專利名稱：穩(wěn)定的磷脂組合物的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及穩(wěn)定的水性磷脂組合物。
磷脂組合物可用于診斷、治療、化妝等各個領域。例如，脂類組合物，特別是脂質(zhì)體，可用來加入到診斷和治療劑中，作為遺傳物質(zhì)的轉(zhuǎn)運載體，作為免疫輔劑，用在疫苗的制備以及癌癥檢測中。很清楚，磷脂的穩(wěn)定性對降解反應中殘存的任何物質(zhì)的保護以及得到磷脂本身的最佳性能均有重要作用。
感興趣的一個特別的領域是用于診斷成像方面。造影劑在各種診斷技術(shù)中使用，增強了成像的效果，在以上診斷技術(shù)中最重要的是X-射線成像，磁共振成像(MRI)，超聲波成像以及核醫(yī)學成像。仍需要結(jié)合有良好貯存和活體中穩(wěn)定性的造影劑。感興趣的另一個特別領域是用于有關高壓滅菌技術(shù)中的穩(wěn)定磷脂組合物的發(fā)展。
研究顯示，[三(羥甲基)]甲基胺以及有關的緩沖化合物的使用對磷脂的水解有特殊的影響。其中許多研究顯示，通過[三(羥甲基)]甲胺緩沖劑的一般的酸/堿催化作用中隨緩沖劑種類濃度提高，磷脂的水解作用增強，(實例可參見《藥物科學雜志》82362-366(1993))。
然而，由組合物中[三(羥甲基)]甲胺和磷脂酶的相互作用而引起的磷脂組合物水解的抑制作用也已有報道(實例參見《生物化學和生物物理研究通報》84238-247(1978)；《生物化學雜志)》203799-801(1982)；《昆蟲生物化學和生理學檔案》141-12(1990)；以及《細菌學雜志》1754298-4306(1993))。
在《脂質(zhì)化學和物理》6093-99(1991)中，研究了空氣條件下，在脂質(zhì)體水性懸浮液中磷脂的抗氧化降解穩(wěn)定性。證明了卵磷脂在[三(羥甲基)]甲胺緩沖劑中與在純水中相比，具有更強的抗水解作用。指出這與天然出現(xiàn)的磷脂有特別關系，其中這種磷脂具有多不飽和脂肪酸鏈，而該鏈容易對自由基機理的過氧化反應敏感。如在公開中指出的那樣，眾所周知水的超聲輻射促使產(chǎn)生氫氧自由基和過氧化氫，而這些活性氧類與磷脂的氧化降解有關。表面看來，[三(羥甲基)]甲胺對水解有抵抗作用，但文獻中指出觀察到的氧化作用/水解作用的減小歸因于[三(羥甲基)]甲胺起到了有效的氫氧自由基的清除劑作用。在《藥物藥理學雜志》45490-495(1993)中也得到了類似的結(jié)論，其中還報道了緩沖劑的保護效應如[三(羥甲基)]甲胺抗脂類過氧化。
在WO-95/26205(Nycomed/Dauchi)中描述了含有多層脂質(zhì)體的診斷組合物，而多層脂質(zhì)體中含有至少一種成像劑，并且懸浮在含有上述成像劑的水性介質(zhì)中，其中該脂質(zhì)體含一種中性磷脂和一種帶電的磷脂，并且脂質(zhì)體的平均顆粒直徑是50-3000nm，而填充于脂質(zhì)體內(nèi)部在任一水相中的成像劑濃度與脂質(zhì)體懸浮的水性介質(zhì)中的成像劑濃度基本相同。
令人驚奇的是，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)基本飽和的磷脂化合物可通過緩沖劑被穩(wěn)定，這種緩沖劑降低了磷脂的水解程度。
因此，從一方面看，本發(fā)明提供了一種水性脂類組合物，優(yōu)選一種脂質(zhì)體組合物并且優(yōu)選組合物以在生理上可行的形式存在，該組合物中包含一種或多種基本飽和的磷脂，該磷脂與含有氨和的水溶性胺的緩沖體系結(jié)合，此體系在15℃時，pH小于或等于9.5，其條件是上述的磷脂包含一帶電磷脂和中性磷脂的結(jié)合體，而且上述組合物是一種含有一種非離子性的多羥基化的X-射線造影劑的脂質(zhì)體組合物，而且上述造影劑不以在基本相同的濃度存在于脂質(zhì)體及和周圍水性介質(zhì)中。
因此，特別提出放棄公開在WO-95/26205中的診斷組合物的權(quán)利要求。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，我們提供了一種方法可穩(wěn)定基本飽和的磷脂組合物，該方法包含包括在一基本飽和的磷脂組合物中的一緩沖體系，該緩沖體系含有氨或一種水溶性的胺，在15℃時，其pH值小于或等于9.5，而不是將一種上述緩沖體系加入到一含有一種非離子性的多羥基化X-射線造影劑的脂質(zhì)體(liposomal)組合物中，并且上述造影劑同時以基本相同的濃度存在于脂質(zhì)體中和周圍的水性介質(zhì)中。
對于脂質(zhì)體組合物，該緩沖劑可在脂質(zhì)體生成前或生成后加入。
從更深一個方面看來，本發(fā)明還提供了增強對比的成像方法，在這個方法中，對實驗對象(例如一個人或非人的動物，優(yōu)選一種哺乳動物)上使用一種對比介質(zhì)(contrast medium)，得到實驗對象的一幅影像，其特征在于上述使用的對比介質(zhì)是根據(jù)本發(fā)明的一種組合物，其中含有一種對比有效材料(contrast effective materials)。如果需要，該對比介質(zhì)可在對比有效材料活化后使用，例如可通過超極化作用。
從另一方面看來，本發(fā)明提供了一種處理方法，其中，將一種治療劑或預防劑施用于一實驗對象(例如人或非人動物，優(yōu)選一種哺乳動物)上，其特征在于其使用了一種根據(jù)本發(fā)明得到的組合物，該組合物中含有上述的治療或預防劑。
從另一方面看來，本發(fā)明提供了一種化妝處理方法，其中，將一種化妝劑施用于一實驗對象上(例如，一個人或非人的動物，優(yōu)選一種哺乳動物)，其特征在于使用的組合物是根據(jù)本發(fā)明得到的，其中含有上述的化妝劑。
在這些方法中，使用的該組合物中應含有有效量的活性試劑(對比有效材料，治療劑或預防劑或化妝劑)，亦即足夠的數(shù)量以達到對比增強效果或達到理想的治療，預防或化妝的效果。
本發(fā)明的組合物和方法中使用的磷脂可以是帶電的或中性的(即，不帶凈電荷)。然而，特別優(yōu)選使用中性磷脂，由于它們通過緩沖體系的抗水解保護作用特別顯著。本發(fā)明組合物中特別優(yōu)選的磷脂，全部或基本全部是中性磷脂。
用于本發(fā)明方法或組合物中的緩沖劑體系優(yōu)選在室溫下(15℃)pH值為6.0-9.5，更優(yōu)選6.5-8.0，特別優(yōu)選6.8-7.8。
與未包括特定緩沖體系的配方相比，本發(fā)明組合物表現(xiàn)出磷脂水解度降低。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的組合物在給定時間(例如一個正常貯存期限，例如30天或更長)，相比于未包含本緩沖體系的配方其水解程度降低超過5％；更優(yōu)選的組合物其水解程度降低超過10％，最優(yōu)選降低超過25％。
達到的穩(wěn)定性，在貯存、加工和磷脂組合物曝露于溫度中，包括高壓滅菌過程特別有利。
本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，該磷脂組合物在4-30℃的范圍內(nèi)是穩(wěn)定的；在更優(yōu)選的實施方案中，該組合物在4-50℃的溫度范圍內(nèi)是穩(wěn)定的；在另一更優(yōu)選的實施方案中，組合物在4-125℃的范圍內(nèi)是穩(wěn)定的(包括高壓滅菌過程)。
優(yōu)選地，磷脂組合物貯存時穩(wěn)定期達兩年，更優(yōu)選至3年，特別優(yōu)選到5年?！胺€(wěn)定的”在本文中意味著至少75％，優(yōu)選至少80％，更優(yōu)選至少90％的未降解磷脂在上文所述的貯存期后存在于組合物中。
如上所述，本發(fā)明穩(wěn)定方法的一個特殊的優(yōu)點是得到的磷脂組合物在短期內(nèi)可承受寬的溫度范圍的能力。因此，為使需被高壓滅菌的磷脂組合物穩(wěn)定，優(yōu)選地在高壓滅菌前加入緩沖體系。
用于本發(fā)明方法或組合物中的緩沖劑優(yōu)選其分子式I為NR1R2R3I其中R1，R2和R3可以是相同的，也可以是不同的，每一個代表一個氫原子、一個糖殘基，一含1-6個碳原子的烷基(其可攜帶一個或多個羥基，巰基，羧基，磺酸，烷氯酰氨基，咪唑基，吲哚基或羥基取代的苯基)，一個有1-6個碳原子的烷基硫代和/或一個分子式為NR4R5的基團(其中R4和R5可以相同也可以不同，每一個代表一個氫原子，一個烴氧酰胺基或-C(＝NH)NH2基團或帶有1-6個碳原子的烷基)；或者R1、R3和R3中的任意兩個連同插入氮原子，代表為吡咯烷，嗎啉或哌啶環(huán)，它們可攜帶羥基、羧基、磺酸基或烴氧酰氨基基團。
因此，例如可用作緩沖劑的水溶性胺包括氨基醇和氨基糖。更優(yōu)選的胺包括[(三(羥甲基)]甲胺(表示為TRIS)，N，N-雙(2-羥乙基)-三(羥甲基)甲胺(表示為BIS-TRIS)，2-氨基-2-甲基丙烷-1，3-二醇(表示為AMPD)，TES，2-[4-(2-羥乙基)-1-哌嗪基]乙烷磺酸、表示為HEPES)，二乙醇胺，葡甲胺，三乙醇胺和氨。
根據(jù)本發(fā)明特別優(yōu)選使用的胺是TRIS，BIS-TRIS，TES和葡甲胺，其原因在于它們有利的生理上的可接受性和/或室溫下有利的pH值。
如上所表明的，包括在本發(fā)明組合物中的磷脂是基本飽和的磷脂。術(shù)語“基本飽和”是指磷脂的脂肪酸殘基是充分飽和的(亦即不含有碳碳雙鍵)或者其不飽和度很低，例如顯示的碘值不大于10，優(yōu)選不大于5。整體上達到類似不飽和度的一小部分不飽和磷脂也可存在于本發(fā)明的組合物中。磷脂可以是帶電的或者是中性的，而且可是在天然的，合成的或半合成的起始物(包括化學改性的基本飽和磷脂)。如上所述，優(yōu)選使用中性磷脂。
脂肪酸殘基中的碳原子數(shù)通常至少為14個，優(yōu)選至少16個。脂肪酸殘基中的碳原子數(shù)也優(yōu)選26或更少，例25或更少，優(yōu)選24或更少。
本發(fā)明有用的中性磷脂包括，例如，中性甘油磷脂，例如全氫化天然產(chǎn)物(如，大豆或蛋黃衍生的)或合成的卵磷脂，特別是半合成的二棕櫚?；蚜字?DPPC)或二硬脂?；蚜字?DSPC)，磷脂酰乙醇胺(PE)或磷脂酯乙醇胺-聚乙二醇(PE-PEG)，可使用多于一種的中性磷脂。
本發(fā)明中有用的帶電磷脂包括，例如，帶正電或負電的甘油磷脂。帶負電的磷脂包括，例如，磷脂酰絲氨酸，例如全氫化的天然產(chǎn)物(例如，大豆或蛋黃衍生的)或者半合成的磷脂酰絲氨酸，特別是半合成的二棕櫚?；字＝z氨酸(DPPS)或二硬脂酰基磷脂酰絲氨酸(DSPS)；磷脂酰甘油(PG)，例如全氫化的天然產(chǎn)物(如大豆或蛋黃衍生的)或半合成的磷脂酰甘油，特別是半合成或合成的二棕櫚?；字８视?DPPG)；或二硬脂?；字８视?DSPG)；磷脂酰肌醇，例如全氫化的天然產(chǎn)物(如大豆或蛋黃衍生的)或半合成的磷脂酰肌醇，特別是半合成的或者合成的二棕櫚?；字＜〈?DPPI)或二硬脂酰基磷脂酰肌醇(DSPI)；磷脂酸，例如，全氫化天然產(chǎn)物(如大豆或蛋黃衍生的)或半合成的磷脂酸，特別是半合成或合成的二棕櫚?；字?DPPA)或二硬脂酰磷脂酸(DSPA)。帶正電的磷脂包括，例如，磷脂酸和氨基醇的酯，例如二棕櫚酰磷脂酸的脂或二硬脂酰磷脂酸與羥乙二胺的脂。雖然這種帶電的磷脂通常單獨使用，但也可以使用多于一種的磷脂。
本發(fā)明的方法或本發(fā)明的組合物中所用的緩沖劑的濃度優(yōu)選在2mM-200mM的范圍內(nèi)，更優(yōu)選在2mM-100mM的范圍內(nèi)，特別優(yōu)選在2mM-20mM的范圍內(nèi)。
本發(fā)明組合物中，緩沖劑和脂類的摩爾比優(yōu)選在1∶60-2000∶1的范圍內(nèi)(例如1∶60-100∶1)，更優(yōu)選1∶60-1∶0.02，特別優(yōu)選1∶60-1∶0.1。對于一些診斷和其它醫(yī)療的應用，緩沖劑與脂類另一優(yōu)選的摩爾比是1∶50-1∶0.1，更優(yōu)選1∶20-1∶0.5，特別優(yōu)選1∶5-1∶1。
用于成像和醫(yī)療用途的本發(fā)明組合物中磷脂的濃度優(yōu)選在0.01mM-120mM的范圍內(nèi)，例如1mM-120mM。
本發(fā)明的磷脂組合物可以是通常遇到的任一配方類型，例如脂質(zhì)體，乳狀液，膠束，微(滴)乳狀液，脂類顆粒，脂類溶液和微氣泡的形式。對于每一特定配方類型，其可依傳統(tǒng)的又程序生產(chǎn)出來。
本發(fā)明的方法和磷脂組合物適用于各種用途，特別是當增強的穩(wěn)定性尤為重要時。穩(wěn)定的組合物可用于診斷、治療和化妝的用途以及特別提及的由磷脂組合物制成，可與對比介質(zhì)(X-射線、MRI、US和閃爍照相法)一起使用，還可用于治療癌癥，化療，霉菌感染的治療以及牛皮癬的醫(yī)治。
對于用作診斷成像對比介質(zhì)，本發(fā)明的脂質(zhì)組合物將包括一種對比有效材料，例如，在脂質(zhì)體內(nèi)腔中，附著于脂質(zhì)體膜的內(nèi)壁和外壁上或者包含在膜的內(nèi)部或者在分散脂質(zhì)體的液體介質(zhì)內(nèi)。通過對比有效材料，其意味著該種材料能夠提高感興趣的成像方式的對比度。對于傳統(tǒng)的成像方式，例如X-射線，MR，超聲波，磁斷層照相術(shù)，電子阻礙斷層照相術(shù)，閃爍照相術(shù)，SPECT，PET等，合適的對比有效材料的性質(zhì)是為人熟知的，例如氣體(如空氣，氙，氟化物等)，輻射發(fā)射體，順磁的，超順磁的，亞鐵磁和鐵磁材料(如順磁的過渡金屬或鑭系元素螯合物)，重原子(如原子序數(shù)47或更高)化合物，例如，碘化物(如三碘基苯基化合物)。當對比有效材料是氣態(tài)的(在周圍溫度或體溫條件下)，例如，空氣，氙，氦，氬，氫氣，一氧化二氮，氧氣，氮氣，二氧化碳，六氟化硫，甲烷，乙炔，氟化的低分子量(如C1-C7)的烴(優(yōu)選全氟化碳，如C2F6，C3F8，C4F10和C5F12)，含19F的氣體等時，其適宜包含在脂質(zhì)體膜內(nèi)。當對比有效材料是水溶性的(例如一種可溶的三碘苯基化合物或一種順磁的金屬螯合劑)時，優(yōu)選它在脂質(zhì)體的核心溶液中，且特別優(yōu)選也在懸浮介質(zhì)溶液中。
治療劑或化妝劑可類似的分散在脂質(zhì)體核心內(nèi)，在脂質(zhì)體膜上或內(nèi)部和/或在懸浮介質(zhì)中?？墒褂媚芷鹬|(zhì)體傳遞作用的常規(guī)治療劑或化妝劑。
對診斷組合物而言，例如對X-射線和MRI/核醫(yī)學來說，總脂類的濃度通常為5mg/ml-100mg/ml(例如20-100mg/ml，合適地至少為40或50mg/ml)，優(yōu)選10mg/ml-90mg/ml，更優(yōu)選10mg/ml-80mg/ml，其目的是要提高脂類中造影劑的封裝。然而，對超聲診斷組合物而言，總脂類的濃度范圍通常優(yōu)選為0.01mg/ml-20mg/ml，更優(yōu)選0.01mg/ml-10mg/ml(例如0.5mg/ml-10mg/ml)。
其中，試劑被封裝在磷脂中(特別是在脂質(zhì)體中)，優(yōu)選以等滲壓的溶液或等滲壓的懸浮體形式存在(與體內(nèi)的生理滲透壓有關)。為了得到等滲壓的溶液或懸浮體，該試劑通常以可提供等滲壓溶液的濃度溶解或懸浮在介質(zhì)中。其中單獨的該試劑不能提供一種等滲壓溶液，因為，例如，該試劑的溶解度不夠，這種情況下，可在介質(zhì)中加入其它常規(guī)的增補調(diào)節(jié)劑(例如無毒的水溶性物質(zhì))以形成等滲壓的溶液。這類物質(zhì)的實例包括鹽如氯化鈉；糖如甘露糖醇、葡萄糖、蔗糖、甘露糖、半乳糖、山梨醇以及相似物質(zhì)；和多元醇例如丙二醇、甘油及相似物質(zhì)。如果使用山梨醇，其濃度優(yōu)選1-500g/l，更優(yōu)選0.1-20g/100ml。如果使用甘油，其濃度優(yōu)選0.05-10g/100ml。如果磷脂組合物是脂質(zhì)體組合物時，所用鹽的量優(yōu)選盡可能小促進貯存和高壓滅菌過程中脂質(zhì)體的穩(wěn)定性。
通過上述提到的物質(zhì)得到的等滲壓溶液，也優(yōu)選包含在根據(jù)本發(fā)明的磷脂組合物中，在該組合物中未加入診斷、治療、化妝劑。
除上述提到的組分外，本發(fā)明磷脂組合物也可含有各種任選的組分。例如，維生素E(α-生育酚)和/或維生素E乙酸酯可作為抗氧化劑加入，相比于脂類的總量其量為0.01-2％(摩爾百分含量)，優(yōu)選0.1-1％(摩爾百分含量)。
以上所述的診斷、治療和化妝劑可通過本領域已知的技術(shù)加入到本發(fā)明的磷脂組合物中。
象上面已指出的那樣，在先技術(shù)描述了對磷脂水解的抑制是通過涉及抑制磷脂酶的間接機理進行的；很清楚，這樣的機理不能用于本發(fā)明中，因為有關的組合物中不含有磷脂酶。類似地，在采用不飽和磷脂的已有技術(shù)中觀察到的氧化/水解的降低對涉及飽和磷脂(本發(fā)明中不反對有微量的不飽和磷脂)的本發(fā)明是不重要的，本發(fā)明的方法看來證明了一種不同的抑制機理，該機理涉及對酸/堿催化的磷脂酯的通常的水解的抑制。
本發(fā)明方法涉及的準確的機理還沒有被充分理解，特別是貯存過程中增強的穩(wěn)定性方面。然而，眾所周知(實例參見《藥物科學雜志》82362-366(1993)和《磷脂手冊》(Marcel Debber Inc.，1993，323-324頁)，磷脂可水解形成游離脂肪酸和溶血磷脂，溶血磷脂可進一步水解給出對應的甘油膦化物和游離脂肪酸；最終一步水解通過磷酸酯首基的水解給出甘油磷酸。甘油和磷酸間酯鍵的水解似乎比較困難，因為未檢測到游離磷酸和甘油。非常明顯緩沖劑例如[三(羥甲基)]甲胺的使用，抑制了酸/堿催化的脂肪酯族的水解，已通過游離脂肪酸釋放的減少證實；也可抑制最終水解步驟。但是，也可能涉及了其它的水解機理。
以下是非限制性實例，用來進一步闡明本發(fā)明的方法和組合物。
實施例1組合物1ml包括氫化蛋卵磷酯32mg1，2-二棕櫚?；?sn-甘油基-3-磷乙醇胺4mg1，2-二棕棕?；?sn-甘油基-3-磷脂酸鈉4mg山梨醇50mg([三(羥甲基)]甲胺 1mg)注射用水 加至 1ml該組合物是將脂類與氯仿、甲醇和水(體積比為80∶20∶0.05)的混合物混合制備出。混合物在水浴(50℃)上加熱使脂類溶解，然后在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上加熱溶液(50℃)除去溶劑。使用標準技術(shù)通過均化作用和擠壓作用制備出脂質(zhì)體(包括添加山梨醇)。然后將此分散體分為兩部分，加入pH為7.4的三(羥甲基)甲胺/HCl于其中的一部分，得到的組合物裝入管形瓶中，高壓滅菌。試樣分別在30℃、40℃、50℃貯存一個月。高壓滅菌前、高壓滅菌后以及貯放后，分別測量游離脂肪酸的含量。
磷脂組合物中游離脂肪酸(FFA)的存在通過洗脫薄層色譜(TLC)板被檢測出來，該薄層色譜板上涂有0.25mm厚的硅膠60層，使用甲醇、氯仿和氨(體積比120∶70∶8)的混合物作為流動相。試樣用甲醇和二氯甲烷(體積比2∶1)的混合物以1∶10稀釋，并且將稀釋試樣的一份用到色譜板上。與該試樣所得點的強度和棕櫚酸標準樣相比，游離脂肪酸的量可半定量化，棕櫚酸標準樣對應1.25mg/ml-25mg/ml的濃度。這些點用硫酸銅噴顯劑在170℃下擴展大約1小時。
磷脂的降解，用游離脂肪酸測定(mg/ml)不含有[三(羥甲基)]甲胺含有[三(羥甲基)]甲胺30℃貯存一個月≤5.0 ≤2.540℃貯存一個月≤12.5 ≤5.0實施例2組合物1ml包括氫化蛋卵磷脂 36mg1，2-二棕櫚?；?sn-甘油基-3-甘油磷酸鈉 4mg山梨醇 50mg([三(羥甲基)]甲胺1mg)注射用水 加至 1ml制備方法如實施例1。
磷脂的降解，用游離脂肪酸測定(mg/ml)
不含有[三(羥甲基)]甲胺 含有[三(羥甲基)]甲胺30℃下貯存一個月≤1.25 ≤1.2540℃下貯存一個月≤2.5≤12.550℃下貯存一個月≤12.5 ≤2.5結(jié)果證明，含[三(羥甲基)]甲胺的試樣與不含[三(羥甲基)]甲胺的試樣相比，通過測定游離脂肪酸，磷脂的降解減少了。
根據(jù)本發(fā)明如實施例1的制備方法制備出的另外的組合物實施例如下所示實施例3卵磷脂20mg磷脂酰乙醇胺 20mg葡萄糖50mg[三(羥甲基)]甲胺 0.5mg注射用水 加至 1ml實施例 4磷脂酰甘油5mg蔗糖 100mg[三(羥甲基)]甲胺 1mg注射用水 加至 1ml實施例5PEG-磷脂酰乙醇胺 40mg山梨醇50mg[三(羥甲基)]甲胺 10mg注射用水 加至 1ml實施例6卵磷脂15mg豆油(soya oleum) 50mg甘油 74mg[三(羥甲基)]甲胺 1mg注射用水 加至 1ml實施例7作為證明本發(fā)明方法的另一實施例，下述組合物(公開在WO-95/26205)也如實施例1進行了測試。組合物1ml包括氫化蛋卵磷脂(H-PEC) 51mg氫化蛋磷脂酰絲氨酸鈉(H-ERSNa)5mgIodixanol400mg山梨醇 17mg([三(羥甲基)]甲胺1mg)注射用水加至 1ml如實施例1制備出組合物，但是在脂質(zhì)體形成前另外添加了Iodixanol和山梨醇的等滲壓溶液。
磷脂的降解，用游離脂肪酸測定(mg/ml)不含[三(羥甲基)]甲胺 含有[三(羥甲基)]甲胺30℃下貯存一個月≤2.5 ≤1.2540℃下貯存一個月≤5.0 ≤2.550℃下貯存一個月≤25.0 ≤12.5該實施例的結(jié)果驗證了本發(fā)明方法在穩(wěn)定另外含有造影劑的磷脂組合物的用途。
以下的實施例8-13公開了穩(wěn)定的脂質(zhì)體懸浮液的制備。該穩(wěn)定脂質(zhì)體懸浮液適于在超聲(實施例8-10)和磁性共振成像(實施例11-13)研究中用作對比介質(zhì)。除非特別聲明，比率和百分數(shù)比均指體積比，而脂類的比率是指重量比。如果實施例8-10中用到標注的19F的氟碳化物，那么這些組合物能被用作MR中的對比介質(zhì)。
實施例8氫化蛋卵磷脂(HEPC)和二棕櫚酰磷酸酯(10∶1)溶于氯仿-甲醇(2∶1)中，然后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去溶劑。將該脂類分散在純化的水中，然后將該分散液引入配有高速乳化器的氣密的玻璃反應器中。反應器中的氣體是帶有10％C5F12的空氣。產(chǎn)生微氣泡后，加入5mM的HEPE。
實施例9二硬脂酰卵磷脂(DSPC)，二棕櫚酰磷脂酸(DPPA)和聚乙二醇(PEG 4000)以25∶1∶2的比例在叔丁醇中溶解，然后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去溶劑。然后將脂類分散在純水中，接下來將該分散液引入一配有高速乳化器的氣密的玻璃反應器內(nèi)。反應器內(nèi)的氣體是C3F8。產(chǎn)生微氣泡后，加入三(羥甲基)甲胺8mm。
實施例10二棕櫚酰卵磷脂(DPPC)，二棕櫚酰磷脂酸(DPPA)和二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)(8∶1∶1)共同溶解于氯仿-甲醇-水(10∶20∶0.5)中，然后將溶劑用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除掉。接下來將該脂分散在純水中，把此分散液引入配有高速乳化器的氣密玻璃反應器中。反應器中的氣體是C4H10。產(chǎn)生微氣泡后，加入TES10mM。
實施例11干混氫化蛋卵磷脂(HEPC)和甲氧基聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(MPEG-DSPE)(9∶1)，然后將其溶于gadodiamide-caldiamide 0.5M溶液中，通過均化和擠壓制備出脂質(zhì)體。加入HEPE 8mM，將得到的產(chǎn)品用高壓滅菌法消毒。
實施例12氫化蛋卵磷脂(HEPC)和二棕櫚?；字８视?DPPG)(9∶1)在干混，然后將其分散于dimeglumine gadopentatate-meglumine diethlenetriaminepente-tate-葡甲胺0.5M溶液中，通過均化作用和擠壓制備出脂質(zhì)體。加入50mMTRIS，將得到的產(chǎn)品通過高壓滅菌消毒。
實施例13氫化蛋卵磷脂(HEPC)分散于gadodiamide 0.5M溶液中，通過均化和擠壓制備出脂質(zhì)體。加入TES 50mM，且將得到的產(chǎn)品高壓滅菌消毒。
實施例14組合物DSPA**10mgDSPG**10mgInhexol 390mg緩沖劑 足量注射用水 加至 1mL**二硬脂酰磷脂酸++二硬脂酰磷脂酰甘油(均為帶電的磷脂)該組合物如實施例1使用TRIS，HEPES或TES緩沖劑制備。
TES是1-[三(羥甲基)甲基]-2-氨乙烷磺酸。
選擇這些緩沖劑的濃度在產(chǎn)品中給出一致的離子強度。pH值和降解數(shù)據(jù)全陣列于表1和表2中。
表1游離脂肪酸(mg/mL
NMT＝不超過)
表2pH
實施例15組合物H-PEC 60mgIodixand 200mg山梨醇 37mg緩沖劑 足量注射用水 加至 1ml*氫化蛋卵磷脂(中性磷脂)制備了三種組合物進行對照。第一種組合物中的緩沖劑是TRIS、HEPES或TES，第二種組合物中不使用緩沖劑用NaOH/HCl調(diào)節(jié)pH值，第三種組合物中使用磷酸鹽緩沖劑或磷酸鹽/檸檬酸緩沖劑。組合物的制備參照實施例1。
高壓壓菌和40℃下貯存三個月后的磷脂的降解結(jié)果，用游離脂肪酸(mg/mL)測定，如下40℃下，緩沖劑高壓滅菌后 貯存三個月后TRIS mM，pH7.4 ≤0.25 ≤2.5磷酸鹽緩沖劑75mM，pH7.4≤1.0 ≤5.0(選擇這些緩沖劑的濃度，在產(chǎn)品中給出一致的離子強度)。pH值和降解數(shù)據(jù)全部列于表3和表4中。
表3游離脂肪酸(mg/mL)
表4pH
<p>因此，在三個月貯存期后，帶有TRIS和TRIS類似的緩沖劑(HEPES和TES作為例子)的樣品，與其它緩沖劑(磷酸鹽緩沖劑和磷酸鹽/檸檬酸緩沖劑))，以及沒有緩沖劑的溶液(其pH調(diào)節(jié)通過NaOH/HCl)相比，可以看出游離脂肪酸的量減少了，顯示磷脂的降解降低了。而且，高壓滅菌和貯存后，含TRIS，HEPES和TES的試樣(pH值降低了0.30個單位)與其它試樣(pH值降低了0.30-1.00個單位)相比，試樣中所觀察到的pH值的降低不明顯了。
實施例16組合物H-EPC 36mgMPEG-DSPE*4mgIodixanol 370mg緩沖劑足量注射用水 加至 1mL*甲氧基(聚乙二醇)二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(一種中性磷脂)。
制備中三類組合物進行對比。第一類中緩沖劑是TRIS，HEPES或TES，第二類中沒有緩沖劑，用NaOH/HCl調(diào)節(jié)pH值，第三類中緩沖劑是磷酸鹽緩沖劑或磷酸鹽/檸檬酸緩沖劑。依實施1制備組合物。
在高壓滅菌后和40℃和50℃下貯存一個月后，用游離脂肪酸測定(mg/mL)表示的磷脂的降解如下緩沖劑 高壓滅菌后 40℃貯存1個月后 50℃，貯存一個月后TES 172 mM≤0.25 -0.5 -1.0pH 7.4磷酸鹽緩沖劑 ≤1.0 ≤2.5≤5.074mM，pH 7.4磷酸鹽/檸檬酸 ≤2.5 ≤2.5≤5.067mM，pH 7.4選擇這些緩沖劑的濃度使其在產(chǎn)品中給出一致的離子強度。
pH值和降解數(shù)據(jù)全部列于表5和表6中。
表5游離脂肪酸(mg/mL)
權(quán)利要求
1.一種水性脂類組合物，其中包括一種或多種基本飽和的磷脂與一緩沖體系的結(jié)合體，該緩沖體系含有氨或水溶性胺，15℃時pH值小于或等于9.5，其成立的條件是其中的所述磷脂包含一帶電磷脂和中性磷脂的結(jié)合體，而且該組合物是一種脂質(zhì)體組合物，其中含有一種非離子性多羥基化的X-射線造影劑，然后所述的造影劑不以相同的濃度存在于脂質(zhì)體中和存在于周圍水性介質(zhì)中。
2.如權(quán)利要求1的一種組合物，其中含有脂質(zhì)體。
3.如權(quán)利要求1或2的一種組合物，其中含有一種對比有效材料。
4.如權(quán)利要求3的一種組合物，其中所述對比有效材料是一種產(chǎn)生回波材料。
5.如權(quán)利要求3的一種組合物，其中所述的對比有效材料是一種順磁材料。
6.如權(quán)利要求3的一種組合物，其中所述的對比有效材料是一種輻射發(fā)射材料。
7.如權(quán)利要求3的一種組合物，其中所述的對比有效材料是一種有機碘化物。
8.如權(quán)利要求3-7的任一種組合物，其中所述的對比有效材料存在于上述組合物的脂質(zhì)體中。
9.如權(quán)利要求1或2的一種組合物，其中含有一種治療劑或預防劑。
10.如權(quán)利要求1或2的一種組合物，其中含有一種化妝劑。
11.如權(quán)利要求1-10的任一種組合物，其中所述的緩沖體系包含TRIS、BIS-TRIS、AMPD、HEPES或TES。
12.如權(quán)利要求1-11的任一種組合物，其中所述的磷脂是中性磷脂。
13.一種使基本飽和的磷脂組合物穩(wěn)定的方法，該方法包含在一基本飽和的磷脂組合物中包含一緩沖體系，該緩沖體系含有氨或水溶性胺，15℃時其pH值小于或等于9.5，而不是添加所述的緩沖體系到一含有一種非離子性多羥基化的X-射線造影劑的脂質(zhì)體組合物中，并且所述造影劑同時以基本相同的濃度存在于脂質(zhì)體中和周圍水性介質(zhì)中。
14.如權(quán)利要求13中的一種方法，其中所述的緩沖體系是加入一已預制成的脂質(zhì)體組合物中。
15.如權(quán)利要求13的一種方法，其中所述的緩沖體系是摻入磷脂組合物中的，且在得到的含有混合物的磷脂和緩沖劑中產(chǎn)生脂質(zhì)體。
16.一種對比度提高的成像方法，其中在對象上使用了一種對比介質(zhì)，產(chǎn)生一幅該對象的影像，其特征在于所述使用的對比劑是如權(quán)利要求3-9中的任一組合物。
17.如權(quán)利要求16的一種方法，其中的影像由X-射線，超聲波或MR成像產(chǎn)生。
18.一種化妝處理方法，其中在對象上施用了一種化妝劑，其特征在于使用一種如權(quán)利要求10的組合物。
19.一種治療方法，其中在對象上施用了一種治療劑或預防劑，其特征在于使用如權(quán)利要求9的一種組合物。
全文摘要
通過加入一緩沖體系,提高了磷脂組合物的穩(wěn)定性。該緩沖體系包含氨或者水溶性胺,在15℃時其pH值小于或等于9.5。
文檔編號A61K8/00GK1202830SQ9619858
公開日1998年12月23日 申請日期1996年9月25日 優(yōu)先權(quán)日1995年9月27日
發(fā)明者凱里·戴維克, 哈拉爾德·杜格斯泰德, 羅爾德·斯科特威特, 喬·克萊弗尼斯, 喬尼·奧斯滕森, 谷內(nèi)清人 申請人:耐克麥德英梅金公司, 第一制藥株式會社