專利名稱：一種抗人巨細胞病毒藥物及其在制藥中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抗病毒藥物，特別是抗人巨細胞病毒藥物。
人巨細胞病毒(Human Cytomegalovirus，HCMV)在人群中感染十分普遍，對于免疫功能受損如器官移植和愛滋病患者，可引起肺炎、肝炎、胃腸炎及視網(wǎng)膜病等，?？晌＜安∪说纳黐Jacobson MA,Mills J.Seriouscytomegalovirus disease in the acquired immunodificiency syndrome(AIDS).Clinical findings,diagnosis,and treatment.Ann Intern Med,1988,108(4):58594]。而妊娠婦女孕早期原發(fā)HCMV感染可造成流產(chǎn)、早產(chǎn)、死胎、畸形、IUGR、智力低下及聽力損害等[Stagno S,et al.Primarycytomegalovirus infection in pregnancy:incidence,transmission to fetus,and clinical outcome.JAMA,1986,256:1904]。目前，臨床上試用于抗HCMV的藥物眾多，但療效均不理想[李紅，董永綏.人巨細胞病毒感染防治進展。國外醫(yī)學(xué)兒科學(xué)分冊，1995,22(5):231～234]。最新研制的新藥——更昔洛韋(Ganciclovir,GCV；丙氧鳥苷，DHPG)被認為是最有前途的抗HCMV化療劑，在國外已廣泛應(yīng)用于器官移植和愛滋病患者HCMV感染的臨床預(yù)防和治療。但其副作用大，價格昂貴，且已有耐藥性毒株出現(xiàn)，使其臨床應(yīng)用受到限制[MarkhamA & Faulds D.Ganciclovir-An update of its therapeutic use incytomegalovirus infection.Drugs,1994,48(3):455],HCMV感染也是導(dǎo)致器官移植失敗和愛滋病患者死亡的重要原因之一，因此抗HCMV藥物的研究已受到國際上的廣泛重視。80年代初期曾先后試用阿糖腺苷(Ara-A)、阿昔洛韋(Acyclovir.ACV)、白細胞干擾素(IFA)等防治HCMV感染，其治療效果均不理想，且毒副作用較大[Adair JC,Gold M,Bond RE.Acyclovirneurotoxicity:clinical experience and review of the literature.South MedJ,1994,87(12):1227].更昔洛韋(GCV)是最新研制的一種高效、選擇性強的廣譜抗皰疹病毒化療劑，于1982年首次合成，它由ACV衍生而來，是脫氧鳥苷的結(jié)構(gòu)類似物，其作用比ACV強50～100倍，且更易吸收，對HCMV的抑制作用是至今發(fā)現(xiàn)的抗病毒藥中活性最強的藥物之一[Stratta RJ,Shaefer MS,CushingKA,et al.Successful prophylaxis of cytomegalovirus disease after primaryCMV exposure in liver transplant recipients.Transplantation,1991.51(1):90]。臨床試驗表明其治療AIDS及器官移植者繼發(fā)HCMV感染，總有效率達70％[Markham A&Faulds D.Ganciclovir-An update of itstherapeutic use in cytomegalovirus infection.Drugs,1994,48(3):455]。但目前文獻報道臨床病例數(shù)有限，其結(jié)論亦并非一致。而且GCV價格昂貴，可引起骨髓抑制、肝功異常、腎功能不全等多系統(tǒng)嚴(yán)重并發(fā)癥使某些病例被迫中止治療；還可抑制精子產(chǎn)生和導(dǎo)致婦女永久性不孕，因此該藥禁用于孕婦及哺乳期婦女[崔志平節(jié)譯?？共《舅帯袈屙f。國外醫(yī)藥——合成藥、生化藥、制劑分冊，1990,11(6):370]，其臨床研究有待深入。婦女懷孕期間，由于免疫抑制，亦是HCMV的高發(fā)人群，活動性感染率可達11.23％，其垂直傳播可對胎、嬰兒生長發(fā)育造成嚴(yán)重影響，但國內(nèi)外尚無治療育齡婦女和孕婦HCMV感染的有效藥物。因此，如何對HCMV感染尤其是孕期感染進行有效的治了，是當(dāng)前醫(yī)學(xué)界面臨的難題。
本發(fā)明的目的是提供一種用于治療HCMV感染，特別是孕期HCMV感染的中藥，使其具有能有效抑制HCMV引起的細胞病變和有效藥治療圍產(chǎn)期HCMV活動性感染，并能防止孕期HCMV感染的垂直傳播，保護胎兒免受感染，且無任何毒副反應(yīng)，藥源豐富，經(jīng)濟方便，安全范圍大，病人易于接受，減少低質(zhì)兒的出生等優(yōu)點。
本發(fā)明提供的用于治療HCMV感染，特別是孕期HCMV感染的中藥，是以金銀花、大青葉、蒲公英、魚腥草為原料，按1∶1∶1∶1的重量配比制成的藥劑，它可以是任何一種藥劑學(xué)上所說的劑型，其顆粒劑按以下方法制成(1)取處方中的魚腥草，加水10～15倍浸泡2小時，蒸餾5小時，收集揮發(fā)油0.5ml/kg以上，溶解于5～10倍乙醇中，密封，避光保存?zhèn)溆谩?br> (2)取處方中的金銀花、大青葉、蒲公英加15倍量水浸泡45分鐘后，煎煮1.5小時，取汁，藥渣再加12倍量水煎煮1.5小時，取汁，合并煎液，靜置，過濾；濾液減壓濃縮至相對密度為1.10(60～65℃)，緩緩加入約2倍量乙醇，邊加邊攪拌，使含醇量為65％(ml/ml)，靜置沉淀；取上清液，沉淀用少量65％乙醇洗滌，過濾，洗液與濾液合并，減壓回收乙醇至無醇味、相對密度為1.05(60～65C)；加水1倍量充分?jǐn)嚢?，混勻，靜置沉淀完全，過濾，濾液用20％氫氧化鈉溶液調(diào)查pH值為5.0～5.5，減壓濃縮至相對密度為1.35～1.38(80～90℃)的清膏。取清膏1份，加入75～85％的乙醇，使含醇量約為15～20％，充分混勻，加糊精2.5份，天冬糖0.02份，制軟材，制顆粒，60～70℃干燥，整粒，置遠紅外烘烤箱中于60～70℃干燥4小時。
(3)將魚腥草揮發(fā)油乙醇液均勻噴入顆粒中，密閉24小時。
(4)檢驗，合格后分裝于鉛塑復(fù)合膜袋中，每袋10g。
體外實驗資料根據(jù)衛(wèi)生部藥政局93年7月頒布的《新藥臨床前研究指導(dǎo)原則匯編(藥學(xué)、藥理學(xué)、毒理學(xué))》關(guān)于抗病毒試驗要求設(shè)計，采用病變抑制法進行。
(一)病毒和細胞HCMV AD169標(biāo)準(zhǔn)毒株，人胚肺成纖維細胞(HEL)。
(二)藥物本發(fā)明顆粒制劑為受試藥物，每支20ml，每毫升含生藥量1g；更昔洛韋(GCV)為陽性對照藥(購自湖北省醫(yī)學(xué)工業(yè)研究所)，粉針劑，250mg/支。(三)實驗方法1．將兩種藥物倍比稀釋，測定其在不同濃度下的抗HCMV作用。
2．設(shè)定藥物濃度(本發(fā)明顆粒4mg/ml,GCV 25ug/ml)，測定在一定藥物濃度下、不同時間的抗HCMV作用。
3．本發(fā)明藥物對HCMV晚期mRNA的抑制作用HEL感染HCMV AD169后，于加藥的不同時間提取培養(yǎng)物的總RNA，采用定量RT-PCR法測定HCMV晚期mRNA。RT-PCR試劑盒購自美國Promega公司，操作按試劑盒說明進行，其結(jié)果在激光密度掃描儀上掃描分析，以樣本的擴增條帶與陽性對照條帶的掃描峰面積比表示HCMV晚期mRNA的表達水平。
(四)結(jié)果見表1、2、3表1 本發(fā)明藥物和GCV在不同濃度下抗HCMV的結(jié)果比較本發(fā)明藥物組(mg/ml)GCV組(ug/ml) 對照組20 10 5 2.5 1.25100 50 25 12.56.25 3.125 病毒 藥物-± + ++ +++ - - ± ±～+ ++++ +++ -(注細胞病變的記錄——“-”細胞無病變，“+”25％細胞病變，“++”50％細胞病變，“+++”75％細胞病變，“++++”100％細胞病變。)表1可見本發(fā)明藥物最大無毒濃度(TD0)=20mg/ml，最小有效濃度(MTC)=5mg/ml；治療指數(shù)(TI)=4；半數(shù)有效濃度(IC50)=5mg/ml。陽性對照藥GCV的TD0=100ug/ml,MTC=12.5ug/ml,TI=8,IC50=12.5ug/ml。在TD0和MTC之間，隨著藥物濃度下降，本發(fā)明藥物與GCV抑制HCMV的作用減弱；兩者IC50與病毒對照相比，病變程度有顯著差異。表2 本發(fā)明藥物和GCV在不同感染時間抗HCMV的結(jié)果比較24 48 72 96 120144168(小時)病毒對照 -+++++++++++++本發(fā)明藥物 --++ + + ++GCV --++ + + ++表2可見，病毒對照組在感染48小時就已出現(xiàn)細胞病變(CPE)，并隨感染時間的延長不斷加重，感染168小時全部發(fā)生病變；而加藥的兩組感染后72小時才出現(xiàn)CPE，并且進展緩慢，感染168小時后CPE僅為“++”，明顯輕于病毒對照組。表3本發(fā)明藥物和GCV干預(yù)不同時間HCMV感染細胞晚期mRM的表達水平12 24 48 72 96 120(小時)病毒對照0.440.560.580.640.840.87本發(fā)明藥物 0.350.270.340.410.540.65GCV0.390.300.290.380.440.58表3可見，本發(fā)明藥物及GCV對HCMV晚期mRNA的抑制作用在感染12小時就已出現(xiàn)，在24～48小時達到高峰，此后隨感染時間的延長，晚期mRNA的水平又趨上升，但仍明顯低于病毒對照組，且兩者的抑制作用基本相似。
臨床應(yīng)用資料
㈠、對象前來進行優(yōu)生咨詢的有異常孕產(chǎn)史的未孕婦女，及有發(fā)熱、皮疹等病毒感染全身癥狀的孕婦。
㈡、本發(fā)明藥物治療指征確診HCMV活動性感染者(外周血ELISA法檢測HCMV-IgM陽性，RT-PCR檢測HCMV晚期mRNA亦為陽性)，并已排除遺傳、內(nèi)分泌、生殖道發(fā)育異常及環(huán)境因素所致既往異常妊娠，患者自愿進行治療。
㈢、用藥方法本發(fā)明藥物顆粒沖劑，口服，每日三次，連服2周為一個療程，停藥3～7天后復(fù)查。
㈣、分組自愿接受治療者列為觀察組，未接受治療者列為對照組。將兩組結(jié)果進行統(tǒng)計分析，㈤、本發(fā)明藥物顆粒療效觀察指標(biāo)檢測外周血HCMV-IgM、晚期mRNA轉(zhuǎn)陰為治愈。孕婦則同時監(jiān)測整個孕期胎兒宮內(nèi)發(fā)育及出生時、出生后情況，PCR技術(shù)檢測胎兒附屬物(絨毛、羊水、臍血、胎盤)及新生兒外周血和一周內(nèi)尿HCMV DNA，以確定有無宮內(nèi)感染。
㈥、結(jié)果1．本發(fā)明藥物治療1～2個療程，觀察組外周血HCMV-IgM、晚期mRNA轉(zhuǎn)陰率明顯高于對照組，差異有顯著性(P＜0.005)。見表4。表4 本發(fā)明藥物治療1～2個療程病例轉(zhuǎn)陰率育齡婦女①孕 婦②合 計③總例數(shù) 轉(zhuǎn)陰 ％總例數(shù) 轉(zhuǎn)陰 ％總例數(shù) 轉(zhuǎn)陰 ％觀察組41 3278.054132 78.058264 78.05對照組8 0 0.00 123 25.00203 15.00①X2=14.72 P＜0.005 ②X2=9.40 P＜0.005 ③X2=28.36 P＜0.0052.防治宮內(nèi)感染的效果 宮內(nèi)傳播率觀察組17.95％(7/39)、對照組65.52％(19/29)，差異具有極其顯著性(X2=15.94 P＜0.005)。觀察組感染兒異常妊娠結(jié)局42.86％(3/7)、對照組78.95％(15/19)。觀察組11例治療轉(zhuǎn)陰后再次受孕，孕期無再次感染，其中7例足月分娩，無宮內(nèi)傳播，胎兒生長發(fā)育無異常。
體外抑毒實驗表明該藥能有效抑制HCMV引起的細胞病變，其作用與GCV接近；臨床療效觀察表明該藥治療圍產(chǎn)期HCMV活動性感染有效率達78.05％，并能防止孕期HCMV感染的垂直傳播，保護胎兒免受感染；用藥期間未見任何毒副反應(yīng)。而且充分利用我國豐富的中草藥資源，經(jīng)濟方便，安全范圍大，毒副作用極小，病人易接受，具有廣闊的應(yīng)用前景。本發(fā)明藥物是治療孕前及孕期活動性HCMV感染的一種很有價值，很有前途，安全有效的藥物。該藥的應(yīng)用對減少低質(zhì)兒的出生，促進優(yōu)生工作具有重要意義。
實施例1(1)取處方中的魚腥草，加水10～15倍浸泡2小時，蒸餾5小時，收集揮發(fā)油0.5ml/kg以上，溶解于5～10倍乙醇中，密封，避光保存?zhèn)溆谩?br> (2)取處方中的金銀花、大青葉、蒲公英加15倍量水浸泡45分鐘后，煎煮1.5小時，取汁，藥渣再加12倍量水煎煮1.5小時，取汁，合并煎液，靜置，過濾；濾液減壓濃縮至相對密度為1.10(60～65℃)，緩緩加入約2倍量乙醇，邊加邊攪拌，使含醇量為65％(ml/ml)，靜置沉淀；取上清液，沉淀用少量65％乙醇洗滌，過濾，洗液與濾液合并，減壓回收乙醇至無醇味、相對密度為1.05(60～65℃)；加水1倍量充分?jǐn)嚢?，混勻，靜置沉淀完全，過濾，濾液用20％氫氧化鈉溶液調(diào)查pH值為5.0～5.5，減壓濃縮至相對密度為1.35～1.38(80～90℃)的清膏。取清膏1份，加入75～85％的乙醇，使含醇量約為15～20％，充分混勻，加糊精2.5份，天冬糖0.02份，制軟材，制顆粒，60～70℃干燥，整粒，置遠紅外烘烤箱中于60～70℃干燥4小時。
(3)將魚腥草揮發(fā)油乙醇液均勻噴入顆粒中，密閉24小時。
(4)檢驗，合格后分裝于鉛塑復(fù)合膜袋中，每袋10g。
實施例2以金銀花、大青葉、蒲公英、魚腥草為原料，按1∶1∶1∶1的重量配比按經(jīng)典方法即常規(guī)方法制成口服液。
事實例3以金銀花、太青葉、蒲公英、魚腥草為原料，按1∶1∶1∶1的重量配比按經(jīng)典方法即常規(guī)方法制成丸劑。
權(quán)利要求
1．一種抗人巨細胞病毒藥物，它是以金銀花、大青葉、蒲公英、魚腥草為原料，按1∶1∶1∶1的重量配比制成的藥劑。
2．根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗人巨細胞病毒藥物，其特征在于所說的藥劑是任何一種藥劑學(xué)上所說的劑型。
3．根據(jù)權(quán)利要求2所述的抗人巨細胞病毒藥物，其特征在于所說的藥劑是顆粒劑。
4．根據(jù)權(quán)利要求3所述抗人巨細胞病毒藥物的制備方法，其特征在于(1)取處方中的魚腥草，加水10～15倍浸泡2小時，蒸餾5小時，收集揮發(fā)油0.5ml/kg以上，溶解于5～10倍乙醇中，密封，避光保存?zhèn)溆茫?2)取處方中的金銀花、大青葉、蒲公英加15倍量水浸泡45分鐘后，煎煮1.5小時，取汁，藥渣再加12倍量水煎煮1.5小時，取汁，合并煎液，靜置，過濾；濾液減壓濃縮至相對密度為1.10(60～65℃)，緩緩加入約2倍量乙醇，邊加邊攪拌，使含醇量為65％(ml/ml)，靜置沉淀；取上清液，沉淀用少量65％乙醇洗滌，過濾，洗液與濾液合并，減壓回收乙醇至無醇味、相對密度為1.05(60～65℃)；加水1倍量充分?jǐn)嚢瑁靹?，靜置沉淀完全，過濾，濾液用20％氫氧化鈉溶液調(diào)查pH值為5.0～5.5，減壓濃縮至相對密度為1.35～1.38(80～90℃)的清膏。取清膏1份，加入75～85％的乙醇，使含醇量約為15～20％，充分混勻，加糊精2.5份，天冬糖0.02份，制軟材，制顆粒，60～70℃干燥，整粒，置遠紅外烘烤箱中于60～70℃干燥4小時；(3)將魚腥草揮發(fā)油乙醇液均勻噴入顆粒中，密閉，裝袋。
5．根據(jù)權(quán)利要求1、2、3、4所述抗人巨細胞病毒藥物，其特征在于在制備抗人巨細胞病毒藥物中的應(yīng)用。
6．根據(jù)權(quán)利要求1、2、3、4所述的抗人巨細胞病毒藥物，其特征在于在制備用于治療孕期人巨細胞病毒感染藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
一種抗人巨細胞病毒藥物,其特征在于它是以金銀花、大青葉、蒲公英、魚腥草為原料,按1:1:1:1的重量配比制成的藥劑,體外抑毒實驗表明該藥能有效抑制人巨細胞病毒引起的細胞病變,其作用與更昔洛韋(GCV)接近;臨床療效觀察表明該藥治療圍產(chǎn)期人巨細胞病毒活動性感染有效率達78.05%,并能防止孕期HCMV感染的垂直傳播,保護胎兒免受感染。
文檔編號A61P31/12GK1302637SQ0011430
公開日2001年7月11日 申請日期2000年1月1日 優(yōu)先權(quán)日2000年1月1日
發(fā)明者聞良珍, 邢瑋, 陳素華, 曾萬江, 鄧東銳, 凌霞珍, 李鳴真, 葉望云, 陸付耳 申請人:同濟醫(yī)科大學(xué)附屬同濟醫(yī)院