專利名稱：一種可直接皮膚外用的聚乙二醇化超氧化物歧化酶(mPEG-SOD)納米乳及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術領域，涉及一種可直接皮膚外用的聚乙二醇化超氧化物歧化 酶(mPEG-SOD)納米乳及其制備方法。
背景技術：
(一)SOD 的概述自從1968年美國學者McCord和Fridovich等人首先發(fā)現(xiàn)并成功地從牛紅細胞中 提取超氧化歧化酶(Superoxide Dismutase，簡稱SOD)以來，SOD的研究和應用受到世界 上不同專業(yè)、不同學科研究人員的普遍關注。人們自不同的領域、不同的學度、不同的范圍， 以不同的方法和手段，對SOD的化學本質、生物學特性、分子結構、藥理、藥化及臨床、醫(yī)藥、 化工等進行研究和探討，并成功地建立起一整套快速而有效的SOD分離及分析方法。特別 是在1969年McMord等人在美國生化雜志上發(fā)表了關于[超氧陰離子自由基與超氧化物 歧化酶的生物學意義]以來，人們對自由基與生物學，自由基與醫(yī)學的關系，認識有了明顯 提高，研究也有了突破性進展，并使1956年Harman教授提出的衰老自由基學說得以驗證、 補充和發(fā)展。正如Michelson教授于1976年6月由歐洲分子生物學學會組織召開的法國 Banyuls (班里諾斯)首屆超氧化物和超氧化物歧化酶的專題討論會文集前言中寫到的 1969年McMord和Fridovich首先從牛紅細胞中發(fā)現(xiàn)了 SOD活力并發(fā)表了關于超氧自由基 的生物學意義的文章，自此以后接踵而來的有關氧代謝的分子生物學方面一系列的和創(chuàng)造 性的研究工作，幾乎可與1953年Watson和Crick發(fā)表有名的DNA雙螺旋結構學說后所引 起的結果相比擬。這段精辟的評論，概括和肯定了 SOD發(fā)現(xiàn)對推動科學研究發(fā)展所起的重 要作用和價值。(二)SOD來源、分布和種類及其基本特點SOD是一類金屬酶，它廣泛存在于自然界一切需氧和耐氧的生物體各組織細胞內。 由于Cu. Zn-SOD, Mn-SOD, Fe-SOD這三種SOD同功酶都能特異地清創(chuàng)造生物氧化過程中產 生的·02，實際上對產生SOD的細胞具有對活性氧的防護和保護作用，因此，美國學者Keele 設想，凡需氧代謝細胞，包括最簡單的微生物都可能含有S0D，果然，Yost等人1973年成功 地從Ε. Coli. B中分離得到了 Mn-SOD，而在這之前的1971年的McCord曾對自然界二十多種 對氧需求量不同的需氧微生物中的SOD含量進行分析測定，發(fā)現(xiàn)SOD的存在與細胞的需氧 代謝密切相關。通常在空氣中能存活的厭氧微生物中的SOD含量稍低于需氧微生物的S0D， 這可能經與不同生物所含的需氧量及產生活性氧能力不同有關。到目前為止，專業(yè)研究人 員已經從細菌、真菌、原生動物、藻類、昆蟲、魚類、蔬菜、豆類、野生植物、農作物(麥、麥桿) 和動物各臟器和組織細胞中分離得到了 S0D，并對這些得到的SOD進行進一步的分離純化 和分析研究后證實，這些SOD主要分為三種類型Cu. Zn-SOD, Mn-SOD和Fe_S0D。1. Cu. Zn-SOD 呈淡藍綠色，主要存在于真核細胞的細胞漿中，一般地講，動物、植 物、藻類、微生物及某些原核生物體內都存在Cu. Zn-SOD。具體地講，這些酶的主要來源有人(肺、腦、精子、紅血球)、馬(肝、紅血球)、牛(心、肝、精子、紅血球)、羊(肝、紅血球)、 豬(田、肝、腎、紅血球)、狗(紅血球)、雞(肝、紅血球)、鴨(紅血球)、鵝(紅血球)、箭魚 肝、菠菜葉、小白菜葉、四季豆、青豆、綠豆、麥桿、麥、麥葉、刺梨、刺玫果、香菇菌、面包酵母、 啤酒酵母、粗糊脈孢菌等。從這些不同來源物中提取純化的Cu. Ζη-SOD,除個別性質差異較 大外，其他都有類似的性質，不過這些不同來源的Cu. Zn-SOD，其酶蛋白部分隨種屬來源不 同，在氨基酸的排列序順或組成上尚有一些差異，而且正是這種差異，又導致了其酶生物及 理化性質上的不同一性。Cu. Zn-SOD的基本特點，表現(xiàn)在它的分子量及亞基分子量、分子結構、氨基酸組成、 電泳性質、光譜特性及電子順磁共振波譜等上。該酶分子量，除了從肺中提純的酶分子量 135000，并具有4個亞基外，其它來源Cu. Zn-SOD的分子量均在32000左右，各由兩個相等 亞基組成的二聚體，且每個亞基上都含有原子Cu和一個原子Zn。通過聚丙烯醯胺凝膠電泳 后，蛋白染色及SOD活性染色清楚地顯示出三條酶的活性區(qū)帶，等電聚焦后亦呈現(xiàn)三條酶 活性區(qū)帶，這三種組分的等電點分別為5. 2,5. 8,6. 2，該酶在可見光區(qū)670nm(660-680nm) 處有最大光吸收，SOD在可見光區(qū)的吸收光譜特性集中，反映了該酶輔基中二個銅離子的光 學特性；在紫外光區(qū)該酶265nm(250 270nm)處有最大光吸收，而且在280 320nm處有一 定的光吸收，其紫外光區(qū)的吸收光譜特性決定于該酶結構蛋白中某種氨基酸的含量。不僅 如此，該酶還有一個重要特性，即順磁性，研究和分析證明，Cu. Zn-SOD分子中二價銅有順磁 性，正是由于這個原因，氧化態(tài)的Cu. Zn-SOD顯示出特有的電子順磁波譜，在對Cu. Zn-SOD 酶的活性中心進行研究分析時證明，Cu. Zn-SOD活性不僅決定于酶蛋白，而且還決定于該酶 結構中的輔基-Cu和Zn，進一步研究對該酶氨基酸組成成分揭示，每個Cu. Zn-SOD分子中均 含有一個色氨基、一個蛋氨酸和三個酪氨基酸殘基，其它以甘氨酸含量最高。這種不同氨基 酸種類和含量也是該酶在分子結構上的又一重要的征。需要說明的是，對人類編碼Cu. Zn-SOD的基因，研究人員也進行了深入研究，經證 實高等動物及人類的細胞質中含有的Cu. Zn-SOD，編碼它的基因位于第21對染色體上。2. Mn-SOD 分離純化的Mn-SOD，呈淡粉紅色，存在于除紅血球外的所有線粒體內。 一般地講，動物細胞線粒體和原核生物體中都存在Mn-SOD，具體地講，這些酶的主要來源 有(1)真核細胞生物，包括紅藻、啤酒酵母、面包酵母、青豆、雞肝、鼠肝、人肝、牛心等；(2) 原核細胞生物，包括大腸桿菌(E. Coli. B)、分枝桿菌(鼠麻風分枝桿菌、草分枝桿菌)、嗜熱 脂肪芽胞桿菌、球形紅假單孢菌、鏈球菌(糞球菌)枯熱菌(水生枯熱菌、嗜溫枯熱菌)、放 線菌等；這些Mn-SOD雖其來源不同，但卻有著十分類似的生物學特性和理化性質，當然有 些來源不同的Mn-SOD，也存在著某些性質上的差異。Mn-SOD的基本特點，也主要表現(xiàn)在它的分子量和亞基分子量、氨基酸組成、吸收光 譜、順磁共振波譜法性和酶活性上。研究結果表明，來源于原核細胞中的Mn-SOD，其分子 量大多在10000左右，除了從草分枝桿菌、枯熱菌、放射菌等三種細胞提純的Mn-SOD為四 聚體以及分枝桿菌為三聚體外，其它均由兩個亞基組成的二聚體，每個亞基分別含有一個 錳原子，而來源于真核細胞線粒體內的Mn-SOD，除了從紅藻中提取的Mn-SOD為兩個亞基 組成的一聚體外，其余都是四個亞基組成的四聚體，其分子量為80000左右，從亞基分子量 看，Mn-SOD多肽鏈大于Cu. Zn-SOD。粒線體與藻類或菌類的Mn-SOD在氨基酸的排列上，雖 不完全類同，但總體來說，大同小異，它們與Cu. Zn-SOD比較，最突出的差別在于Cu. Zn-SOD僅含一個色氨酸，而且每個亞基僅有一個酪氨酸，而Mn-SOD卻含有較多的酪氨酸和色氨 酸。該酶在可見光區(qū)475nm(473 480nm)處有最大光吸收，但隨種屬來源不同略有差異， 可能是由Mn-SOD的電荷狀態(tài)不完全相同所定，因此，其氧化或還原都可影響可見光吸收 性質，正是出于這個原因，其消光系數(shù)不一樣，表現(xiàn)的光吸收特性也不一樣。在紫外光區(qū) 280nm(280-283nm)處有類似一般蛋白質的最大光吸收峰，這種紫外吸收光譜特征，可能是 由于該酶含有相當量的酪氨酸和色氨酸的緣故，其順磁共振特性，Mn-SOD與Cu. Zn-SOD不 一樣，天然的Mn-SOD無順磁共振波譜，只有Mn-SOD變性后才表現(xiàn)出其順磁共振波譜特性， 且與MnC12的共振波譜由線相同，該酶的活性與輔基中Mn有關，但其穩(wěn)定取決于酶蛋白。遺傳學研究結果證實，高等動物及人細胞中線粒體中所含Mn-SOD，其編碼它的基 因位于第6對染色體上。3. Fe-SOD 該酶和Mn_S0D、Cu. Zn-SOD 一樣，都是SOD有同功酶，其共同的作用特 點，都可催化· O2歧化為H2O2和O2，但在許多性質及生物學特征上，F(xiàn)e-SOD類似于Mn-SOD，而 不類似于Cu. Zn-SOD，這可能與三種SOD同功酶的結構和來源種屬不同有關。Fe-SOD呈淡黃色，這種類型的SOD僅存在于原核生物細胞中。具體地講，這些酶的 主要來源于原核生物細胞，如嗜硫代硫酸鹽綠菌、酒色著色菌、脫硫孤菌、巨大牙胞桿菌、大 腸桿菌B、結核分枝桿菌、脫氮副球菌、發(fā)光桿菌(包括間隔發(fā)光桿菌)、織線藻、卵狀假單胞 菌、云苔等，其分子量大小介于Cu. Zn-SOD和Mn-SOD之間，約38000左右，絕大多數(shù)來源是 Fe-SOD為兩個相等亞基組成的二聚體，其Fe含量與該酶的來源有關，有的亞基只有l(wèi)/2Fe 原子，有的亞基卻有1個Fe，因其來源于一些原核細胞，其種族特異較高等動物和人類相差 甚遠，因此，在Fe-SOD基礎和臨床醫(yī)學研究中心較為少見，實際應用更是稀少，本文不作贅 述。但特別指出的是，F(xiàn)e-SOD催化· O2反應為二級反應，其反應速度常數(shù)值隨pH增加而下
降，且在物理和化學因素影響下，F(xiàn)e-SOD活性常發(fā)生較大變化，應用中應特別加以注意。(三)SOD的生物功效SOD是一類具有高度抗氧化活性的高分子生物酶，其化學本質仍然是蛋白質，它具 有一般生物酶的一切特性，同樣是活細胞的成分、由活細胞產生，在體內外具有高效催化功 能的活性蛋白質。事實上，揚名全世界的SOD之所以倍受關注和青睞，并不僅僅是因為它是美國科 學家發(fā)現(xiàn)并研制成功的成果，也不僅僅是因為它是活細胞的成分，而是它能通過催化超氧 陰離子自由基(·02)發(fā)生歧化反應，減輕或消除超氧陰離子自由基(·02)及其代謝產物或 衍生物所誘導的氧化或過氧化反應對機體的損傷和危害。特別是，SOD作為體內唯一能夠 有效清除超氧陰離子自由基(·ο2)的特異性酶，其結構中的非蛋白質部分的輔助因子或輔 基為金屬離子、并以金屬螯合物形式存在。正是SOD這種特殊的結構，使它對由于超氧陰離 子自由基(·02)誘導的衰老、炎癥、腫瘤、輻射病、自身免疫性疾病、心腦缺血再灌注綜合癥、 白內障等相關疾病具有良好的防治效果，以及SOD對某些亞健康狀況、癌癥化療和放療、消 化系統(tǒng)疾病(慢性胃炎、萎縮性胃炎等)、呼吸系統(tǒng)疾病(哮喘、支氣管炎等)、皮膚病(接 觸性皮炎、日光性皮炎、黃褐斑等)、燒傷及修復等都均有一定輔助療效。下面對SOD的生物 學功效做個簡單的介紹。1、SOD與炎癥反應的關系炎癥是機體受到外界微生物入侵后的一種保護性反應。吞噬細胞在炎癥反應中起著重要作用，它們在吞噬過程或受刺激產生呼吸爆發(fā)，消耗氧 氣，活化己糖磷酸化支路，釋放大量· O2和· OH等活性氧，從而直接損傷內皮細胞、紅細胞、 成纖維細胞、血小板和精子，白細胞本身也能被它自己產生的氧自由基損傷。如用SOD治療角叉菜膠誘導的胸膜炎，可減少胸腔積液和白細胞的積累。SOD還可 以抑制關節(jié)炎，減少IgG在腎小球的沉淀，干擾白細胞在腎小球炎癥部位的積累。SOD可以 抑制黃嘌呤/黃嘌呤氧化酶引起的急性氣管炎導致的器官通透性的改變，減少多形核白細 胞在肺部的積累，而SOD用于治療炎癥具有很好的應用前景。LPS是細菌性炎癥的主要刺激物，可誘導許多炎癥因子(TNF-α、IL_1等)的表達。 路安德思(Loenders)等人利用LPS注射大鼠引發(fā)肺部炎癥，發(fā)現(xiàn)SOD與巨噬細胞、中性粒 細胞和氣管相關淋巴組織的上皮細胞結合。此時，血液中的SOD利用中性粒細胞作為載體， 將其運送到炎癥部位，而且，SOD具有抑制佛波醇酯誘導中性粒細胞和巨噬細胞釋放自由基 的作用。由此可見，結合了 SOD的中性粒細胞和巨噬細胞具有對抗活性氧，清除自由基的自 身保護功能。同類研究結果還表明，SOD還可通過抑制巨噬細胞釋放細胞因子，來減弱LPS介導 的中性粒細胞炎癥，通過減弱朗格漢斯細胞向淋巴結的遷移，顯著抑制了皮膚炎癥的接觸 性超敏反應，顯示出SOD所具有的抗炎癥、抗感染作用。而且，SOD還可減弱因高氧造成的 急性炎癥。2、SOD與神經系統(tǒng)疾病的關系FR誘導氧化應激及其損傷在許多神經系統(tǒng)疾病中 起關鍵作用，腦的正常抗氧化機制(包括SOD的作用)可能對預防這些疾病十分重要。動 物研究證實，SOD能調節(jié)大腦細胞外自由基及過氧化物的濃度，改善大腦的認知功能。對于腦萎縮患者，自由基(FR)或活性氧物質(ROS)可直接損害大腦細胞內大分子 物質，從而引起大腦組織廣泛的細胞死亡。而在腦組織逐漸萎縮的過程中，外部的抗氧化機 制(包括SOD的作用)會使不斷產生的自由基損傷作用而受到阻滯。而且，SOD在減少腦 萎縮后神經壞死程度上能發(fā)揮重要作用。SOD突變體與家族性肌萎縮性脊髓側索硬化癥(AIS)存在相關性，突變的SOD可 以和過硝酸反應形成硝酸蛋白，最終導致脊髓側索硬化癥(AIS)中運動神經元的選擇性變 性。對脊髓側索硬化癥(AIS)的治療可采用免疫抑制劑、神經營養(yǎng)因子等，但抗氧化劑SOD 應該是一種最有潛力的藥物。對帕金森病(PD)早期和晚期患者血液中SOD活性檢測發(fā)現(xiàn)，帕金森病(PD)晚期 SOD活性顯著下降，自由基氧化機制的損傷可能是帕金森病(PD)形成原因。而且，帕金森 病(PD)表現(xiàn)在大腦中鐵含量改變，線粒體功能受損，抗氧化保護系統(tǒng)減弱(主要是SOD和 谷胱甘肽的減少)，故早期SOD應用，應該是一種很有潛力的輔助藥物。3、SOD與心血管系統(tǒng)疾病的關系S0D在血管壁中表達量，主要由血管平滑肌細胞 分泌，它是人類主動脈中SOD最主要的存在形式。血管中的SOD主要存在于細胞外基質中， 另有一小部分在細胞表面及血漿中。超氧自由基(·02 )誘導的氧化應激在動脈粥樣硬化(AS)的發(fā)生、發(fā)展過程中起重 要作用、且超氧自由基(·0:)也參與了心血管疾病發(fā)生、發(fā)展的整個過程，特別是氧自由基 在低密度脂蛋白(LDL)的氧化修飾物的產生以及對于動脈粥樣硬化(AS)的形成起著非常關鍵的作用。SOD能清除超氧自由基(· O2 )，抑制或減少脂質過氧化物形成，減輕對血管內 皮細胞的過氧化損傷，從而保護血管系統(tǒng)免受氧自由基的損傷，防止動脈粥樣硬化(AS)的 形成。研究還顯示，冠心病時SOD的表達減少，而SOD活性降低又可造成冠心病患者血管 內皮細胞功能紊亂。而且，在動脈粥樣硬化(AS)時，血管中超氧自由基(· O2)的產生也明顯 增多，同時增多的超氧自由基也干擾了神經對血管緊張度的調節(jié)。因此，提高血管中SOD的 表達水平可，對預防人類發(fā)病率和死亡率最高的心血管疾病具有重要意義。另外，SOD還可抑制·02和一氧化氮(NO)的過剩在體內的平衡，阻止動脈粥樣硬化 (AS)的發(fā)生和發(fā)展。同時，調節(jié)SOD與活性的平衡對防治動脈粥樣硬化(AS)也 有重要意義。4、SOD與缺血再灌注損傷的關系在冠狀動脈的搭橋手術、溶栓術、變異型心絞 痛、冠狀動脈痙攣等癥狀緩解，血流恢復再通時，反而導致病情進一步惡化。這是因為，心肌 缺血再灌注后· O2產生增加，并通過膜的脂質過氧化反應損傷心肌細胞膜，從而導致Ca2+大 量進入細胞內產生心律失常。同時也能損傷血管內皮細胞和心肌細胞內線粒體膜、內質 網(wǎng)膜和溶酶體膜，從而破壞了機體的正常代謝，形成心肌缺血再灌注綜合癥。此時，如果在 這個時候注射適量的SOD便可有效減輕“心肌缺血再灌注綜合癥”的癥狀，而如果在恢復血 液再灌注前使用S0D，甚至有可能預防“心肌缺血再灌注綜合癥”的出現(xiàn)。不僅如此，在心肌缺血再灌注時，由于· O2產生增多，經氧化應激損傷作用介導的 途徑導致心臟功能惡化，內在抗氧物質的存在以及外源性給予S0D，可能降低心肌壞死程 度、減少心肌梗死面積，及對心肌和血管損傷后的修復及功能維持具有積極意義。SOD除應 用于心肌缺血再灌注綜合癥外，還可用于腦、腎、肝、小腸等動脈缺血再灌注前或再灌注過 程之中。5、SOD與器官移植的關系肝、腎、心臟、皮膚等器官移植，也存在著恢復血液灌注 的情況，因此，SOD也可應用于肝、腎、心臟、皮膚等器官的保存和移植、斷肢再植、整形、美容 等手術過程中出現(xiàn)的綜合癥，這樣可減輕自由基導致的損傷，確保移植手術的成功。通過納米技術，將SOD基因導入肝缺血再灌注損傷模型小鼠體內，使肝內SOD增加 了近10倍，· O2被減低到正常水平，丙氨酸氨基轉移酶水平降低，肝細胞的缺血再灌注損傷 顯著降低，這對肝移植后保護性治療具有重要意義。6、SOD與肺部疾病的關系S0D是肺組織中主要的自由基清除劑和抗氧化物。人 類的SOD主要存在于血管的細胞外基質、氣管及肺泡間隙中。而肺部過多的超氧自由基 (-O2)生成及與SOD平衡破壞，可導致許多肺部疾病的發(fā)生。因此，SOD等抗氧物質的調節(jié) 和補充對防治肺部及許多氣管疾病中疾病十分重要。超氧自由基(·02 )是急性肺損傷時的重要介質，因此增加或提高肺部SOD等抗氧 化物能對導的急性肺損傷能起到有效的保護作用。SOD對肺部的一些其他疾病也有 一定的保護作用，如人SOD在鼠肺部的定向表達可顯著保護其免于博萊霉素導致的肺纖維 化損傷。成人呼吸抑制綜合征(ARDS)的模型研究證實，中性粒細胞分泌的過多·O2等活性氧物質導致了肺損傷，并使病情惡化。而及時、合理補充SOD可有效減輕或降低此類肺損 傷。肺氣腫患者亦可使用S0D，但應在病變初期肺彈性纖維尚未受到損害時使用，療效較好。7、SOD與自身免疫性疾病(auto immune disease, AID)的關系各種不同類型的 自身免疫性疾病的發(fā)病機制各有其不同的特點，但’G2前列腺素以及由巨噬細胞、單核白細 胞和中性白細胞產生出來的水解酶類在病變上起著重要作用。不僅如此，超氧自由基(· O2 ) 的氧化作用和過氧化損傷，可引起蛋白質變性及蛋白質合成差錯，從而形成自身免疫性疾 病。動物實驗已證實，SOD和其它氧自由基的清除劑能抑制自身免疫性疾病的慢性發(fā)病過 程，SOD通過對· O2清除作用，可預防和治療各類自身免疫性疾病。如SOD可用于治療紅斑狼 瘡、硬皮病、皮肌炎等，顯示出一定的療效。特別是對于類風濕關節(jié)炎患者，如在急性期病變 未形成前使用，其療效作用將會更好。而且，人類紅斑性狼瘡患者血清中有一種能使染色體 破壞的介裂因子，這種因子的存在與·02出現(xiàn)呈正相關，故用SOD治療效果較好。8、SOD與輻射病及輻射防護的關系輻射可引起機體內水分子產生過多· A，而這 些過多生成的引發(fā)自由基的鏈反應，造成機體對'O2的反應加重，甚至形成輻射病。SOD 可用來預防或治療由于放射治療引起的膀胱炎、皮肌炎、紅斑狼瘡及白細胞減少等疾病，對 有可能受到電離輻射的人員，也可注射SOD作為預防措施。9、老年性白內障老年性白內障的形成，也主要是超氧自由基(· O2)對晶狀體蛋 白氧化的結果。在老年性白內障形成前，或者在患老年性白內障早期，甚至在進入老年期前 即開始經常服用一些抗氧化劑，或者說適當補充和注射一定量的S0D，具有一定預防和初期 治療效果。如果一旦形成白內障，則需要手術摘除，用SOD治療無效。(四)SOD的結構修飾SOD是一種特殊的金屬酶，它作用的底物是超氧陰離子自由基(· O2 )。超氧陰離子 自由基與很多疾病的形成和發(fā)生有密切關系，它的特殊作用機理，受到醫(yī)學界的普遍關注。 作為藥用S0D，目前雖尚未列入藥典，但國外已有商品出售，其商品為Orgotein、Ormetein, Onotsein、Palosein、Paroxinorn。國人藥用SOD制劑的研制和生產正在迅速發(fā)展，一些SOD 制劑相繼出現(xiàn)，經過廣大科學工作者的合作，其基礎醫(yī)學研究和臨床試驗也進入一定階段。 但是，由于游離的SOD在血中半衰期短，與生物膜的親和力差，有一定抗原性等問題，在很 大程度上限制了它在臨床上的廣泛應用，為此，國內外研究人員又加緊研究，對它的分子結 構進行改造和修飾。1、聚乙二醇-SOD (Polyethylene glycol-SOD，PEG-SOD)由于游離 SOD 在血中半衰 期短、代謝速率快為了提高其臨床療效，1979年Mc. Cord等人開發(fā)出PEG-SOD衍生物，他們 用化學方法使PEG與游離SOD結合，制成PEG-SOD衍生物，通過分析測定，證實PEG-SOD較 F-SOD血中半衰期由原來的5-6分鐘延長至24-35小時。盡管PEG-SOD在延長血中半衰期 方面邁進了一大步，但研究和臨床應用中發(fā)現(xiàn)，血中SOD的滯留時間與療效并非完全一致， 原因之一是SOD與靶細胞的親和力問題。由于PEG-SOD與靶細胞的親和力低，療效不理想， 所以PEG-SOD在臨床上未能得到推廣使用。但是PEG-SOD對于SOD穩(wěn)定性的提高是不容置 疑的。2、脂質體-SOD (Liposome-SOD, L-S0D)1982年Michelsion等人把SOD埋入以磷脂為主要成分的脂質體中，制成脂質體-SOD衍生物。通過分析和檢測發(fā)現(xiàn)，L-SOD能很好地附著在紅細胞膜上，運行在循環(huán)系統(tǒng) 中，特別是SOD對入脂質體中形成L-SOD后，其在血中不容易分解，分子量從3. 3萬提高到 9. 6萬，半衰期延長至7 24小時。作者指出，通過改變L-SOD的脂質體的組成，還能獲得 對不同臟器有明顯趨向性的不同SDO衍生物。例如，陽離子性脂質體-SOD多趨向肺，陰離 子性脂質體-SOD多趨向肝、游離SOD靜脈注射后，大部分集中在腎，L-SOD則可廣泛分布各 臟器。L-SOD在動物病理模型上的應用較多，如因輻射所致纖維化疤痕，每周肌肉注射兩次 就明顯好轉。Chan等用低溫(-50°C )引起大鼠大腦損害(水腫，血管通透性增加等)，如果 在低溫處理前給大鼠分別注射游離SOD和L-S0D，結果發(fā)現(xiàn)，注射L-SOD的大鼠，大腦損害及 水腫和血管通透性增加明顯減輕，而注射游離SOD則無效。在歐洲及日本用L-SOD治療某 些肝病、自身免疫性疾病、風濕病、川畸病、Behcet病及Crohn病等都獲得滿意療效。此外， L-SOD與某些抗癌藥并用，可減少其副作用，保證正常組織細胞。例如爭光霉素，阿霉素，道 諾霉素等抗癌藥，具有在癌細胞中產生活性氧破壞DNA鏈的機制。在正常細胞里，有分解爭 光霉素的酶，因而它對正常細胞的毒害較少，但心肌細胞缺乏分解阿霉素及道諾霉素的酶， 因而它們對心肌的毒性大。由于L-SOD能進入包括心肌細胞在內的正常細胞而不易進入癌 細胞，若將L-SOD與阿霉素，道諾霉素，爭光霉素合并使用，既可發(fā)揮其抗癌作用，又能減少 對心肌及正常細胞的嚴重副作用。靜脈注入游離SOD時，SOD多附著在細胞外側，很難進入細胞內。而靜脈注射L-SOD 時，L-SOD可透入細胞內，附著在細胞的側壁上。附著細胞外側的游離S0D，既不能發(fā)揮細 胞內對·ο2的清除作用和解毒作用，也不能發(fā)揮對正常細胞的保護作用，相反，還會影響和 削弱抗癌藥物對癌細胞的殲減作用；而進入細胞內，附著在細胞內壁的L-S0D，不僅可以達 到胞內自由基消除作用，且不會干擾抗癌藥物對癌細胞的殺減作用。因而，使正常細胞得到 保護，使癌細胞得以殺減。還有作者提出，靜脈注入游離SOD時，血中濃度可能短暫大幅度 升高，使自由基和抗自由基濃度失衡，既不利于機體正常代謝，也不利于機體的防卸機制， 而L-SOD進入細胞后，少量緩慢地釋放出游離S0D，不會使血中驟然濃度升高，對機體的防 御機制無影響。3、SM-SODSM-SOD是指苯乙烯馬來酰胺與SDO形成的衍生物(Stylenemleimide-SOD或 Polytyrene-Comaleic acid-SOD，簡寫SM-S0D)。制作時，先將馬來酸與苯乙烯反應，生成聚 苯乙烯馬來酸(SM)，后者再與SOD連接，即可形成SM-S0D。一般地講，1分子SOD分子上的 Lys殘基與2分子SM以及酰胺鍵連接，形成SM-SOD。SOD分子量3. 3萬，如果沒有制作成 SM-S0D，靜脈注射后，這個親水性的蛋白酶很快被腎清除，因為，本科類藥物在血中的行為， 取決于它們的分子大小、形態(tài)、電荷性質、疏水性，表面的細微結構及腎臟清除。一般地講， 直徑在8nm以上者不易被腎清除。白蛋白直徑7nm，分子量(MW)約6. 6萬分子呈橢圓形帶 負電荷，與腎基底膜溶液酸的蛋白質有靜電相斥作用，腎功能正常時，難被腎清除。然而，膽 紅素、脂肪酸、尿素等分子量遠比SOD分子量小，卻不易被腎臟濾過，其原因是這些疏水型 陰離子在血中主要與白蛋白結合成復合物，有學者將此原理引申擴大用于親水性的酶類藥 物S0D，他們選擇SM作為與白蛋白和SOD都結合的配體，將SM先與SOD結合形成SM-SOD衍 生物，SM-SOD靜注入體內，由于SM能在體內迅速與白蛋白進行結合，因此，當SM-SOD注射 入血后，在血中SM-SOD迅速與白蛋白結合。一般是否分子SM-SOD與分子白蛋白結合，這種白蛋白包裹的SOD衍生物，不會被蛋白酶水解，抗體和白細胞也難與之接觸，這不僅保護了 SOD酶不被水解破壞，而且降低了其抗原性。SM-SOD-白蛋白復合物不易被腎清除，血中半 衰期延長至6小時。此外，SM本身質子化或變?yōu)榉请姾晌镔|，脂溶性提高，易于與生物膜結 合。分子表面有疏水的有機陰離子的SOD(SM-SOD)在微循環(huán)中能有效地向pH低的病變部 位聚集，即病灶趨向性，這種聚集是可逆的，當病變改變后，SM-SOD又重新返回血中與白蛋 白結合，又形成SOD-SM-白蛋復合物，繼續(xù)發(fā)揮有效的生理功能。日本學者渡邊信和等人報 導，心肌缺血再灌注的大鼠，幾秒鐘后出現(xiàn)心室早搏型心律不齊現(xiàn)象，如果在缺血再灌注前 分別給大鼠靜脈注射游離SOD及SM-S0D，結果發(fā)現(xiàn)，靜脈注射SM-SOD的大鼠未出現(xiàn)心律不 齊，而注射游離SOD則無抗心律作用。這也說明，SM-SOD與F-SOD在作用效果上存在明顯 差異。4、酶化-SOD (Acyl-SOD，簡 Ac-SOD)SM-SOD在體內的半衰期明顯延長，且有一定的病灶趨向性，這是SM-SOD在體內應 用的長處。但角膜、結合膜、皮膚等組織中的血管很少或沒有，通過進入血管和血液循環(huán)向 它們提供SOD的作用效果小，且SOD是帶負電荷的可溶性酶，用它點眼或涂在皮膚，難于保 留在病變部位。為此，日本學者安東元正等人研究開發(fā)了酶化-S0D，將疏水性脂肪酸結合 到SOD分子的Lys殘基上，使之形成與細胞膜脂雙層親和力高的Ac-SOD衍生物。Ac-SOD活 性與環(huán)境污染經處理的SOD活性大致相同，但Ac-SOD與膜的親和力強，從而與角膜結合膜、 皮膚等能聚密結合。用Ac-SOD治療內毒素誘發(fā)的家兔角膜炎或潰瘍，明顯抑制了白細胞浸 潤，延緩了病變的發(fā)展。而在同樣條件下，采用游離SOD則無此作用。5、其他修飾SODCtelan把牛Cu. Zn-SOD與戊二醛結合，在血中再與白蛋白結合，形成分子量為 200000道爾頓左右衍生物，血中半衰期延長至6-8小時。宮田等把Serraria(沙雷氏菌)的 Mn-SOD與該菌的蛋白酶結合，然后再與人的α-巨球蛋白形成α M-SOD衍生物，使Serraria Mn-SOD的抗原性下降，血中可長時間保持其活性。(五)SOD皮膚外用狀況自從日本學者小倉良平等人證實皮膚病患處組織中SOD活性下降，LPO含量升高 后，近幾年來，皮膚科專學對此進行大量的研究和探討，現(xiàn)已有大量資料報導，多種皮膚病 與SOD活動有關。寧夏醫(yī)學院的研究人員，測定了兩種著色性干皮病(XP)家族中4名患者和21名 家庭成員的全血SOD活性。結果表明(I)XP患者全血SOD活性為1114. 3士80. OU/gHb ； (2) 雜合型為1224. 9士63. 6U/gHb ； (3)同齡正常對照組SOD活性為1532. 9士31. OOU/gHb和 1341. 7 士 78. 7U/gHb?；颊呷猄OD活性與同齡對照組相比，有顯著性差別(P < 0. 05)。雜 合型與同齡對照組相比，差別無顯著性意義(P>0. 05)。但從數(shù)值上看，其SOD活性確低于 同齡對照組，這一組結果提示(I)XP的發(fā)病與患者體內SOD活性低下，.O2-通過抑制DNA修 復酶和DNA聚合酶活性，使DNA的復制和修復過程產生差錯，并與DNA切除修復缺陷者共同 作用從而引起一系列臨床癥狀。(2) S0D-1活性明顯低下，雜合型S0D-1活性偏低，顯示與本 病相關的DNA修復酶基因可能與S0D-1基因連鎖，定位在21號染色體上有關。因此作者認 為，探索應用SOD制劑治療XP患者，可能是一種較為有效的方法。作者研究不同SOD復合酶含量對抗組織胺的實驗，并選擇撲爾敏作為陽性對照藥物。結果發(fā)現(xiàn)，一定濃度和活性的SOD復合酶溶液和撲爾敏均能對抗組織胺，且與對抗組織 胺的圓形十分類似，這表明SOD在皮膚外用藥中的應用具有一定的理論和實驗基礎。關于SOD透皮性的問題，作者曾專門選擇三種試驗動物(小白鼠、豚鼠、家兔)進 行試驗，一側為對照側，涂抹不含SOD制劑另一側同樣部位為對照側，涂抹含SOD制劑的同 樣基質，一周后，分別取皮下組織進行測定SOD活性。結果表明，涂沫SOD制劑的試驗側皮 下組織SOD活性非常顯著地高于對照組皮膚(P < 0. 01)，一種試驗動物的結果表現(xiàn)出同樣 的規(guī)律。第二軍醫(yī)大學基礎同位素室的研究人員為了觀察SOD-I的透皮吸收情況，也進行 相應的透皮試驗，他們用1251標記人S0D(125I-Hsod-l)以磷酸緩沖液的水溶液的制劑給 小鼠背部皮膚進行涂抹，結果發(fā)現(xiàn)，皮膚后lh，血液即能測出放射性1251，每ml血液計數(shù)達 500 600cpm，除個別點外，血球的放射性均高于血漿的放射性；各組織器官的放射性物質 在皮涂Ih后，也能測出。因此推論，S0D-1是能部分通過皮膚進入機體的。綜上所述，SOD具有廣泛的醫(yī)用價值，但由于天然的SOD穩(wěn)定性較差，容易失活，不 易保存，而限制了 SOD的應用面。近年來，SOD在護膚品上的應用上越來越廣泛，其主要原 因包括兩個方面，一是化妝品添加劑，可防止皮膚老化，起到護膚效果；二是預防和治療有 關皮膚病。這些在國內外已獲得廣泛的應用，許多高級化妝品都添加了 S0D，并將它制成面 膜、奶液、霜劑。國內有大寶SOD霜、紫羅蘭SOD霜和SOD不老霜等產品。但SOD的穩(wěn)定性 依舊成為應用的一大瓶頸，目前在一些外用化妝品中，主要是通過給藥載體、優(yōu)化保存條件 來增強SOD的穩(wěn)定性，避免其失活，如在臨床上使用SOD外用脂質體霜劑治療色斑，取得很 大的成功。張懷亮采用卵磷脂、膽固醇制備脂質體作為SOD的載體，研究表明SOD活性在霜 劑中可保存6個月以上。在我國已進行了大量的SOD的化學修飾的研究工作，并已取得了不錯的結果?；?學修飾就是在分子水平上對SOD的基團通過人工的方法與一些生物相容性大分子進行連 接，從而達到改變SOD的性質，提高其半衰期、降低免疫原性、減弱蛋白酶的水解。比如用 單甲基聚乙二醇(mPEG)修飾過的S0D，具有更強的生物活性、更少的活性損失、更長的半衰 期、血藥濃度波動較小、較少的酶降解作用、較少的免疫原性及抗原性、較小的毒性、更好的 溶解性，等。雖然通過化學修飾在一定程度上，提高了 SOD的穩(wěn)定性，彌補了 SOD應用上的很多 缺陷。但在SOD皮膚給藥的應用中，SOD的透皮率太低，只能部分通過皮膚進入機體，很難 達到治療的效果。所以在應用上，皮膚外用上SOD通透性依舊是一個關鍵的問題。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是，提出一種具有穩(wěn)定良好，能持久保護SOD生物活性及提高SOD皮 膚外用通透性的一種可直接皮膚外用的聚乙二醇化超氧化物歧化酶(mPEG-SOD)納米乳及 其制備方法。因為納米乳載體屬于納米級乳液，第一，可以把修飾過的SOD包裹在納米乳中，進 一步提高SOD成分的穩(wěn)定性；第二，納米乳載體提高了功效成分的分散度、使得功效成分以 納米級存在于體系中，提高了 SOD在皮膚外用產品的透皮滲透性，最大化提高功效成分的 利用率。第三，使用聚乙二醇化的SOD作為外用功效成分，并結合納米乳載體形成mPEG-SOD納米乳，非常具有外用優(yōu)勢。實現(xiàn)上述發(fā)明的目的是提供一種可直接皮膚外用的聚乙二醇化超氧化物歧化酶 (mPEG-SOD)納米乳。1、本發(fā)明的技術方案(1)本發(fā)明的一種可直接皮膚外用的聚乙二醇化超氧化物歧化酶(mPEG-SOD)納 米乳是由下述重量份配比的原料組成肉豆蔻酸異丙酯5-10份辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯25-35份聚甘油-3- 二油酸酯6-15份mPEG-SOD 水溶液46-53 份維生素E1-10份(2)本發(fā)明的一種可直接皮膚外用的聚乙二醇化超氧化物歧化酶(mPEG-SOD)納 米乳是由下述重量份配比的原料組成肉豆蔻酸異丙酯6-8份辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯28-33份聚甘油-3- 二油酸酯7-12份mPEG-SOD 水溶液47-51 份維生素E2-6份(3)本發(fā)明優(yōu)選重量份配比是肉豆蔻酸異丙酯7份辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯30份聚甘油-3- 二油酸酯10份mPEG-SOD 水溶液50 份維生素E3份(4)本發(fā)明的一種可直接皮膚外用的聚乙二醇化超氧化物歧化酶(mPEG-SOD)納 米乳，其配方中SOD水溶液的質量濃度為0. 03%。(5)本發(fā)明的另一目的是提供一種可直接皮膚外用的聚乙二醇化超氧化物歧化酶 (mPEG-SOD)納米乳的制備方法，包括以下步驟1)將處方量的mPEG-SOD溶于蒸餾水，將此溶液作為mPEG-SOD水溶液，備用；2)按照配方中各成分比例稱取用量，備用，將處方量的重量維生素E溶于肉豆蔻 酸異丙酯中，備用；3)將處方量辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯、聚甘油-3-二油酸酯，充分混合均勻，并加 入處方量的mPEG-SOD水溶液，然后加入(2)中配好的液體；并將整個體系在室溫25°C條件下或者自然室溫中，啟動定時恒溫磁力攪拌器，以 200rpm· HiirT1的轉速磁力攪拌，充分混勻，直至整個體系呈透明狀液體，即為一種可直接皮 膚外用的聚乙二醇化超氧化物歧化酶(mPEG-SOD)納米乳；4)將此一種可直接皮膚外用的聚乙二醇化超氧化物歧化酶(mPEG-SOD)納米乳迅 速分裝于不同規(guī)格的避光玻璃容器之中，迅速加蓋，包裝，并置于4°C冰箱中密閉保存即可。2、本發(fā)明的有益效果
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綜上所述本發(fā)明一種可直接皮膚外用的聚乙二醇化超氧化物歧化酶(mPEG-SOD) 納米乳與現(xiàn)有的技術相比，具有以下有益效果(I)SOD經mPEG修飾后，即PEG化后，其主要的生物學功能保持不變，還具有以下的 優(yōu)點延長了 SOD的半衰期，增加了 SOD的水溶性，降低毒副作片，減少免疫原性，提高藥物 在體內外的穩(wěn)定性。在此基礎上，本發(fā)明運用納米乳技術制備一種可直接皮膚外用的聚乙 二醇化超氧化物歧化酶(mPEG-SOD)納米乳。進一步地強化了 mPEG-SOD的優(yōu)勢。(2)本發(fā)明一種可直接皮膚外用的聚乙二醇化超氧化物歧化酶(mPEG-SOD)納米 乳，納米乳粒徑小，被包容的超氧化物歧化酶(SOD)分散度提高，在皮膚外用中，可促進超 氧化物歧化酶(SOD)的透皮吸收，解決了超氧化物歧化酶(SOD)透皮制劑吸收率低的問題。(3)本發(fā)明制備一種可直接皮膚外用的聚乙二醇化超氧化物歧化酶(mPEG-SOD) 納米乳，mPEG本身對SOD結構進行了修飾，提高了 SOD的穩(wěn)定性，再加上納米乳的特殊結構 把mPEG-SOD蛋白包裹在納米乳核中，不與外在環(huán)境接觸。另外納米乳載體本身有一定抗 菌、抑菌作用，所以不需添加化學防腐劑就能預防產品變質，這進一步提高了 mPEG-SOD的 穩(wěn)定性。(4)本發(fā)明制備的一種可直接皮膚外用的聚乙二醇化超氧化物歧化酶 (mPEG-SOD)納米乳，是在攝氏25°C左右的溫度條件下配制，因此對于保護SOD功效成分的 活性及含量具有重要價值。本發(fā)明能最大限度保持其生物活性及生物學作用。(5)本產品制備工藝簡單，實際操作容易、制備高效快速、不需要特殊儀器設備，節(jié) 約能源和成本，又不污染環(huán)境，適合產業(yè)化生產。3、本發(fā)明的制備注意事項(1)產品配制時所用的容器必須按照規(guī)定嚴格清洗和消毒，最好采用強酸浸泡后 水沖，再清水洗滌干凈，后用蒸餾水浸泡晾干，再置于烘箱高溫消毒干燥后備用；另外，在進 行產品配制時，所用容器均要特別注意防止含有雜質或金屬離子及微生物等污染，以免影 響產品質量和穩(wěn)定性。(2) SOD為丁克祥教授私人饋贈，因此，在前期修飾和配制時應及時與丁教授溝通 聯(lián)系，以便該課題組能完成足夠量的SOD合成與制備。(3)嚴格按照上述劑量和方法進行配制。在進行該產品配制時，應根據(jù)上述流程順 序添加，其添加劑量務必要求準確無誤，而且，在其它原料的添加上，一定要等上一種加入 的原料充分溶解后才能再加入下一種原料，以免出現(xiàn)渾濁，影響整個納米乳體系的配制。(4)在配制外用mPEG-SOD納米乳時需要選擇和確定S/C質量比(km值)，而確定 S/C質量比(km值)1、2、3、4，是需要進行滴定水油兩相的二元液試驗并通過偽三元相圖分 析后才能最后確定，只有在確定并計算出得到最大的納米乳區(qū)域的km值，才是較為理想的 km值。上述制備方法已通過試驗確定Km值為3，但在實際進行產品配制時，表面活性劑⑶ 和助表面活性劑按此比例仍須在進行混合后還要再充分混勻，以免影響配制效果和質量。(5)由于液態(tài)溶液的比重或密度不同的關系，在進行產品配制時，所選配制容器的 容量一定要稍大于實際配制的產品量，如配制IOOg產品，需要選擇150-200mL的配制容器， 這樣既便于各成分充分混合和溶解，也便于超聲震蕩或者攪拌混勻，而不至于往外溢出。(6)空白納米乳本身雖具有一定的抑制細菌生長的特點，本產品配方中未有另外 添加防腐劑，故在進行產品配制時，除配制容器必須進行嚴格清洗和消毒外，具體配制時也應嚴格按照操作規(guī)程，盡可能在無菌條件下并按照無菌操作要求進行操作，避免該納米乳 樣品受到污染，影響產品質量。(7)配制完成的樣品務必用避光包裝，并盡可能置于陰涼干燥通風避光處保存，要 遠離火源或熱源。另外，產品平時使用后，無須置于低溫或冰箱保存，但務必加蓋密封嚴實， 放置于自然室溫避光保存即可。(8)本品可能對皮膚有刺激性，如使用部位出現(xiàn)明顯反應請立即暫停使用；在實 際使用過程中，切勿將本品弄入眼內；皮膚受傷、有傷口或紅腫不得使用、使用后如有持續(xù) 紅腫，應停止使用；嬰兒和兒童不得使用；皮膚敏感者，使用前應做皮膚敏感性測試，測試 完全無刺激性反應方可使用。(9) SOD為肽類物質，因此該固態(tài)原料需要-20°C左右冷藏較為適宜，臨用臨配，且 每次配制量不宜太大，配制SOD水溶液后，盡量現(xiàn)配現(xiàn)用，如用不完，應置于2-8°C冰箱短期 保存。(lO)mPEG-SOD納米乳放入冰箱后會出現(xiàn)渾濁，但恢復室溫后能自行形成納米乳， 不影響使用。


圖1. 一種可直接皮膚外用的聚乙二醇化超氧化物歧化酶(mPEG-SOD)納米乳的制 備工藝流程及技術路線。
具體實施例方式下面結合具體實施例子來進一步說明本發(fā)明的產品和制備方法實施例1 一種可直接皮膚外用的聚乙二醇化超氧化物歧化酶(mPEG-SOD)納米乳 的制備方法一種可直接皮膚外用的聚乙二醇化超氧化物歧化酶(mPEG-SOD)納米乳各原料的
優(yōu)選重量份配比是肉豆蔻酸異丙酯7份辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯30份聚甘油-3-二油酸酯10份mPEG-SOD 7jC溶液50 份維生素E3份一種可直接皮膚外用的聚乙二醇化超氧化物歧化酶(mPEG-SOD)納米乳的具體制 備方法(以配制IOOg為例)①mPEG-SOD水溶液配制將0. 015g mPEG-SOD溶于49. 985g蒸餾水。將此溶液作 為水相(I)50g ；②用分析天平準確稱取7g的肉豆蔻酸異丙酯，置于另一個經過洗消過的50mL三 角燒瓶之中，并稱取3g的維生素E溶于其中，用記號筆清楚標記為油相(II) IOg ；③按照事先已設計好的辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯(S)聚甘油-3- 二油酸酯(C) =3 1的比例，分別準確稱取30g辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯和IOg聚甘油-3-二油酸酯， 并將這兩者原料置于第三個經過洗消過的IOOmL潔凈三角燒瓶之中；加蓋，并將此三角燒瓶迅速置于液體快速混合器上，打開液體快速混合器，并將其調至II檔，充分混合均勻，使 之形成乳化劑/助乳化劑(S/C)混合物，3-5min后，關閉液體快速混合器，取下三角燒瓶，并 用記號筆清楚標記為S/C混合物(III)40g ；④按照油相(II) S/C混合物(III)水相(I) = 10% 40% 50%的比例， 先分別取水相(I)50g、S/C混合物(III)40g置于第四個經過洗消過的200mL潔凈三角燒瓶 之中；⑤將上述水相(I)、S/C混合物(III)兩液相充分混合后，再在室溫25°C條件下或 者自然室溫中，將其放入超聲振蕩器中震蕩并超聲2min左右，或者在室溫25°C條件下或者 自然室溫中，啟動定時恒溫磁力攪拌器，以200rpm ^mirT1的轉速磁力攪拌5min，然后，再在 此容器中直接加入油相(II) IOg,并將整個體系在超聲振蕩器中超聲5min左右，或者在室 溫25°C條件下或者自然室溫中，啟動定時恒溫磁力攪拌器，以200rpm ^mirT1的轉速磁力攪 拌 20min ；⑥關閉超聲振蕩器或者定時恒溫磁力攪拌器，取下200mL三角燒瓶，觀察其外觀 如是清亮無色、流體性和分散性好、有明顯可見乳光者，即為IOOg —種可直接皮膚外用的 聚乙二醇化超氧化物歧化酶(mPEG-SOD)納米乳；⑦將此IOOg —種可直接皮膚外用的聚乙二醇化超氧化物歧化酶(mPEG-SOD)納米 乳迅速分裝于不同規(guī)格的避光玻璃容器之中，迅速加蓋，包裝，并置于4°C冰箱中密閉保存 即可；⑧按照國際或國內或企業(yè)相關標準和要求，從上述分裝產品中隨機抽樣，首先采 用馬爾文儀器檢測該納米乳樣品的顆粒分布及粒徑大小，在符合納米乳的質量標準后，再 按照國家有關部門的具體要求，進行相關指標的系統(tǒng)檢測；待判斷或評價其完全符合國家 相關規(guī)定和標準及批準文號后，即可作為產品上市銷售或在美容院內專用。試驗例1、本發(fā)明的鑒定及穩(wěn)定性考察本發(fā)明通過電子顯微鏡檢測，一種可直接皮膚外用的聚乙二醇化超氧化物歧化 酶(mPEG-SOD)納米乳外觀澄清透明、可見乳光、具有一定的流動性，液滴直徑分布在10 IOOnm之間。本發(fā)明熱力學穩(wěn)定性好，貯存穩(wěn)定好，通過常溫留樣考察、強光照射實驗、高溫 試驗及低溫試驗，發(fā)現(xiàn)本發(fā)明不分層，即使在高速離心環(huán)境中也不分層。1)肉眼外觀觀察一種可直接皮膚外用的聚乙二醇化超氧化物歧化酶 (mPEG-SOD)納米乳外觀澄清透明、可見乳光、具有一定的流動性。經透射電子顯微鏡檢測， 液滴直徑分布在10 IOOnm之間。2)溫度穩(wěn)定性實驗將本發(fā)明一種可直接皮膚外用的聚乙二醇化超氧化物歧化酶(mPEG-SOD)納米乳 裝入密閉容器中，置于4°C、25°C、40°C、6(TC條件下考察，按一定時間間隔(0、1、3、6、12、24 個月)，測定穩(wěn)定性考察項目(有無分層)。結果表明，本發(fā)明mPEG-SOD納米乳外觀依舊透 明，未發(fā)現(xiàn)渾濁或沉淀現(xiàn)象。3)光穩(wěn)定性實驗將本發(fā)明一種可直接皮膚外用的聚乙二醇化超氧化物歧化酶 (mPEG-SOD)納米乳裝入密閉容器中，置于日光下，室溫光照于第5天、第十天測定，結果同 放置前比較沒有差異。結果發(fā)現(xiàn)本發(fā)明外觀依舊透明，未發(fā)現(xiàn)渾濁或沉淀，說明穩(wěn)定性好。4)加速穩(wěn)定性實驗取本發(fā)明一種可直接皮膚外用的聚乙二醇化超氧化物歧化酶(mPEG-SOD)納米乳，置于高速離心機所配套的離心管中，以13000rpm ^irT1的速度離心 30min，沒有分層，依舊透明，說明本產品穩(wěn)定性好。試驗例2、本發(fā)明一種可直接皮膚外用的聚乙二醇化超氧化物歧化酶(mPEG-SOD) 納米乳中SOD生物活性的測試按照本發(fā)明制備一種可直接皮膚外用的聚乙二醇化超氧化物歧化酶(mPEG-SOD) 納米乳和傳統(tǒng)的mPEG-SOD膏霜制備方法，在完全相同的條件下將本發(fā)明組方功效成份分 別配制成mPEG-SOD納米乳和mPEG-SOD膏霜，在完全相同的存放條件下分別于放置30天 前后分別測定SOD活性，結果發(fā)現(xiàn)，一種可直接皮膚外用的聚乙二醇化超氧化物歧化酶 (mPEG-SOD)納米乳中的SOD活性較SOD膏霜中的SOD活性明顯高。試驗例3、一種可直接皮膚外用的聚乙二醇化超氧化物歧化酶(mPEG-SOD)納米 乳、膏霜、乳劑制劑體外透皮滲透比較實驗用Franz擴散池進行一種可直接皮膚外用的聚乙二醇化超氧化物歧化酶 (mPEG-SOD)納米乳、膏霜、乳劑制劑體外透皮滲透比較實驗。Franz擴散池保持37°C水浴， 將大鼠皮膚固定供給池和接受池之間，真皮面向接受池，有效滲透面積為5cm2，接受池中注 滿接受液，防止產生氣泡，接受池容積為10mL，分別將制備mPEG-SOD納米乳、mPEG-SOD膏 霜、mPEG-SOD乳劑0. 5g各三份均勻涂布在皮膚上，供應室上放置蓋玻片，防止水分蒸發(fā)。開 啟電磁攪拌器以300r. miiT1轉速攪拌，分別于1，2，4，6，9h取出接受液ImL(取樣后補充等 體積接受液)，將樣品溶液15000r. miiT1高速離心后取上清液進行HPLC分析。由累積透皮 吸收量Q(公式1)求得SOD各劑型累計透皮吸收量，再計算得出可直接皮膚外用的聚乙二 醇化超氧化物歧化酶(mPEG-SOD)納米乳、膏霜權利要求
一種可直接皮膚外用的聚乙二醇化超氧化物歧化酶(mPEG SOD)納米乳，其特征在于它是由下述重量份配比的原料組成肉豆蔻酸異丙酯 5 10份辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯 25 35份聚甘油 3 二油酸酯 6 15份mPEG SOD水溶液 46 53份維生素E 1 10份。
2.根據(jù)權利要求1所述的一種可直接皮膚外用的聚乙二醇化超氧化物歧化酶 (mPEG-SOD)納米乳，其特征在于它是由下述優(yōu)選重量份配比的原料組成肉豆蔻酸異丙酯6-8份辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯28-33份聚甘油-3- 二油酸酯7-12份mPEG-SOD 水溶液47-51 份維生素E2-6份。
3.根據(jù)權利要求1所述的一種可直接皮膚外用的聚乙二醇化超氧化物歧化酶 (mPEG-SOD)納米乳，其中各原料的優(yōu)選重量份配比是肉豆蔻酸異丙酯7份辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯30份聚甘油-3-二油酸酯10份mPEG-SOD水溶液50份維生素E3份。
4.根據(jù)權利要求1、2、3所述的一種可直接皮膚外用的聚乙二醇化超氧化物歧化 酶(mPEG-SOD)納米乳，其特征在于成分中mPEG-SOD水溶液中mPEG-SOD的質量濃度為 0. 03%。
5.根據(jù)權利要求3所述的一種可直接皮膚外用的聚乙二醇化超氧化物歧化酶 (mPEG-SOD)納米乳，其特征在于所述的一種可直接皮膚外用的聚乙二醇化超氧化物歧化酶 (mPEG-SOD)納米乳的制備方法包括以下步驟(1)將處方量的mPEG-SOD溶于蒸餾水，將此溶液作為mPEG-SOD水溶液，備用；(2)按照配方中各成分比例稱取用量，備用，將處方量的重量維生素E溶于肉豆蔻酸異 丙酯中，備用；(3)將處方量辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯、聚甘油-3-二油酸酯，充分混合均勻，并加入 處方量的mPEG-SOD水溶液，然后加入(2)中配好的液體；并將整個體系在室溫25 °C條件下或者自然室溫中，啟動定時恒溫磁力攪拌器，以 200rpm· HiirT1的轉速磁力攪拌，充分混勻，直至整個體系呈透明狀液體，即為一種可直接皮 膚外用的聚乙二醇化超氧化物歧化酶(mPEG-SOD)納米乳；(4)將此一種可直接皮膚外用的聚乙二醇化超氧化物歧化酶(mPEG-SOD)納米乳迅速 分裝于不同規(guī)格的避光玻璃容器之中，迅速加蓋，包裝，并置于4°C冰箱中密閉保存即可。
6.根據(jù)權利要求5所述的一種可直接皮膚外用的聚乙二醇化超氧化物歧化酶 (mPEG-SOD)納米乳，其特征在于通過權利要求5方法所制備的一種可直接皮膚外用的聚乙二醇化超氧化物歧化酶(mPEG-SOD)納米乳的平均液滴直徑在10 IOOnm的范圍內。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種可直接皮膚外用的聚乙二醇化超氧化物歧化酶(mPEG-SOD)納米乳及其制備方法。該mPEG-SOD納米乳原料優(yōu)選重量份配比是肉豆蔻酸異丙酯7份，辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯30份，聚甘油-3-二油酸酯10份，mPEG-SOD水溶液50份，維生素E3份。本發(fā)明解決了SOD穩(wěn)定性差、容易失活、皮膚外用滲透性差的問題。本發(fā)明公開的可直接皮膚外用的聚乙二醇化超氧化物歧化酶(mPEG-SOD)納米乳，是一種穩(wěn)定性良好，可持久保護SOD生物活性的一種制劑，且能較快地滲透進入皮膚，從而大大提高了SOD的生物功效。本發(fā)明制備工藝簡單，實際操作容易，不需特殊儀器設備，制備高效快速。
文檔編號A61K8/86GK101947312SQ20101026511
公開日2011年1月19日 申請日期2010年8月26日 優(yōu)先權日2010年8月26日
發(fā)明者丁克祥, 丁宇, 左夏林, 朱曉亮, 楊永鵬, 董萍 申請人:董萍;丁克祥