dna疫苗及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種雙價DNA疫苗及其制備方法，涉及動物醫(yī)藥生物工程研究領域。
背景技術：
草魚呼腸孤病毒(grass carp reovirus, GCRV)作為水生呼腸孤病毒屬中致病力最強的毒株，是中國分離鑒定的第一株魚類病毒。該病毒可感染處于魚種、育苗期的草魚、青魚、麥穗魚、布氏鰲條魚等，引起出血病，并可導致所感染的魚死亡。在我國淡水養(yǎng)殖業(yè)中曾有因感染GCRV而導致草魚大批死亡的實例。因此草魚出血病是嚴重困擾草魚等淡水養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的一種重要疾病。人們雖為防治該病進行了多方面的研究，獲得了滅活病毒疫苗制劑，但這種制劑的制備成本昂貴，難以推廣。當前的養(yǎng)殖戶仍然使用傳統的化學農藥來預防和治療草魚出血病，農藥的殘留與污染問題嚴重。隨著分子生物學、分子免疫學和基因工程技術的發(fā)展，基因工程疫苗越來越受到 人們的關注。特別是DNA疫苗已成為近年發(fā)展起來的一個新的研究領域。該疫苗既有減毒疫苗的優(yōu)點，同時又無逆轉的危險，克服了傳統疫苗的缺陷，被看作是繼傳統疫苗及基因工程亞單位疫苗之后的第三代疫苗，在細菌、病毒、寄生蟲等疾病以及腫瘤和過敏反應的防治中顯示出巨大的潛力，具有廣闊的發(fā)展前景。

發(fā)明內容
本發(fā)明所要解決的技術問題是提供一種雙價DNA疫苗及其制備方法，本發(fā)明方法更方便、免疫效果安全。本發(fā)明解決上述技術問題的技術方案如下一種雙價DNA疫苗，所述雙價DNA疫苗是一個質粒DNA構建物，該構建物包括兩種編碼草魚呼腸孤病毒抗原蛋白的質粒DNA序列與一個質粒載體。在上述技術方案的基礎上，本發(fā)明還可以做如下改進。進一步，所述兩種編碼草魚呼腸孤病毒抗原蛋白的DNA序列包括下述序列中的任意兩種具有SEQ. IDNA序列的草魚呼腸孤病毒vp6基因的全序列、全序列基礎上的任意改變序列或其片段；具有SEQ. 2DNA序列的草魚呼腸孤病毒vp7基因的全序列、全序列基礎上的任意改變序列或其片段；具有SEQ. 3DNA序列的草魚呼腸孤病毒vp5基因的全序列、全序列基礎上的任意改變序列或其片段。進一步，所述質粒載體為在質粒pIRES、pcDNA3系統、pTracer_CMV2、pShuttle-CMV、pVAXl、pGEM系統中任一個或幾個質粒的基礎上利用限制性核酸內切酶剪切或通過PCR擴增后再酶切獲得的相應片段拼接而得。進一步，所述限制性核酸內切酶為Hind III、NheI、XhoI、EcoRI、XbaI、NotI、NdeI、MluI、SalI、BamHI、Seal、KpnI、smal、BglII、EcoRV>PvuI、NcoI、PmeI 中的任意一種或幾種。本發(fā)明還提供了一種雙價DNA疫苗的制備方法，技術方案如下I)從NCBI (國立生物技術信息中心)中選取2個草魚呼腸孤病毒的基因序列，搜索其中的開放閱讀框，在AUG上游加入利于高效表達的kozak序列(GCCACC )，根據草魚基因表達所用的偏愛性密碼子情況，對上述2個基因序列中與偏愛性密碼子同義的氨基酸用偏愛性密碼子替換，并合成替換后的基因序列，將合成的2個基因序列經相應的限制性內切酶酶切后分別插入到相應的質粒中，構建成2個重組DNA分子；2)對I)所構建的2個重組DNA分子分別用相應的限制性內切酶酶切，獲得所需要的DNA片段；3)將2)得到的2個DNA片段進行拼接，即得雙價DNA疫苗。在上述技術方案的基礎上，本發(fā)明還可以做如下改進。進一步，I)中所述草魚呼腸孤病毒的基因序列包括下述序列中的任意兩種具有SEQ. I DNA序列的草魚呼腸孤病毒vp6基因的全序列、全序列基礎上的任意改變序列或其片段；具有SEQ. 2 DNA序列的草魚呼腸孤病毒vp7基因的全序列、全序列基礎上的任意改變 序列或其片段；具有SEQ. 3 DNA序列的草魚呼腸孤病毒vp5基因的全序列、全序列基礎上的任意改變序列或其片段。進一步，1)中所述質粒為在質粒pIRES、pcDNA3系統、pTracer_CMV2、pShuttle-CMV、pVAXl、pGEM系統中任一個或幾個質粒的基礎上利用限制性核酸內切酶剪切或通過PCR擴增后再酶切獲得的相應片段拼接而得。本發(fā)明還提供了一種雙價DNA疫苗在制備抗草魚呼腸孤病毒的藥物中的應用。在上述技術方案的基礎上，本發(fā)明還可以做如下改進。進一步，所述草魚呼腸孤病毒可感染處于魚種期的草魚、青魚、麥穗魚、布氏鰲條魚。開放閱讀框是基因序列的一部分，包含一段可以編碼蛋白的堿基序列，不能被終止子打斷。偏愛密碼子指由于密碼子的簡并性，每個氨基酸至少對應I種密碼子，最多有6種對應的密碼子。不同物種、不同生物體的基因密碼子使用存在著很大的差異。各種生物體似乎更偏愛使用某些同義三聯密碼子，不同的物種利用同義密碼中的各密碼的幾率不同，有些同義密碼在該物種中應用的幾率高，有些應用的幾率低。例子在整個酵母基因組中，所有精氨酸的48%由密碼子AGA確定，而其余五種編碼精氨酸的同義密碼子(CGT，CGC, CGA,CGG，AGG)則以較低的大致相等的頻率被使用(每種10%左右)。類似地，果蠅以完全不同的密碼子使用偏性編碼精氨酸，即比起其它五種選擇(每一種的出現頻率約為13%)來說，果蠅更傾向于使用密碼子CGC (33%)。魚種魚苗經過短時間的培養(yǎng)，體長達到3 13cm的幼魚稱為魚種。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明利用分子生物學和基因工程技術，構建成可在魚體細胞(如草魚腎細胞)中同時表達兩種抗原蛋白的雙價質粒DNA疫苗。該質粒DNA疫苗可在宿主細胞中表達兩種不同的抗原蛋白，這些抗原蛋白能夠誘導出抗草魚呼腸孤病毒感染性疾病的保護性免疫反應，刺激機體產生抵抗同一病原的兩種不同抗體，其免疫效果不僅優(yōu)于只產生一種抗體的疫苗，而且比聯合疫苗免疫更方便、安全。該質粒DNA疫苗可根據實際情況制備成相應的制劑，并采用適宜方式注入魚體，如與脂質體、殼聚糖或PEG等混合成復合物，采用注射、電擊、基因槍方式將該復合物導入魚體，能夠防止魚體感染草魚呼腸孤病毒。
具體實施例方式以下對本發(fā)明的原理和特征進行描述，所舉實例只用于解釋本發(fā)明，并非用于限定本發(fā)明的范圍。本發(fā)明所使用的真核表達載體pcDNA3. I+、pIRES均購自invitrgen公司，宿主大腸桿菌DH5a由本實驗室保存。
實施例II.參照NCBI中AF403394. I和AF403396. I序列，優(yōu)化草魚呼腸孤病毒衣殼蛋白基因序列并添加酶切位點，委托生工生物工程(上海)有限公司合成vp6和vp7，序列見SEQ. I和 SEQ. 2。2.利用PCR技術擴增vp6和vp7,使vp6和vp7攜帶有利于在真核細胞中表達的kozak序列和相應的酶切位點。所用引物序列如下V6F TTGCTAGCGCCACCATGGCACAGCGTCAGTTTTTCGGACV6R CTACGCGTTTAGACGAACATCGCCTGCGCTAATGV7S TTTCCCGGGCCACCATGCCTCTCCACATGATTCV7H GGTCTGAGTTAGTGATGGTGGTGATGGTGATCGGATGG3.用EcoR I/Sma I對pIRES質粒進行酶切，獲得IRES片段。4.將2中所獲得的vp6片段用限制性內切酶Nhe I和Mlu I進行酶切，將所獲得的vp6酶切片段插入到用同樣酶切后的pcDNA3. 1+中，獲得pcDNV6質粒；同時，將2中所獲得的vp7序列用限制性內切酶Sma I和Xba I進行酶切，獲得vp7的酶切片段。5.對4所構建的重組質粒pcDNV6用EcoR I和Xba I進行酶切，將所獲得的酶切質粒與3中所獲得的IRES片段及4中所獲得的vp7酶切片段連接，獲得pcDV6-IR-V7質粒。7.將 pcDV6_IR_V7 質粒與 Lipofectamine2000 (Invitrogen)充分混合后加入到長有CIK細胞的培養(yǎng)皿中，孵育，同時進行相應的對照實驗。8.分別于48h、72h、96h及120h收集所培養(yǎng)的細胞，經細胞破碎后，檢測表達VP6和VP7的有效性，從而證實pcDV6-IR-V7能在魚體細胞中表達。9.將所獲得的pcDV6-IR-V7質粒與適量的輔助劑(佐劑)混合，以10 50 (所含DNA的量為0. I lug/yl)對魚背鰭或腹部肌肉注射，在魚體內表達出抗原蛋白，產生保護性免疫反應。實施例2I.參照NCBI中AF403394. I和AF239175. I序列，優(yōu)化草魚呼腸孤病毒衣殼蛋白基因序列并添加酶切位點，委托生工生物工程(上海)有限公司合成vp6和vp5，序列見SEQ. I和 SEQ. 3。2.利用PCR技術擴增vp6和vp5,使vp6和vp5攜帶有利于在真核細胞中表達的kozak序列和相應的酶切位點。所用引物序列如下V6F TTGCTAGCGCCACCATGGCACAGCGTCAGTTTTTCGGACV6R CTACGCGTTTAGACGAACATCGCCTGCGCTAATG
V5F TTCCCGGGCCACCATGTGGAACGTTCAAACV5R GGTCTGAGTTACTTGCCGGGCCACAAGTTCCCTATC3.用EcoR I/Sma I對pIRES質粒進行酶切，獲得IRES片段。4.將2中所獲得的vp6片段用限制性內切酶Nhe I和Mlu I進行酶切，將所獲得的vp6酶切片段插入到用同樣酶切后的pcDNA3. 1+中，獲得pcDNV6質粒；同時，將2中所獲得的vp5序列用限制性內切酶Sma I和Xba I進行酶切，獲得vp5的酶切片段。5.對4所構建的重組質粒pcDNV6用EcoR I和Xba I進行酶切，將所獲得的酶切質粒與3中所獲得的IRES片段及4中所獲得的vp5酶切片段連接，獲得pcDV6-IR-V5質粒。7.將 pcDV6_IR_V5 質粒與 Lipofectamine 2000 (Invitrogen)充分混合后加入到長有CIK細胞的培養(yǎng)皿中，孵育，同時進行相應的對照實驗。8.分別于48h、72h、96h及120h收集所培養(yǎng)的細胞，經細胞破碎后，檢測表達VP6和VP5的有效性，從而證實pcDV6-IR-V5能在魚體細胞中表達。9.將所獲得的pcDV6-IR-V5質粒與適量的輔助劑(佐劑)混合，以10 50 U I (所含DNA的量為0. I lug/u I)對魚背鰭或腹部肌肉注射，在魚體內表達出抗原蛋白，產生保護性免疫反應。以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發(fā)明的保護范圍之內。 序列表SEQ. l(1261bp)ttgctagcgc caccatggcg cagcgccagt tcttcggcct cacctacaac ttctacggcc 60agcccgcccc gctcttcgac ctcaacgacc tgcaggagct cgccggctgc tacgcgcgcc 120cgtggaccag ccggttcagc cacctcgcca tctccactgg ttctcttcca gtctggtcag 180cccgataccc cagtgttgca tcacgcaaca tcgttgtcaa tactttgctt ggtgcccatc 240tcaatccgtt tgccggtggc caaatcacta gccatcaagg tatcacttgg cgcgacccgg 300tcctctcctc gctcgcgccg gtcccggcca tccagccgcc cccggtctgg gcggtcgccg 360agaacgtgct cctcgactcg aacaactacc ccacgtacgt cctcaacctc tcgagcatgt 420ggcccatcaa ccaggacgtg cacatcatga ccatgtgggc gctctcggat cagggcccga 480tctaccacct ggaggtgccg gtggacccga tgcccgccgc gaccacggcc gcgctgatgg 540cgtacaccgg cgtgccgatc gcgcacctcg cgcagaccgc ctaccgcttc gccggccagc 660tcggctccct gaccggccgc ctcaaccgct ctcgcacttg caacggattc tacttcgaat 720ttgcgaagcc agcgctcaat ccagatcaag ccgtgcttaa gtggaacgat ggtgccagag 780ctgccccccc tgccgccgcc caatcatctt acattcgatg catttcccct cattggcagc 840accaaatcgt agaagtggca ggcgccttga tgtcccagtc ggtcaccgcc gtaacgggcc 900tccccgccct catagatgag gccaccctcc ccgcttggag tcaaggcgtt gctaacttga 960ccggtaatgg ccaaggcgtg gtgccctgcc tcgactacaa ccccgtgccg atggccgcgg 1020cccggcacct gcagtggcgc caggacggcc tcatcaccgc cgcccaggag gcgcagctca 1080acaacgacta caccgcgtac gcgctcacca tcgagcggca cctgaccgcc atgctcgtcg 1140ccaaccccat cgccgccggc cggatgccga tccagccctt caacgccgcg gacttcggcc 1200aggccggcca gacggcggcc gcggtcgccc tcgcgcaggc gatgttcgtc taaacgcgta 1260
g1261SEQ. 2(871bp)tttcccgggc caccatgcct ctccacatga ttccgcaggt cgcccacgct atggtccgtg60cagccgctgc aggacgcctt accctgtaca caagaactag aactgagacc accaactttg 120
atcacgctga gtacgtcacc tgcggtcgct acaccatctg cgccttctgc cttacgactc180tggctcccca cgccaacgtc aagaccattc aggactccca cgcttgctcc cgtcaaccaa 240acgaagccat tcgctcactc gtcgaagtga gtgacaaagc gcagaccgcc ctcgtcggta 300gccgtactgt cgactatcac gaattggatg tgaaggctgg gttcgtcgcc ccaactgccg 360atgaaacaat cgccccctct aaggatatcg tcgaacttcc gtttcgcacc tgtgacttgg 420acgattcctc tgctaccgc ttgcgtccgaa accactgcca ggccggtcac gacggcgtta 480tccacctccc gatcctttct ggagatttca agttgcctaa cgagcatccc accaagccgc540tggacgatac gcatccccac gacaaggtgc tgactcgctg ccccaagact ggtctcctcc600tcgtccatga cactcacgcc cacgccaccg ccgtcgttgc caccgctgct acgagagcta 660tcctcatgca cgacctcctg acatccgcga acgcggacga cggccatcag gcacgttccg 720cttgctacgg tccagcgttc aacaacctga ccttcgcttg ccactccacc tgtgcttcag 780acatggctca cttcgactgc ggccagatcg ttggactcga cttgcatgtg gagccatccg 840atcaccatca ccaccatcac taactcagac c871SEQ. 3(1969bp)tttcccgggc caccatgtgg aacgttcaaa cctccgtcaa cacttacaat attactgggg 60atggtaattc atttaccccc acctctgaca tgacatccac cgccgccccg gccattgacc120tcaaacctgg ggttctcaat cctaccggta agctatggcg acccgtcggt acctctgttg 180ctaccatcga ctcacttgcc atcgttagcg atcgttttgg tcagtattca tttgtcaatg 240aaggcatgcg agagaccttt tcaaaagcgc tcttcgacat caacatgtgg caacctttat300tccaagcgac aaagactggc tgcggaccga ttgtactctc ctccttcaca accaccacct360ccggttatgt tggcgccact gccggtgatg cccttgacaa ccctgtaacg aatggcgttt420tcatcagtac tgtgcaaatc atgaaccttc agcggaccat cgctgcccgc atgcgtgacg 480tcgctctctg gcagaaacac ttagacaccg ccatgaccat gctaacacct gacatttctg 540ccggtagcgc ctcctgcaac tggaagagct tgctcgcttt tgcgaaggat atcctccccc600tcgacaacct gtgcctcacc tacccaaatg agttctacaa cgttgccatc caccgttatc660ccgcactcaa gcctggtaac ccagacacca agcttcccga tgcccaggct catccgctgg 720gagaagtagc cggtgcgttc aatgccgcca cctctgaagt tgggagtctc gttggttcca 780gctccaccct ctcacaggcc atctccacca tggctggcaa agacctcgat ctaattgaag 840ccgacactcc gctccccgtg agcgtattta ctccatctct cgcccctcgt tcttatcgac900ccgccttcat taaacctgag gatgctaagt ggatcgcgga attcaataac tcatccctca 960tacgtaagac tcttacctac tcgggtgcaa cttacaccgt tcaactcggc cctggtccaa 1020ctcgcgtcat tgatatgaat gcgatgatcg actccgtgtt gaccctggat gtgagcggta 1080ccatcctccc atatgacaca agccctgatc tgtctacttc agtcccggct ttcgtcctca 1140tccagacctc agtaccaatt caacaagtca ctaccgctgc taacatcaca gccatcaccg 1200tcgtatccgc cgctggcgct tccgccatca atctcgctat caatgtacgc ggccagcccc1260
gcttcaacat gctccacctg caagccacct ttgagcgcga gacaatcacc gggatcccgt1320atatctatgg cttgggcaca ttcctcatcc catcacccac atcctcctcc aatttctcca1380accccacgct gatggacggc cttctcactg tcacccccgt actgctacgt gagacgacat1440acaagggcga agtcgttgac gctatcgtac cagctaccgt catggccaac caaacgtctg1500aggaggtcgc ctctgcctta gccaacgacg cgatcgtgtt agtgtcgaat catctcaaca1560agttggccaa tgtcgtagga gacgcgattc ccgtcgcctc aaaaacggat gattccgcga1620ctagcgccat cgtcagtcga ctcgccgtcc agcacaagct gtcacaggta ggccaagcct1680
cacccactcc ccccgattat ccacttctgt ggcgccgtgc caagcgtgcc gcgtctatgt1740tcgtctccaa cccctccctg gccttgcagg taggtatccc tgtgttaact caatcgggta1800tgctttccgc cctaacgtct ggcgtaggca cggctttacg tactggtagc ttgggcaaag1860gtgtaaccga tgcgtcagaa aaactacgtg cacgtcagag tttgacggtt gcgaagcaag1920cgttcttcga ccagataggg aacttgtggc ccggcaagta actcagacc1969
權利要求
1.一種雙價DNA疫苗，其特征在于，所述雙價DNA疫苗是一種質粒DNA構建物，該構建物包括兩種編碼草魚呼腸孤病毒抗原蛋白的質粒DNA序列和一個質粒載體。
2.根據權利要求I所述的雙價DNA疫苗，其特征在于，所述兩種編碼草魚呼腸孤病毒抗原蛋白的DNA序列包括下述序列中的任意兩種具有SEQ. IDNA序列的草魚呼腸孤病毒vp6基因的全序列、全序列基礎上的任意改變序列或其片段；具有SEQ. 2DNA序列的草魚呼腸孤病毒vp7基因的全序列、全序列基礎上的任意改變序列或其片段；具有SEQ. 3DNA序列的草魚呼腸孤病毒vp5基因的全序列、全序列基礎上的任意改變序列或其片段。
3.根據權利要求I所述的雙價DNA疫苗，其特征在于，所述質粒載體為在質粒pIRES、pcDNA3系統、pTracer-CMV2、pShuttle_CMV、pVAXl、pGEM系統中任一個或幾個質粒的基礎上利用限制性核酸內切酶剪切或通過PCR擴增后再酶切獲得的相應片段拼接而得。
4.根據權利要求3所述的雙價DNA疫苗，其特征在于，所述限制性核酸內切酶為Hind III、NheI、XhoI、EcoRI、XbaI、NotI、NdeI、MluI、SalI、BamHI、Seal、KpnI、smaI、Bgl II、EcoRV> PvuI、NcoI、PmeI中的任意一種或幾種。
5.一種雙價DNA疫苗的制備方法，其特征在于，步驟如下 1)從NCBI中選取2個草魚呼腸孤病毒的基因序列，搜索其中的開放閱讀框，在AUG上游加入利于高效表達的kozak序列(GCCACC)，根據草魚基因表達所用的偏愛性密碼子情況，對上述2個基因序列中與偏愛性密碼子同義的氨基酸用偏愛性密碼子替換，并合成替換后的基因序列，將合成的2個基因序列經相應的限制性內切酶酶切后分別插入到相應的質粒中，構建成2個重組DNA分子； 2)對I)所構建的2個重組DNA分子分別用相應的限制性內切酶酶切，獲得所需要的DNA片段； 3)將2)得到的2個DNA片段進行拼接，即得雙價DNA疫苗。
6.一種雙價DNA疫苗在制備抗草魚呼腸孤病毒的藥物中的應用。
7.根據權利要求6所述的雙價DNA疫苗的應用，其特征在于，所述草魚呼腸孤病毒可感染處于魚種期的草魚、青魚、麥穗魚、布氏鰲條魚。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種雙價DNA疫苗及其制備方法，本發(fā)明雙價DNA疫苗是一種質粒DNA構建物，該構建物包括兩種編碼草魚呼腸孤病毒抗原蛋白的質粒DNA序列和一個質粒載體。本發(fā)明雙價DNA疫苗可在宿主細胞中表達兩種不同的抗原蛋白，這些抗原蛋白能夠誘導出抗草魚呼腸孤病毒感染性疾病的保護性免疫反應，刺激機體產生抵抗同一病原的兩種不同抗體，其免疫效果不僅優(yōu)于只產生一種抗體的疫苗，而且比聯合疫苗免疫更方便、安全。
文檔編號A61P31/14GK102755652SQ20121022996
公開日2012年10月31日 申請日期2012年7月4日 優(yōu)先權日2012年7月4日
發(fā)明者張莉, 王曉潔, 肖波, 遲曉艷 申請人:魯東大學