產(chǎn)品分類
最新文章
- 一種治療高膽紅素血癥的中藥制劑的制作方法
- 一種治療老年慢性支氣管炎的中藥組合物的制作方法
- 一種治療月經(jīng)先后無(wú)定期的中藥膠囊及其制備方法
- 一種治療月經(jīng)過少的中藥組合物的制作方法
- 一種多功能腳部按摩器的制造方法
- 幼兒給藥裝置制造方法
- 一組活血止痛跌打片的制作方法
- 一種新型喂藥器的制造方法
- 皮膚壓力測(cè)量壓瘡防控床的制作方法
- 一種可移動(dòng)立體碗碟籃的制作方法
- 電子發(fā)光故事打針固定器的制造方法
- 一種益肝靈分散片及其制備方法
- 一組穩(wěn)定生物活性物質(zhì)組合物及其制備方法
- 避光輸液器的制作方法
- 一種神經(jīng)外科上專用的智能化引流裝置制造方法
- 一種金字塔形理療裝置制造方法
- 一種治療動(dòng)脈粥樣硬化的中藥組合物的制作方法
- 一種治療糖尿病的中藥組合物的制作方法
- 一種治療頭痛的中藥的制作方法
- 一種用于透骨消痛的配方組成及其提取工藝的制作方法
一種含有破骨細(xì)胞形成抑制因子及多糖的復(fù)合物的制作方法
專利名稱:一種含有破骨細(xì)胞形成抑制因子及多糖的復(fù)合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及一種含有至少一種破骨細(xì)胞形成抑制因子(以下簡(jiǎn)稱為OCIF)、其類似物或其變異體和至少一種多糖或其衍生物的復(fù)合物,本發(fā)明也涉及產(chǎn)生該復(fù)合物的方法、治療或預(yù)防骨代謝疾病且含有該活性成分復(fù)合物的藥物、及所述復(fù)合物在治療或預(yù)防骨代謝疾病中的用途。
發(fā)明的技術(shù)背景骨骼中約含有活體中的總鈣99%的量,所以不僅在支持身體時(shí)起重要作用而且是機(jī)體中最大的鈣儲(chǔ)存器官。骨骼在保持鈣的動(dòng)態(tài)平衡中起重要的作用。眾所周知,在骨骼吸收中起重要作用的破骨細(xì)胞的活化將導(dǎo)致骨骼中的鈣過量流失到血液中,打破血液中的鈣的動(dòng)態(tài)平衡,這樣就會(huì)誘導(dǎo)血鈣過多。骨吸收升高及破骨細(xì)胞活化產(chǎn)生的血鈣過多可能是癌擴(kuò)散至骨中導(dǎo)致的不正常分泌的細(xì)胞因子所致[例如參見Jean-Jacques Body,Current and Future Directions InMedical TherapyHypercalcemia,CANCER Supplement,88(12),3054-3058(2000)]?;加邪┬匝}過高的病人預(yù)后常常不好,因此非常希望有一種有效的治療手段治療該疾病。
在風(fēng)濕病例如風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎及其類似病癥或者骨關(guān)節(jié)炎中,破骨細(xì)胞不正常的形成或活化是患這些病癥的病人的骨及關(guān)節(jié)的各種癥狀的主要原因[例如,參見E.Romas,M.T.Gillespie and T,J,Martin,類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中骨破壞中NF-KB配體和α腫瘤壞死因子的受體激活因子的作用,《骨》,30(2),340-346(2002)]。由于風(fēng)濕病例如風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或骨關(guān)節(jié)炎所導(dǎo)致的關(guān)節(jié)及骨疼痛非常強(qiáng)烈,嚴(yán)重影響患有這些疾病的病人的生活質(zhì)量。因此,高度期望發(fā)現(xiàn)一種治療這些疾病的方法。
破骨細(xì)胞已知在骨質(zhì)疏松癥中也起到一定作用。因?yàn)楦昶诤笈约に胤置诘臏p少或者老化,由破骨細(xì)胞輔助的骨吸收及成骨細(xì)胞輔助的骨形成之間的平衡逐漸向骨吸收傾斜,其結(jié)果是骨密度降低,如果骨密度降低非常嚴(yán)重就會(huì)導(dǎo)致骨質(zhì)疏松。當(dāng)具有高骨質(zhì)疏松風(fēng)險(xiǎn)的老年患者經(jīng)歷一次骨折,他們臥床不起的可能性是非常高的,由于全球人口的不斷老齡化,這已成為一個(gè)社會(huì)問題。[例如,參見Brumo Fautrel和Francis Guillemin,類風(fēng)濕疾病研究的代價(jià),Current Opinion in Rheumatology,14,121-126(2002)]。因此尋求一種可有效治療和預(yù)防骨質(zhì)疏松癥的方法變得極為迫切。
治療這些疾病的傳統(tǒng)的方法包括補(bǔ)充激素例如雌激素及使用藥劑例如二膦酸鹽或降鈣素來(lái)抑制破骨細(xì)胞的活性[例如,參見Mohammad M.Iqbal和Tanveer Sobhan,OsteoporosisA Review,Missouri Medicine,99(1),19-23(2002)]。然而,激素也有不希望有的副作用例如腫瘤形成的高風(fēng)險(xiǎn)性、誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜異位的發(fā)生及生殖器的非正常出血[例如,參見Joyce Penrose White和Judith S.Schilling,絕經(jīng)后的激素替代歷史前景和現(xiàn)代影響,對(duì)護(hù)理工作者有臨床優(yōu)勢(shì),4(5),277-285(2000)]。盡管已知二膦酸鹽很容易結(jié)合血液中的鈣且在骨中積累,一些研究者懷疑由此會(huì)將骨強(qiáng)度提高到何種程度。另外,同樣也有報(bào)道與其使用相關(guān)的腎功能損壞的危險(xiǎn)性[例如,參見Jonathan R.Green,Yves Seltenmeyer,Knut A.Jaeggi和Leo Wildler,新的有潛力的雙膦酸鹽在兩個(gè)短期大鼠模型中的腎忍受性方案,《藥理和毒理》80,225-230(1997)]。至于降鈣素,不幸的是使用其所獲得的骨密度的增加只是短暫的。同樣也有報(bào)道中止降鈣素的使用會(huì)導(dǎo)致所治療癥狀的回復(fù),而且是來(lái)自動(dòng)物而不是人的降鈣素其有效性在長(zhǎng)期治療后會(huì)降低,因?yàn)樵谌梭w中出現(xiàn)抗降鈣素的循環(huán)抗體[S.L.Porcel,J.A.Cumplido,B.Dela Hoz,M Cuevas和E.Losada,對(duì)降鈣素的敏感性,Allergologia et Immunopathologia,28(4),243-245(2000)]。
如上所述,破骨細(xì)胞在輔助骨吸收中起主要作用,而骨吸收是在血液中控制鈣濃度提升的關(guān)鍵因子。然而,確信上面所提到的任一種已知藥劑無(wú)一具有抑制破骨細(xì)胞形成的活性。結(jié)果是這些傳統(tǒng)藥劑無(wú)一適宜于骨代謝疾病的基礎(chǔ)治療,因?yàn)槠鋬H能夠治標(biāo)而不治本。
最近,OCIF已被證明是一種內(nèi)源蛋白,它可以抑制破骨細(xì)胞祖細(xì)胞分化為一種破骨細(xì)胞或者/和成熟破骨細(xì)胞的骨吸收活性(參見WO-A-96/26217及EP-A-0816380)。OCIF也稱為Osteoprotegerin(參見WO-A-97/23614)??紤]到上述骨代謝疾病例如血鈣過多,骨質(zhì)疏松癥及風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎都至少在某種程度上起因于骨吸收,希望通過使用OCIF(因?yàn)槠淇梢砸种破乒羌?xì)胞自身的形成和/或抑制成熟破骨細(xì)胞骨吸收活性的能力)對(duì)上述疾病進(jìn)行成功治療。然而,OCIF是一種堿性蛋白,其等電點(diǎn)大約在9左右,且其在給藥后在血液中流失的很快。因此解決該問題的一種辦法在WO-A-2000/24416及EP-A-1127578中已有報(bào)道,其中通過共給藥多糖例如肝素或硫酸右旋糖酐使OCIF在血液中滯留的時(shí)間(因此也使OCIF的效果)延長(zhǎng)至一定程度。然而結(jié)果達(dá)到滯留時(shí)間的延長(zhǎng)可能不足以使OCIF在血流中長(zhǎng)期滯留從而使其成為用于治療骨代謝疾病例如血鈣過高、骨質(zhì)疏松及關(guān)節(jié)炎的真正的候選藥劑,因此,需要OCIF在給藥后滯留在血流中的時(shí)間延長(zhǎng)的更好方法。
發(fā)明簡(jiǎn)述因此本發(fā)明的目的是提供一種包含有OCIF的制劑,該制劑能使OCIF在給藥后保留在血流中的時(shí)間延長(zhǎng),因此提供一種藥劑,其中OCIF在治療和預(yù)防由破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨代謝疾病例如血鈣過高、骨質(zhì)疏松癥及關(guān)節(jié)炎等中的效果增強(qiáng)并延長(zhǎng)。
本發(fā)明的其他的目的及優(yōu)點(diǎn)將會(huì)在隨后的說(shuō)明書中表明。
因此,本發(fā)明提供了一種復(fù)合物,其包含至少一種選自O(shè)CIF、其類似物及其變異體的物質(zhì),該物質(zhì)結(jié)合于至少一種選自多糖及其衍生物的物質(zhì)。
本發(fā)明也提供了一種延長(zhǎng)OCIF或其類似物或其變異體在給藥患者后在血流中滯留的時(shí)間的方法,該方法將至少一種所述的OCIF、其類似物或其變異體與至少一種多糖或其變異體復(fù)合。
本發(fā)明也提供了一種藥物組合物,它含有有效劑量的藥物活性成分及一種載體或稀釋劑,其中所述的藥物活性成分是一種復(fù)合物,該復(fù)合物含有至少一種選自O(shè)CIF、其類似物及其變異體的物質(zhì),該物質(zhì)結(jié)合有至少一種選自多糖及其衍生物的物質(zhì)。尤其是本發(fā)明提供了這樣一種藥物組合物,其可以治療或預(yù)防骨代謝疾病。
本發(fā)明也提供了一種治療或預(yù)防患者的骨代謝疾病的方法,該方法包括給予所述患者有效劑量的復(fù)合物,該復(fù)合物含有至少一種選自O(shè)CIF、其類似物及其變異體的物質(zhì),該物質(zhì)結(jié)合有至少一種選自多糖及其衍生物的物質(zhì)。
本發(fā)明也提供了一種復(fù)合物在制造治療或預(yù)防骨代謝疾病的藥劑中的用途,所述復(fù)合物含有至少一種選自O(shè)CIF、其類似物及其變異體的物質(zhì),該物質(zhì)結(jié)合至少一種選自多糖及其衍生物的物質(zhì)。
發(fā)明詳述我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在一定條件下溫育至少一種選自O(shè)CIF、其類似物和變異體的物質(zhì)和至少一種選自多糖及其衍生物的物質(zhì),結(jié)果形成一種復(fù)合物,其中所述一種或多種選自O(shè)CIF、其類似物及變異體的物質(zhì)結(jié)合所述至少一種選自多糖及其衍生物的物質(zhì),因此產(chǎn)生了一種試劑,其中所述OCIF或其類似物或變異體在治療和預(yù)防由破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨代謝疾病例如血鈣過高、骨質(zhì)疏松及關(guān)節(jié)炎等中的療效增強(qiáng)且延長(zhǎng)。這主要?dú)w功于這樣的事實(shí)與WO-A-2000/24416及EP-A-1127578中公開的OCIF及多糖的已知技術(shù)組合相比,OCIF或其類似物或變異體給藥后在血流中滯留的時(shí)間延長(zhǎng)了。
如上所述,本發(fā)明的復(fù)合物包含至少一種選自O(shè)CIF、其類似物及變異體的物質(zhì),該物質(zhì)結(jié)合至少一種選自多糖及其衍生物的物質(zhì)。在所述的復(fù)合物中,OCIF及多糖相互之間通過一個(gè)化學(xué)鍵例如共價(jià)鍵(例如形成席夫堿)、離子鍵、配位鍵或非化學(xué)鍵例如疏水性相互作用、氫鍵、靜電相互作用或親和力進(jìn)行結(jié)合。
本發(fā)明所用到的OCIF、其類似物或變異體可以是天然型也可以是重組型,且其起源并不特別限制。天然型的OCIF意指從獲自人或非人動(dòng)物的器官、體液、細(xì)胞培養(yǎng)物、或培養(yǎng)基中抽提、純化和/或分離而作為天然產(chǎn)生的蛋白獲取的OCIF。重組型的OCIF、其類似物或變異體是一種通過從通常用于這類技術(shù)中的寄主例如已經(jīng)使用含有編碼OCIF、其類似物或變異體的多聚核苷酸的載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化的原核寄主細(xì)胞(例如大腸桿菌)或真核細(xì)胞(例如人或非人細(xì)胞系)中抽提、純化和/或分離所述蛋白得到的重組蛋白[例如,參見公開于EP-A-0816380(WO-A-9626217)及WO-A-97/23614的重組技術(shù)]。
本發(fā)明所用到的OCIF、其類似物及其變異體的起源并不特別限制,可以來(lái)自人或非人動(dòng)物。優(yōu)選是其可以來(lái)自哺乳動(dòng)物例如人、大鼠、小鼠、兔子、狗、貓、牛、豬、綿羊或山羊或鳥類例如禽、鵝、雞或火雞,更為優(yōu)選的是其來(lái)自哺乳動(dòng)物,最為優(yōu)選的是其來(lái)自人。
本發(fā)明所用到的OCIF或其類似物可以是單體類型的OCIF(例如,在人體中在非還原條件下的SDS-PAGE測(cè)量的單體的分子量大約為60000)或者二聚體類型(例如,在人體中在非還原條件下SDS-PAGE測(cè)量的分子量大約為120000)[參見EP-A-0816380(WO-A-96/26217)]。
眾所周知OCIF在細(xì)胞中是以一種在氨基末端具有一個(gè)信號(hào)肽的多肽形式翻譯的,然后通過涉及到移去所述信號(hào)肽的加工步驟而成熟[例如,參見公開于EP-A-0816380(WO-A-96/26217)及WO-A-97/23614的重組方法]。本發(fā)明所用到的OCIF、其類似物或其變異體同時(shí)包括具有信號(hào)肽的多肽及其成熟形式。優(yōu)選的實(shí)施例包括具有所列的序列表SEQ.ID.NO.1的氨基酸-21至+380的含有信號(hào)肽的OCIF及具有所列的序列表SEQ.ID.NO.1的氨基酸+1至+380的不含信號(hào)肽的成熟的OCIF。在所有這些中,成熟OCIF尤其推薦。
眾所周知,當(dāng)在寄主細(xì)胞中尤其是當(dāng)在一種原核寄主細(xì)胞例如大腸桿菌中作為重組蛋白表達(dá)時(shí),甲硫氨酸可以被加到這種成熟形式的OCIF、其類似物或變異體中。這可以通過加入核苷酸三聯(lián)密碼ATG(AUG)至編碼OCIF、其類似物或變異體的成熟形式的多聚核苷酸的5’末端,然后將所得到的多聚核苷酸插入到合適的表達(dá)載體中而獲得。這樣便可以由被所述重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的合適宿主細(xì)胞表達(dá)在氨基末端具有甲硫氨酸的所需成熟蛋白。此外,一個(gè)或多個(gè)氨基酸可以被加入到所述蛋白的氨基末端甲硫氨酸的下一位置,其通過在加到編碼OCIF、其類似物或其變異體的成熟形式的多聚核苷酸的5’端的ATG三聯(lián)密碼的下一位置增加額外的核苷酸三聯(lián)密碼而完成。
在本發(fā)明中,OCIF類似物意指為一個(gè)天然存在于人體或上所列舉的非人動(dòng)物細(xì)胞、體液、和/或器官中的多聚核苷酸所編碼的蛋白質(zhì)。這樣的類似物的具體的優(yōu)選實(shí)施例包括OCIF2、OCIF3、OCIF4及OCIF5[參見EP-A-0816380(WO96/26217)]。這樣的OCIF類似物或其活性片段可以通過下述方法獲得從一個(gè)人體或非人動(dòng)物的體液、組織、器官或細(xì)胞中抽提出RNA;使用反轉(zhuǎn)錄酶合成與所述RNA互補(bǔ)的cDNA的第一條鏈,然后以第一條鏈作為模板使用DNA聚合酶合成所述cDNA的第二條鏈;如此獲得的雙鏈cDNA插入進(jìn)一個(gè)適當(dāng)?shù)?、常?guī)使用的表達(dá)載體;然后將該表達(dá)載體轉(zhuǎn)化進(jìn)入一個(gè)適當(dāng)?shù)某R?guī)使用的寄主細(xì)胞;然后使用雜交技術(shù)例如使用OCIF cDNA或其片段作為探針在嚴(yán)格條件下進(jìn)行噬斑雜交或噬菌體雜交,篩選產(chǎn)生目的多肽的寄主(參見EP-A-0816380(WO-A-96/26217))];最后經(jīng)過常規(guī)的技術(shù)由如此獲得的寄主細(xì)胞表達(dá)需要的OCIF類似物。
在本發(fā)明中,OCIF變異體意指一個(gè)蛋白,其具有一個(gè)氨基酸序列,其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基已被替代、刪除、加入或插入一個(gè)OCIF或其類似物的氨基酸序列,但依然具有至少部分OCIF活性。這樣的OCIF變異體例如,可以通過下述方法獲得使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法(以下簡(jiǎn)稱PCR)、基因重組法或使用核酸內(nèi)切酶或核酸外切酶例如限制性酶的核酸酶消化法,在一個(gè)編碼OCIF或其類似物的核苷酸序列中替代、刪除、增加和/或插入一個(gè)核苷酸或多個(gè)核苷酸;利用已經(jīng)插入了得到的編碼目的OCIF變異體的核苷酸的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化一個(gè)真核寄主細(xì)胞例如一個(gè)動(dòng)物細(xì)胞或一個(gè)原核寄主細(xì)胞例如大腸桿菌;然后按照本領(lǐng)域技術(shù)人員所普遍已知的技術(shù)從所述的轉(zhuǎn)化寄主的細(xì)胞培養(yǎng)物產(chǎn)生的包含蛋白部分中抽提、純化和/或分離需要的多肽。
已知氨基酸序列的相當(dāng)一部分片段已經(jīng)從OCIF多肽的羧基末端刪除的OCIF的截短形式,也保留了至少部分OCIF活性[例如,參見EP-A-0816380(WO-A-96/26217)和WO-A-97/23614]。這些截短的保留了完整OCIF多肽的至少部分活性的OCIF,同樣包括在本發(fā)明的OCIF變異體中。
更進(jìn)一步,OCIF或其截短形式與一個(gè)免疫球蛋白區(qū)域例如Fc區(qū)域融合體也是已知的(例如,一個(gè)融合多肽,其中人類IgG的Fc區(qū)域附著于OCIF的羧基末端),其至少具有部分完整OCIF多肽的活性(參見WO-A-97/26314),這樣的融合蛋白同樣包括在本發(fā)明的OCIF變異體中。
同樣也可以看到,OCIF或其類似物或其變異體可被化學(xué)修飾且依然保持有效的活性,且在某些情況下,還可以表現(xiàn)出一些優(yōu)勢(shì),例如穩(wěn)定性的增加或免疫原性的減少。這些化學(xué)修飾可以包括在OCIF或其類似物或其變異體分子的一個(gè)單一位點(diǎn)或多個(gè)位點(diǎn)衍生化。例如,已經(jīng)顯示OCIF及其變異體(衍生物),例如截短的形式,可以使用一個(gè)或多個(gè)水溶性聚合物例如聚乙二醇、乙二醇/丙二醇共聚體、羧甲基纖維素及聚乙烯醇進(jìn)行化學(xué)修飾,其結(jié)果表現(xiàn)出生物學(xué)活性提高(例如,參見WO-A-9726314)。這些OCIF或其類似物或其變異體的化學(xué)修飾類型同樣包括在本發(fā)明的OCIF變異體中。
已知的適宜于制備本發(fā)明的復(fù)合物的OCIF衍生物的例子包括OCIF-C19S、OCIF-C20S、OCIF-C21S、OCIF-C22S、OCIF-C23S、OCIF-DCR1、OCIF-DCR2、OCIF-DCR3、OCIF-DCR4、OCIF-DDD1,OCIF-DDD2、OCIF-CL、OCIF-CC、OCIF-CDD2、OCIF-CDD1、OCIF-CCR4、OCIF-CCR3、OCIF-CBst、OCIF-CSph、OCOIF-CBsp、OCIF-CPst[參見EP-A-0816380(WO-A-96/26217)]、muOPG[22-401]-Fc、muOPG[22-194]-Fc、muOPG[22-185]-Fc、muOPG[22-180]-Fc、muOPG[22-401]、muOPG[22-401]C195、muOPG[22-401]C202、muOPG[22-401]C277、muOPG[22-401]C319、muOPG[22-401]C400、muOPG[22-185]、muOPG[22-194]、muOPG[22-200]、muOPG[22-212]、muOPG[22-293]、muOPG[22-355]、huOPG[22-401]-Fc、huOPG[22-201]-Fc、huOPG[22-401]-Fc P26A、huOPG[22-401]-Fc Y28F、huOPG[22-401]、huOPG[27-401]-Fc、huOPG[29-401]-Fc、huOPG[32-401]-Fc、muOPG met[22-194]、muOPG met[22-194]5k PEG、muOPG met[22-194]20k PEG、huOPG met[22-194]P25A、huOPG met[22-194]P25A 5k PEG、huOPG met[22-194]P25A 20k PEG、huOPG met[22-194]P25A 31k PEG、huOPG met[22-194]P25A 57k PEG、huOPG met[22-194]P25A 12k PEG、huOPG met[22-194]P25A 20k支鏈PEG、huOPG met[22-194]P25A 8k pEG二聚體、huOPG met[22-194]P25A二硫鍵交聯(lián)(WO-A-97/23614)、OPG[22-194]-Fc、OPG[22-201]-Fc、OPG[22-194]-FcΔC、OPG[22-201]-FcΔC、OPG[22-194]-FcG10、metFcΔC-OPG[22-194](WO-A-2001/17543)、OPG[22-194]-FcΔC、OPG[22-194]-FcG10、FcΔC-OPG[22-194]、metFcΔC-OPG[22-194]、metFcΔC-22-194、OPG[22-194]-Fc、OPG[22-194]-FcΔC、metOPG[22-194]、metOPG[22-201]、OPG[22-293]、OPG[22-401]及metFcΔC-22-194(WO-A-2001/18203)。
在這些中,優(yōu)選的實(shí)施例包括OCIF-C19S、OCIF-C20S、OCIF-C21S、OCIF-C22S、OCIF-C23S、OCIF-DCR1、OCIF-DCR2、OCIF-DCR3、OCIF-DCR4、OCIF-DDD1、OCIF-DDD2、OCIF-CL、OCIOCIF-CCR4、OCIF-CCR3、OCIF-CBst、OCIF-CSph、OCIF-CBsp、OCIF-CPst、MuOPG[22-401]-Fc、muOPG[22-194]-Fc、muOPG[22-185]-Fc、muOPG[22-401]C195、muOPG[22-401]C202、muOPG[22-401]C319、muOPG[22-401]C400、muOPG[22-194]、muOPG[22-200]、muOPG[22-293]、muOPG[22-355]、huOPG[22-401]-Fc、huOPG[22-201]-Fc、huOPG[22-401]-FcP26A、huOPG[22-401]-Fc Y28F、uOPG[22-401]、huOPG[27-401]-Fc、huOPG[29-401]-Fc、huOPG[32-401]-Fc、muOPG met[22-194]5k PEG、muOPG met[22-194]20k PEG、huOPG met[22-194]P25A 5k PEG、huOPG met[22-194]P25A 20k PEG、huOPGmet[22-194]P25A 31k PEG、huOPG met[22-194]P25A 57k PEG、huOPG met[22-194]P25A 12k PEG、huOPG met[22-194]P25A 20k支鏈PEG、huOPG met[22-194]P25A 8k PEG二聚體、huOPG met[22-194]P25A二硫鍵交聯(lián)、OPG[22-194]-Fc、OPG[22-201]-Fc、OPG[22-194]-FcΔC、OPG[22-201]-FcΔC、OPG[22-194]-FcG10、metFcΔC-OPG[22-194]、OPG[22-194]-FcΔC、OPG[22-194]-FcG10、FcΔC-OPG[22-194]、metFcΔC-OPG[22-194]、metFcΔC-22-194、OPG[22-194]-Fc、OPG[22-194]-FcΔC、metOPG[22-194]、metOPG[22-201]、OPG[22-293]、OPG[22-401]及metFcΔC-22-194。
本發(fā)明所述的OCIF或其類似物或其變異體可能包含一個(gè)糖鏈作為分子的一部分。任一天然產(chǎn)生的OCIF或其類似物,或重組OCIF或其類似物或變異體,都可以包含一個(gè)糖鏈,其在翻譯后粘附于OCIF或其類似物或其變異體。包含有一個(gè)糖鏈的天然產(chǎn)生的OCIF或其類似物可通過傳統(tǒng)技術(shù)從獲自人或非人動(dòng)物的細(xì)胞培養(yǎng)物、組織、器官、體液或細(xì)胞系得到。正如上述或舉例所述,含有一個(gè)糖鏈的重組OCIF或其類似物或變異體可以從使用一個(gè)含有編碼任一OCIF或其類似物或變異體的核苷酸序列的載體轉(zhuǎn)化的真核寄主細(xì)胞的培養(yǎng)物中得到??梢杂玫降倪m宜寄主細(xì)胞能夠翻譯后修飾OCIF或其類似物或變異體以至于粘附在糖鏈上,這樣的寄主的例子包括CHO細(xì)胞及COS細(xì)胞[Yasuda,H.等人,Endocrinology,139,1329-1337(1998)]。含有這樣一個(gè)糖鏈的OCIF或其類似物或變異體適用于形成本發(fā)明所述的復(fù)合物。
在另一方面,如果希望產(chǎn)生的重組OCIF或其類似物或變異體不含有翻譯后修飾所加入的糖鏈,那么優(yōu)選的寄主細(xì)胞是原核細(xì)胞例如大腸桿菌。
形成本發(fā)明復(fù)合物所用的多糖是一個(gè)多聚體(聚糖),其由兩個(gè)或多個(gè)單糖的糖苷鍵合產(chǎn)生,優(yōu)選地是一個(gè)至少含有兩種不同類型單糖的雜多糖。任一多糖,不管是天然產(chǎn)生的或人工合成的都可用于本發(fā)明所述的復(fù)合物。
在本發(fā)明中,多糖的衍生物指的是這樣一種多糖至少一部分所述多糖分子為一個(gè)或多個(gè)非糖分子和/或殘基所取代。優(yōu)選的衍生物包括多糖的酸酯尤其是多糖的硫酸酯。
適用于生產(chǎn)本發(fā)明所述復(fù)合物的天然多糖的例子包括透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素、酸性皮膚素、酸性乙酰肝素、酸性角質(zhì)素、角叉膠、果膠及肝素。適用于生產(chǎn)本發(fā)明所述復(fù)合物的合成多糖的例子包括右旋糖酐,而適宜的合成多糖衍生物的例子包括硫酸右旋糖酐。在多糖及其衍生物中,最為適用于生產(chǎn)本發(fā)明所述復(fù)合物的是硫酸右旋糖酐。
在本發(fā)明中,多糖或其衍生物例如硫酸右旋糖酐包括其鹽。最適宜的硫酸右旋糖酐鹽是其鈉鹽。硫酸右旋糖酐鈉鹽的例子包括硫酸右旋糖酐鈉鹽硫5(以下簡(jiǎn)稱DS5為Meito Sangyo公司所生產(chǎn)),和硫酸右旋糖酐鈉鹽5000及硫酸右旋糖酐鈉鹽10000(其均為Wako Pure化學(xué)公司所生產(chǎn))。
硫酸右旋糖酐的分子量如下進(jìn)行測(cè)定1)右旋糖酐分子量的測(cè)定右旋糖酐的分子量可以按照下述的Sato’s公式進(jìn)行計(jì)算[例如,參見日本藥學(xué)手冊(cè),第13修正版,為Hirokawashoten所出版(1998),有關(guān)右旋糖酐40的內(nèi)容],其基于所述右旋糖酐極限粘度的測(cè)量。
極限粘度=9.00×10-4×分子量0.502)硫含量的測(cè)量相關(guān)的硫酸右旋糖酐的硫含量可以通過本領(lǐng)域已知技術(shù)以重量百分比進(jìn)行測(cè)量,例如在日本藥物手冊(cè)[第14版,Jihou出版(2001)]中有關(guān)硫酸右旋糖酐鈉鹽硫5的內(nèi)容中所述的方法。
盡管構(gòu)成右旋糖酐單元的葡萄糖的分子量為180,右旋糖酐分子中的葡萄糖單元的實(shí)際分子量為162,該值是通過從180中減去水的分子量而得到的,因?yàn)樵谟倚囚肿又朽徑钠咸烟菃卧嗷ブg通過α-1,6糖苷鍵連接。一個(gè)氫原子為硫酸鈉基團(tuán)(SO3Na一克當(dāng)量為103)所取代,在硫酸右旋糖酐的每一葡萄糖單元中其以這種方式取代。利用該信息,硫酸右旋糖酐分子的取代程度(以下簡(jiǎn)稱取代度)可以依下述公式確定硫含量(重量百分比)=[32×取代度/(162+102×取代度)]×1003)硫酸右旋糖酐分子量的計(jì)算如上所述,因?yàn)橛倚囚溨衅咸烟菃卧膶?shí)際分子量為162,所以硫酸右旋糖酐的分子量可以使用下式公式從這一數(shù)據(jù)和2)中所確定的取代度計(jì)算硫酸右旋糖酐分子量=右旋糖酐分子量×(162+102×取代度)/162已知多糖表現(xiàn)出分子量的分布,例如每一不同類型的硫酸右旋糖酐表現(xiàn)出一確定的分子量分布。形成本發(fā)明所述復(fù)合物所用到的多糖的分子量是以平均分子量的形式給出的。本發(fā)明所用到的多糖的平均分子量并不以任何形式限制,本發(fā)明的最適宜的多糖衍生物即硫酸右旋糖酐的平均分子量的范圍,一般為1500~12000,且最好是1800~6000。DS5的分子量(平均±標(biāo)準(zhǔn)方差)大約為1950±70(n=7)。DS5的硫取代度(平均±標(biāo)準(zhǔn)方差),如上計(jì)算,大約為0.32±0.01(n=7)。硫酸右旋糖酐鈉鹽5000及硫酸右旋糖酐鈉鹽10000的平均分子量分別大約為5000及10000。在形成本發(fā)明所述復(fù)合物中所用到的多糖可以或不在使用前純化和/或分級(jí)分離。在本發(fā)明中,多糖或其衍生物不包括粘附在重組OCIF或其類似物或變異體或翻譯后和/或內(nèi)源地于人或非人動(dòng)物細(xì)胞或組織或機(jī)體中天然產(chǎn)生的OCIF或其類似物或變異體上的任何糖鏈。
在本發(fā)明所述的復(fù)合物中,選自O(shè)CIF、其類似物及其變異體的物質(zhì)與選自多糖或其衍生物的物質(zhì)的分子比例將根據(jù)各種因素有所變化,包括所述復(fù)合物中各種成分的特征和該復(fù)合物制備的條件。在本發(fā)明所述的復(fù)合物中,選自O(shè)CIF、其類似物及其變異體的物質(zhì)與選自多糖及其衍生物的物質(zhì)的分子比例并沒有特別限制。在本發(fā)明優(yōu)選的復(fù)合物中,包括選自O(shè)CIF、其類似物及其變異體的物質(zhì)及硫酸右旋糖酐,其中所述選自O(shè)CIF、其類似物及其變異體的物質(zhì)硫酸右旋糖酐的分子比例是從1∶1至1∶10,更為優(yōu)選的分子比例為1∶1至1∶8,更為優(yōu)選的分子比例為1∶1至1∶5,最為優(yōu)選的分子比例為1∶1.1至1∶4.5。
正如上面已經(jīng)提到的那樣,OCIF或其類似物或變異體可以以單體或二聚體的形式存在,這樣本發(fā)明所述復(fù)合物中所含的OCIF或其類似物或變異體可以是均二聚體或雜二聚體,或其可以是均低聚體、雜低聚體、均聚合物或含有兩個(gè)以上的OCIF或其類似物或其變異體的單體單元的雜聚合物(例如,參見US6369027)。按照本發(fā)明在含有OCIF、其類似物或變異體及多糖或其衍生物的復(fù)合物中,選自O(shè)CIF、其類似物或其變異體的物質(zhì)與選自多糖及其衍生物的物質(zhì)的分子比例計(jì)算為每單體單元的OCIF、其類似物或其變異體的多糖或其衍生物的分子的數(shù)量。
本發(fā)明復(fù)合物中多糖或其衍生物的分子的數(shù)量?jī)?yōu)選可以如下進(jìn)行確定所測(cè)試的復(fù)合物[指定為(X)]及僅含有未復(fù)合的游離OCIF或其類似物或變異體的參考樣品[指定為(Y)]中中性糖含量使用苯酚硫酸方法進(jìn)行定量(在本申請(qǐng)其他部分進(jìn)行詳細(xì)描述)。然后所測(cè)試的復(fù)合物中結(jié)合至OCIF或其衍生物或變異體中的多糖或其衍生物的數(shù)量通過從(X)中減去(Y)而確定。使用這樣得到的數(shù)據(jù),結(jié)合至OCIF或其類似物或變異體的多糖或其衍生物的分子數(shù)量按照下述(I)或(II)進(jìn)行計(jì)算(I)結(jié)合至OCIF或其類似物或變異體的多糖或其衍生物的數(shù)量除以所述多糖或其衍生物的平均分子量。結(jié)果的數(shù)據(jù)代表了在測(cè)試復(fù)合物中多糖或衍生物的總的分子數(shù)目。
(II)結(jié)合至OCIF或其類似物或變異體的多糖或其衍生物的數(shù)量除以在所述復(fù)合物中所述的OCIF或其類似物或變異體的數(shù)量(mg)。得到的數(shù)據(jù)是在所述復(fù)合體中每1mg OCIF或其類似物或變異體中的多糖或其衍生物的數(shù)量,該數(shù)據(jù)再用于以所述多糖或其衍生物的平均分子量及所述OCIF或其類似物或變異體的分子量為基礎(chǔ)計(jì)算每一分子OCIF或其類似物或變異體中的多糖或其衍生物中的分子數(shù)目[例如參照下述實(shí)施例4(d)]。
本發(fā)明復(fù)合物中OCIF或其類似物或變異體的分子數(shù)量?jī)?yōu)選可以使用免疫測(cè)試技術(shù)例如本申請(qǐng)其他部分所述的技術(shù)來(lái)確定。
本發(fā)明所述的復(fù)合物的一個(gè)可以用于鑒定它們的優(yōu)選特征是其對(duì)肝素的親和力。肝素是含有D-葡萄糖胺、D-葡萄糖醛酸及D-艾杜糖醛酸的多糖,其部分或全部被乙酰基或硫酸基衍生化。本發(fā)明的復(fù)合物的一個(gè)優(yōu)選特征是所述OCIF或其類似物或變異體的復(fù)合物對(duì)肝素的吸附強(qiáng)度低于游離的未復(fù)合的OCIF或其類似物或變異體的吸附強(qiáng)度。吸附程度可以用裝填有已固定了肝素(例如獲自牛腸粘膜的肝素)的高度交聯(lián)的瓊脂糖珠的柱子來(lái)進(jìn)行確定。適宜的這類柱子包括Hitrap肝素HP柱子、Hiprep16/10肝素及肝素瓊脂糖凝膠(均獲自Amersham Pharmacia)。復(fù)合物的吸附強(qiáng)度(親和性)可以按照本領(lǐng)域技術(shù)人員所普遍已知的用于確定蛋白與多糖的親和性的任何適當(dāng)技術(shù)確定。優(yōu)選的是,吸附程度可以通過比較在低離子強(qiáng)度下結(jié)合至肝素柱但是在高離子強(qiáng)度下從所述柱中洗脫的復(fù)合物的數(shù)量與在低離子強(qiáng)度下并不結(jié)合于肝素柱的復(fù)合物的數(shù)量(離子強(qiáng)度可以使用強(qiáng)酸鹽例如氯化鈉進(jìn)行調(diào)節(jié))來(lái)確定。這樣,一般來(lái)說(shuō),復(fù)合物對(duì)肝素的吸附程度可以通過下述方法確定(a)載有已經(jīng)固定了肝素的支持物如交聯(lián)的瓊脂糖小珠的柱用相對(duì)低離子強(qiáng)度的緩沖液平衡(例如使用含有0.1-0.8M氯化鈉的磷酸鈉緩沖液)。
(b)將進(jìn)行測(cè)試的本發(fā)明的復(fù)合物溶于(a)中使用的相同的低離子強(qiáng)度緩沖液中,并加到柱中,收集首次洗出液(A部分)。
(c)然后使用使用于步驟(a)的相同的低離子強(qiáng)度緩沖液進(jìn)一步洗滌柱子并收集第二次洗出液(B部分)。
(d)然后使用具有相對(duì)高離子強(qiáng)度的緩沖液(例如,含有1.0-2.0M氯化鈉的磷酸鈉緩沖液)洗滌柱子,收集第三次洗出液(C部分)。
(e)然后確定A、B、C各部分中所含的復(fù)合物的數(shù)量[分別指定為(a)、(b)、(c)](例如通過免疫測(cè)定法)。
(f)復(fù)合物對(duì)肝素的吸附程度按照下列公式確定(g)吸附程度=(c)/(a)+(b)+(c)復(fù)合物與柱子的結(jié)合力越大,(c)值就越高(正如其僅能使用具有相對(duì)高離子強(qiáng)度的洗脫液從柱子中移去),因而吸附程度也越高,使用上述公式計(jì)算的本發(fā)明復(fù)合物的吸附程度可因肝素柱的類型及進(jìn)行測(cè)定的條件而在一定程度范圍變化。然而,游離的未復(fù)合的OCIF的吸附程度總是大約為1.0,而本發(fā)明的OCIF復(fù)合物的吸附程度低于1.0,這樣就證明了含有本發(fā)明所述的OCIF或其類似物或變異體的復(fù)合物與肝素結(jié)合的強(qiáng)度要弱于游離的未復(fù)合的OCIF或其類似物或變異體的結(jié)合強(qiáng)度(例如,使用豬肝素固定在瓊脂糖小珠上,例如一個(gè)HiTrap肝素HP柱,使用含有0.7M氯化鈉的10mM磷酸鈉緩沖液進(jìn)行首次及第二次洗脫,使用含有2.0M氯化鈉的10mM磷酸納緩沖液進(jìn)行第三次洗脫,含有OCIF或其類似物或變異體的本發(fā)明復(fù)合物的吸附強(qiáng)度并不高于0.7,最好不高于0.6,尤其是不要高于0.5)。
可用于鑒定本發(fā)明復(fù)合物的另一個(gè)優(yōu)選特征是使用免疫測(cè)試技術(shù)(例如ELSLA)測(cè)量的所述復(fù)合物中的OCIF或其類似物或變異體的分子數(shù)目與使用測(cè)量所述復(fù)合物中蛋白總量的技術(shù)[例如,Lowry’s方法Lowry,O.H.等人,生物化學(xué)雜志193,265-275(1951);吸光值(λ280nm)銀染色或BCA方法]測(cè)量的所述復(fù)合物中OCIF或其類似物或變異體的分子數(shù)目的比例。
測(cè)量在所述復(fù)合物中的OCIF或其類似物或變異體的分子數(shù)目可以利用免疫測(cè)試技術(shù),例如ELISA來(lái)確定,用于與固定相結(jié)合的抗體及用報(bào)道酶例如ELISA中的過氧化酶標(biāo)記的抗體可以是針對(duì)相關(guān)OCIF或其類似物或變異體的任何適用于此目的的抗體,例如適宜于與固相結(jié)合的抗體包括自可產(chǎn)生抗體OI-26的雜交瘤培養(yǎng)物(FERM BP-6421)純化的OI-26及純化自可產(chǎn)生抗體OI-19的雜交瘤培養(yǎng)物(FERM BP-6420)的OI-19,而在流動(dòng)相中適宜于用作用報(bào)道酶標(biāo)記的抗體包括用過氧化酶標(biāo)記的抗人OCIF單克隆抗體OI-4,它純化自可產(chǎn)生抗體OI-4的雜交瘤培養(yǎng)物(FERM BP-6419)。測(cè)量復(fù)合物中的OCIF或其類似物或變異體的分子數(shù)目的一個(gè)典型的程序如下(a)用游離的未復(fù)合的OCIF的已知濃度制作校準(zhǔn)曲線;(b)在相關(guān)復(fù)合物上進(jìn)行ELISA且用校準(zhǔn)曲線確定OCIF的濃度;(c)使用(b)中所獲得的信息及OCIF單體的分子量計(jì)算所測(cè)試復(fù)合物中OCIF的分子數(shù)目。
所述復(fù)合物中的OCIF或其類似物或變異體的分子數(shù)目可以使用測(cè)量所述復(fù)合物中蛋白總量的技術(shù)來(lái)測(cè)定,這一數(shù)目也可以例如用Lowry方法進(jìn)行測(cè)量,一個(gè)典型的程序如下(a)用牛血清白蛋白的已知濃度制作校準(zhǔn)曲線;(b)用Lowry方法確定所測(cè)試復(fù)合物中的總蛋白濃度,使用校準(zhǔn)曲線確定OCIF的濃度;(c)使用(b)中所獲得的信息及OCIF單體的分子量計(jì)算所測(cè)試復(fù)合物中OCIF的分子數(shù)目。
實(shí)際的比例可按照所使用的免疫測(cè)試技術(shù)的類型和/或用于測(cè)量總蛋白的技術(shù)而變化。本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案包括一個(gè)人源OCIF或其類似物或變異體與硫酸右旋糖酐的復(fù)合物,其中,利用從產(chǎn)生抗體OI-19的雜交瘤(FERMBP-6420)的培養(yǎng)物中純化的抗人OCIF單克隆抗體OI-19作為結(jié)合于固相的抗體和用流動(dòng)相中的過氧化物酶標(biāo)記從產(chǎn)生抗體OI-4的雜交瘤(FERM BP-6419)的培養(yǎng)物中純化的抗人OCIF單克隆抗體OI-4進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)確定的所述復(fù)合物中存在的OCIF或其類似物或變異體的分子的數(shù)目與利用Lowry方法測(cè)量總蛋白質(zhì)含量測(cè)定的所述復(fù)合物中的OCIF或其類似物或變異體的分子數(shù)目的比例至少是0.5,但不大于1.2。更為優(yōu)選的是該比例至少為0.6,但不大于1.1,最為優(yōu)選的是該比例至少為0.7,但不大于1.1。
優(yōu)選的本發(fā)明的復(fù)合物包括(a)一種復(fù)合物,其中所述選自O(shè)CIF或其類似物或變異體的物質(zhì)為人類單體OCIF,其在非還原條件下用SDA-PAGE測(cè)量的分子量大約為60000;或人類二聚體OCIF,其在非還原條件下用SDS-PAGE測(cè)量的分子量大約為120000,所述多糖及其衍生物選自透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素、酸性皮膚素、酸性乙酰肝素、酸性角質(zhì)酸、角叉藻聚糖、果膠、肝素、右旋糖酐及其衍生物,所述選自O(shè)CIF或其類似物或變異體的物質(zhì)與所述選自多糖及其衍生物的物質(zhì)的分子比例是1∶1至1∶10;(b)一種復(fù)合物,其中所述選自O(shè)CIF或其類似物或變異體的物質(zhì)為人類單體OCIF,其在非還原條件用SDA-PAGE測(cè)量的分子量大約為60000;或?yàn)槿祟惗垠wOCIF,其在非還原條件下用SDS-PAGE測(cè)量的分子量大約為120000,所述多糖和其衍生物選自硫酸右旋糖酐及其鹽,所述選自O(shè)CIF或其類似物或變異體的物質(zhì)與所述選自多糖及其衍生物的物質(zhì)的分子比例是1∶1至1∶10;(c)一種復(fù)合物,其中所述選自O(shè)CIF或其類似物或變異體的物質(zhì)為人類單體或二聚體OCIF,其中所述單體或所述OCIF二聚體的一個(gè)單元含有序列表的SEQ.ID.NO.1的+1~+380氨基酸,所述多糖衍生物是一具有平均分子量從1500-12000的硫酸右旋糖酐鈉鹽,所述選自O(shè)CIF或其類似物或變異體的物質(zhì)與所述硫酸右旋糖酐鈉鹽的分子比例為1∶1~1∶10;(d)如(c)所述復(fù)合物,其中所述選自O(shè)CIF或其類似物或變異體的物質(zhì)與所述硫酸右旋糖酐鈉鹽的分子比例為1∶1~1∶8;(e)如(c)所述復(fù)合物,其中所述選自O(shè)CIF或其類似物或變異體的物質(zhì)與所述硫酸右旋糖酐鈉鹽的分子比例為1∶1~1∶5;(f)如(c)~(e)之一所述復(fù)合物,其中所述多糖衍生物是一個(gè)具有平均分子量從1800至6000的硫酸右旋糖酐的鈉鹽。
本發(fā)明所述復(fù)合物可使用有利于多糖或其衍生物與OCIF或其類似物或變異體結(jié)合的任何合適的方法進(jìn)行制備。在本發(fā)明更進(jìn)一步的實(shí)施方案中,提供了一種復(fù)合物的制備方法,所述復(fù)合物含有至少一種選自O(shè)CIF或其類似物或變異體的物質(zhì),所述物質(zhì)與至少一種選自多糖及其衍生物的物質(zhì)結(jié)合,所述方法包括如下步驟在有利于在所述OCIF或其類似物或變異體與所述多糖或其衍生物之間形成復(fù)合物的條件下,溫育所述至少一種選自O(shè)CIF或其類似物或變異體的物質(zhì)及所述至少一種選自多糖及其衍生物的物質(zhì),然后除去沒有結(jié)合至所述OCIF或其類似物或變異體的游離的多糖或其衍生物。
溫育所述至少一種選自O(shè)CIF或其類似物或變異體的物質(zhì)及所述至少一種選自多糖及其衍生物的物質(zhì)是在適宜的條件下進(jìn)行的,但典型的溫育條件是在水環(huán)境下進(jìn)行的。優(yōu)選溫育在堿性條件下進(jìn)行,更為優(yōu)選的是溫育在pH從9.5至12的條件下進(jìn)行,最為優(yōu)選的是溫育在pH從10至11的條件下進(jìn)行。
在溫育過程中,水溶液中的所述OCIF或其類似物或變異體的濃度范圍并不特別限制,只要其適宜于形成所述的復(fù)合物。一般來(lái)說(shuō),水溶液中的所述OCIF或其類似物或變異體的最大濃度是從0.1至0.5mM,最小濃度是從0.001至0.05mM,優(yōu)選地,水溶液中的所述OCIF或其類似物或變異體的濃度為從0.01至0.2mM,最為優(yōu)選的是0.05至0.1mM。以O(shè)CIF為例,水溶液中的最大濃度是從10至50mg/ml,最小濃度是從0.1至5mg/ml,優(yōu)選的是,水溶液中的OCIF濃度為從1至20mg/ml,更為優(yōu)選的是從5至10mg/ml。
在溫育過程中,水溶液中的所述多糖或衍生物的濃度范圍并不特別限制,只要其適宜于形成所述的復(fù)合物。一般來(lái)說(shuō),水溶液中所述多糖或衍生物的最大濃度是從0.1至0.5M,最小濃度是從0.00005至0.05M。優(yōu)選的是,水溶液中所述多糖或衍生物的濃度是從0.005至0.25M,更為優(yōu)選的是0.05至0.1M。以硫酸右旋糖酐鈉鹽硫5為例,水溶液中所述多糖或衍生物的最大濃度是從200至1000mg/ml,最小濃度是從0.1至100mg/ml。優(yōu)選地,水溶液中所述多糖或其衍生物的濃度為從10至500mg/ml,最優(yōu)選地100至200mg/ml。
在溫育過程中,只要適宜于形成所述的復(fù)合物,溫度并不特別限制。一般來(lái)說(shuō),溫育的上限溫度是10-50℃,下限是0-4℃,優(yōu)選溫度范圍是4-37℃,最為優(yōu)選地4-10℃。
如上所述,本發(fā)明的復(fù)合物并不包括未與OCIF或其類似物或變異體結(jié)合的游離多糖或其衍生物。用于除去游離多糖或其衍生物的方法并不特別限制,只要其為實(shí)驗(yàn)中常規(guī)使用的方法例如純化、分離和/或分級(jí)分離。適宜的方法的例子包括離子交換色譜、吸附色譜、分配層析、凝膠過濾層析、疏水層析、親和層析、結(jié)晶、鹽析及超過濾。在所有這些中,凝膠過濾層析(下文中稱為“凝膠過濾”)及超過濾是優(yōu)選的,凝膠過濾最為優(yōu)選。
只要能夠用于從含有目的復(fù)合物的部分中分離出不結(jié)合至OCIF上的游離多糖或衍生物,用于溫育后從預(yù)期復(fù)合物中除去游離多糖或其衍生物的凝膠過濾中使用的凝膠并不特別限制,適宜的實(shí)例有瓊脂糖凝膠、右旋糖酐凝膠及聚丙烯酰胺凝膠。
本發(fā)明的復(fù)合物含有至少一種選自O(shè)CIF或其類似物或變異體的物質(zhì),其結(jié)合至少一種選自多糖及其衍生物的物質(zhì),該復(fù)合物可以使用不同的方法,包括等電點(diǎn)、糖含量及免疫檢測(cè)等將其與游離的未復(fù)合的OCIF或其類似物或變異體本身區(qū)別開來(lái)。
等電點(diǎn)可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的任何傳統(tǒng)的等電電泳法來(lái)進(jìn)行測(cè)量,OCIF為堿性蛋白,其等電點(diǎn)大約為pI9。這明顯高于本發(fā)明所述的含有OCIF及多糖及其衍生物例如硫酸右旋糖酐的復(fù)合物,該復(fù)合物典型的pI值一般在5-7這個(gè)區(qū)域,因此使用該技術(shù)是易于區(qū)別未復(fù)合的OCIF和復(fù)合的OCIF的。
本發(fā)明所述復(fù)合物和游離非復(fù)合OCIF或其類似物或變異體的糖含量可以使用傳統(tǒng)的測(cè)量中性糖含量的任何方法進(jìn)行測(cè)量,其典型實(shí)例包括苯酚硫酸法[MDubois等人,化學(xué)分析,28,350(1956)]。由于含有OCIF或其類似物或變異體及多糖或衍生物的本發(fā)明復(fù)合物的總的糖含量大于OCIF本身,因而其可以相互區(qū)別。
將本發(fā)明所述的含有結(jié)合有多糖及其衍生物的OCIF或其類似物或變異體的復(fù)合物與游離的未復(fù)合的OCIF或其類似物或變異體區(qū)別的另一種方法是使用可特異性結(jié)合至所述多糖或衍生物的抗體定量每一種中的多糖或其衍生物。
為了測(cè)量OCIF或其類似物或變異體中或本發(fā)明所述的含有OCIF或其類似物或變異體和多糖及其衍生物的復(fù)合物中的蛋白數(shù)量,用于測(cè)量總蛋白含量的任何傳統(tǒng)方法都可以利用。適宜的例子包括Lowry方法[Lowry,O.H.等人,生物化學(xué)雜志193,265-275(1951)]、光吸收(λ280nm)銀染色及BCA方法。
游離的未復(fù)合的OCIF或其類似物或變異體或本發(fā)明所述的復(fù)合物中的OCIF或其類似物或變異體可以使用至少一種抗OCIF的單克隆抗體的免疫學(xué)方法進(jìn)行測(cè)量。優(yōu)選用于免疫學(xué)測(cè)量人類OCIF的適宜的抗OCIF單克隆抗體包括由雜交瘤OI-19(FERM BP-6420)產(chǎn)生的抗體、由雜交瘤OI-4(FERM BP-6419)產(chǎn)生的抗體、由雜交瘤OI-26(FERM BP-6421)產(chǎn)生的抗體(參見WO-A-99/15691),這些抗體在本發(fā)明中分別被稱為“抗體OI-19”、“抗體OI-4”和“抗體OI-26”??贵wOI-19及抗體OI-4都以相同的親和力結(jié)合OCIF單體及二聚體,而抗體OI-26特異性結(jié)合OCIF二聚體。按照本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的任一已知技術(shù)可以使用該種類型抗體進(jìn)行免疫學(xué)測(cè)量(例如,參見WO-A-99/15691),適宜的方法包括酶免疫試驗(yàn)(稱為EIA)、放射性免疫試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)及夾層EIA。在所有這些中,ELISA是優(yōu)選的。OCIF如果是人源的,使用抗體OI-19或抗體OI-26作為固定抗體而抗體OI-14作為酶標(biāo)抗體可以優(yōu)選地進(jìn)行ELISA。用于標(biāo)記抗體的優(yōu)選的酶是過氧化物酶(稱為POD)。
產(chǎn)生抗體OI-4的雜交瘤于1997年(平成-9)10月16日以“OI-4”保藏在1-3,Higashi 1 chome,Tsukuba-shi Ibaraki-ken 305-8566,日本的工業(yè)科學(xué)和技術(shù)部,人生物科學(xué)和人技術(shù)國(guó)家研究院(其已成為國(guó)際專利生物保藏中心,國(guó)立高科技研究所在AIST Tsukuba Central 6,1-1,Higashil-Chome Tsukubashi,Ibaraki-ken 305-8566,日本),并給予保藏號(hào)FERMP-16473,它已于1998年(平成-10)7月13日轉(zhuǎn)為國(guó)際保藏,保藏號(hào)為FERMBP-6419。
產(chǎn)生抗體OI-19的雜交瘤于1997年(平成-9)10月16日以“OI-19”保藏在1-3,Higashi 1 chome,Tsukuba-shi Ibaraki-ken 305-8566,日本的工業(yè)科學(xué)和技術(shù)部,國(guó)立生物科學(xué)和人技術(shù)研究院(其已成為國(guó)際專利生物保藏中心,國(guó)立高科技研究所在AIST Tsukuba Central 6,1-1,Higashil-Chome Tsukubashi,Ibaraki-ken 305-8566,日本)并給予保藏號(hào)FERM BP-16474。它已于1998年(平成-10)7月13日轉(zhuǎn)為國(guó)際保藏,保藏號(hào)為FERM BP-6420。
產(chǎn)生抗體OI-26的雜交瘤于1997年(平成-9)10月6日以“OI-26”保藏在1-3,Higashi 1 chome,Tsukuba-shi Ibaraki-ken 305-8566,日本的工業(yè)科學(xué)和技術(shù)部,國(guó)立生物科學(xué)和人技術(shù)研究院(其已成為國(guó)際專利生物保藏中心,國(guó)立高科技研究所在AIST Tsukuba Central 6,1-1,Higashil-Chome Tsukubashi,Ibaraki-ken 305-8566,日本)并給予保藏號(hào)FERM P-16475。它已于1998年(平成-10)7月13日轉(zhuǎn)為國(guó)際保藏,保藏號(hào)為FERMBP-6421(參見WO-A-99/15691)。
本發(fā)明所述的含有OCIF或其類似物或變異體和多糖及其衍生物的復(fù)合物的血液或血清濃度可以如下進(jìn)行測(cè)量;首先,將所述復(fù)合物對(duì)人或非人動(dòng)物給藥,然后,經(jīng)過一段時(shí)間,從中移出血清或血液,所述復(fù)合物的血液或血清濃度使用ELISA,利用至少一種如本申請(qǐng)其他部分所述的抗OCIF單克隆抗體進(jìn)行測(cè)量(參見WO-A-99/15691)。
含有至少一種結(jié)合至至少一種選自多糖及其衍生物的物質(zhì)的選自O(shè)CIF或其類似物或變異體的物質(zhì)的本發(fā)明的復(fù)合物,對(duì)于治療或預(yù)防骨代謝疾病是非常有用的。在本發(fā)明中,骨代謝疾病可以是下述特征的疾病患者中骨的凈數(shù)量減少,且治療或預(yù)防所述疾病需要抑制骨的吸收和/或骨吸收的速率??墒褂帽景l(fā)明所述復(fù)合物治療或預(yù)防的骨代謝疾病包括原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥(老年骨質(zhì)疏松癥、絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥及自發(fā)性青少年骨質(zhì)疏松癥);內(nèi)分泌骨質(zhì)疏松癥(甲亢、甲狀旁腺功能亢進(jìn)、Cushing綜合癥及肢端肥大癥);骨質(zhì)疏松癥伴隨癥性腺機(jī)能衰退(垂體機(jī)能衰退、Klinefelter綜合癥及Turner綜合征);遺傳及先天骨質(zhì)疏松癥(成骨不全、高胱氨酸尿、Menkes綜合癥及Riley-Day綜合癥);因?yàn)橹亓\(yùn)載緩解或肢體固定的骨減少;Paget疾??;骨髓炎;骨質(zhì)丟失引起的感染病灶;由實(shí)體瘤(例如,乳腺癌、肺癌、腎癌及前列腺癌)導(dǎo)致的高血鈣;惡性溶血癥(多重骨髓瘤、淋巴瘤及白血病);自發(fā)性高血鈣;高血鈣伴隨甲亢或者腎功能障礙;由類固醇藥物引起的骨減少;由其他藥物(例如,免疫抑制劑例如氨甲喋呤及環(huán)孢菌素A、肝素及抗癲癇藥)引起的骨減少;由于腎功能障礙引起的骨減少;由于外科手術(shù)及消化器官疾病(例如小腸障礙、大腸障礙、慢性肝炎、胃切除、原發(fā)性膽肝硬化及肝硬化)引起的骨減少;由于各種類型的風(fēng)濕病例如風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨折引起的骨減少;由于各種類型的風(fēng)濕病例如風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎引起的關(guān)節(jié)損壞;粘蛋白血癥風(fēng)濕病骨關(guān)節(jié)炎;牙周骨損失;骨的癌轉(zhuǎn)移(骨溶解轉(zhuǎn)移);伴隨外傷產(chǎn)生的骨壞死或骨細(xì)胞死亡、Gaucher疾病、鐮刀性細(xì)胞貧血癥、紅斑狼瘡癥系統(tǒng)性或非外傷傷害;骨營(yíng)養(yǎng)不良例如腎骨膜炎;伴隨血堿性磷酸酶不足或者糖尿病的骨減少;伴隨營(yíng)養(yǎng)紊亂或飲食不良的骨減少;以及其他骨減少。骨代謝疾病也包括由于實(shí)體癌或骨癌轉(zhuǎn)移或惡性溶血疾病產(chǎn)生的惡疾(參見日本專利申請(qǐng)公開2000-178200)。
含有至少一種選自O(shè)CIF、其類似物及其變異體的物質(zhì)與至少一種選自多糖及其衍生物的物質(zhì)的本發(fā)明的復(fù)合物與藥物適宜性載體或稀釋劑的組合物可以以安全口服或非口服的方式對(duì)人體或非人動(dòng)物給藥。藥劑形式可以適宜選擇并根據(jù)各種因素改變,例如待治療疾病的類型、疾病的嚴(yán)重程度、患者的年齡性別及體重等。例如,復(fù)合物可以以片劑、膠囊、粉末、顆粒、糖漿的形式口服給藥;單獨(dú)或結(jié)合有傳統(tǒng)的助劑例如葡萄糖、氨基酸或其類似物靜脈注射;肌肉注射;皮下注射;皮內(nèi)或者腹腔單獨(dú)注射;以泥敷劑的形式經(jīng)皮給藥;以鼻滴的形式經(jīng)過鼻腔給藥;經(jīng)粘膜給藥,或以粘膜應(yīng)用劑形式口腔給藥;或者以栓劑的形式直腸內(nèi)給藥。這些藥劑可以以傳統(tǒng)的方法加入制藥領(lǐng)域的一般使用的添加劑例如賦形劑、粘合劑、崩解劑、潤(rùn)滑劑、調(diào)味劑、溶解劑、懸浮劑、色料、pH調(diào)節(jié)劑、殺毒劑、膠凝劑、表面活性劑及包衣劑來(lái)配制。
當(dāng)本發(fā)明的復(fù)合物以片劑形式配制時(shí),可以用本領(lǐng)域已知的任何載體。例如載體包括賦形劑例如乳糖、白糖、氯化鈉、葡萄糖、尿、淀粉、碳酸鈣、高嶺土、結(jié)晶纖維素、硅酸鹽等等;粘合劑例如水、乙醇、丙醇、簡(jiǎn)單的糖漿、葡萄糖溶液、淀粉溶液、明膠溶液、羧甲基纖維素、蟲漆、甲基纖維素、磷酸鉀、聚乙烯吡咯烷酮等;崩解劑例如干的淀粉、藻酸鈉、瓊脂粉末、昆布多糖粉末、碳酸氫鈉、碳酸鈣、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯、月桂基硫酸鈉、硬脂酸甘油一酸酯、淀粉、乳糖等等;分解抑制劑例如白糖、硬脂精、可可油脂、氫化油等等;吸收加速劑例如季銨堿、月桂基硫酸鈉等;加濕劑例如甘油、淀粉等等;吸附劑例如淀粉、乳糖、高嶺土、斑脫土、硅膠等等;潤(rùn)滑劑例如精制滑石、硬脂酸、硬脂酸金屬鹽如硬脂酸鈣和硬脂酸鎂、滑石、硼酸粉末、聚乙二醇等。此外,如果需要,片劑可以包衣,如形成糖包衣片劑、明膠包衣片劑、腸衣片劑、薄膜包衣片劑、雙層片劑或多層片劑。
本發(fā)明的復(fù)合物可以以小丸藥的形式配制,制劑可含有本領(lǐng)域已知的載體,例如,賦形劑例如葡萄糖、乳糖、可可油脂、淀粉粉末、硬化植物油、高嶺土、滑石等等;粘合劑例如有阿拉伯樹膠粉末、黃芪膠粉末、明膠、乙醇等等;崩解劑例如昆布多糖、瓊脂等等。
當(dāng)本發(fā)明復(fù)合物以栓劑形式配制時(shí),制劑可以含有傳統(tǒng)的載體例如聚乙二醇、可可油脂、高級(jí)醇、高級(jí)醇酯、明膠、半合成甘油酯等等。
當(dāng)本發(fā)明復(fù)合物以注射形式配制時(shí),最好將溶液或懸浮液形式的制劑消毒且制成和血液等滲。當(dāng)以溶液、乳狀液或懸浮液形式制備時(shí),可以使用任何已知的和傳統(tǒng)使用的稀釋劑,例如水、乙醇、丙二醇、乙氧基異十八烷醇、多氧化異十八烷醇及聚乙烯山梨醇脂肪酸酯。此外,在可注射配方中,制劑也可以含有鹽、葡萄糖、甘油等等,其量足以與血液保持等滲。它們也可含有其他試劑,包括增溶劑、緩沖劑、撫慰劑、pH調(diào)節(jié)劑、穩(wěn)定劑及溶解劑。配制后可將注射劑凍干。
本發(fā)明的制劑也可進(jìn)一步含有色料、防腐劑、香味劑、調(diào)味劑、甜味劑及其他藥品等添加劑。
含有至少一種選自O(shè)CIF、其類似物及其變異體的物質(zhì)和至少一種選自多糖及其衍生物的物質(zhì)的本發(fā)明的復(fù)合物存在于用于治療和預(yù)防骨代謝疾病的組合物中的量并不特別限制,但是其一般的重量百分比為0.1%~70%,最好是占有整個(gè)制劑重量的1~30%。
按照本發(fā)明的復(fù)合物的劑量將根據(jù)多種因素而改變,這些因素包括所治療的癥狀、患者的年齡、性別、體重等及給藥的途徑。然而給予成人的量一般有這樣一個(gè)范圍,其上限是每天30-1000mg,下限是每天0.001~0.03mg,優(yōu)選的范圍是每于0.03~30mg。給予的量一般是這樣一個(gè)范圍,其上限是每天1~20mg/kg,下限是每天0.01~0.5μg/kg,優(yōu)選的范圍是從0.5μg/kg~1mg/kg每天。根據(jù)這樣的因素例如給藥形式及患者的身體狀況,本發(fā)明的復(fù)合物可以以一天一次或一天數(shù)次給予。
下述實(shí)施例、參考實(shí)施例和試驗(yàn)實(shí)施例用于進(jìn)一步舉例說(shuō)明本發(fā)明,不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1含有OCIF和硫酸右旋糖酐(I)的復(fù)合物的制備1(a)重組二聚體人OCIF的制備按照EP-A-0816380(WO-A-96/26217)的實(shí)施例中所述的方法獲得分子量為大約120000的重組二聚體人OCIF。命名為pBKOCIF的質(zhì)粒載體包含編碼含有信號(hào)肽的人OCIF的核苷酸序列,是從根據(jù)EP-A-0816380的實(shí)施例11產(chǎn)生的大腸桿菌轉(zhuǎn)化株pBK/01F10中獲得的[根據(jù)布達(dá)佩斯條約,以保藏號(hào)FERMBP-5267保藏在1-3,Higashi lchome,Tsukuba-shi Ibaraki-ken 305-8566 Japan的工業(yè)科學(xué)和技術(shù)部,生物科學(xué)和人技術(shù)國(guó)立研究院(已經(jīng)成為現(xiàn)代工業(yè)科學(xué)和技術(shù)國(guó)家研究院國(guó)際專利生物體保藏中心)]。將該質(zhì)粒用限制性酶SalI和EcoRV消化。按照EP-A-0816380的的實(shí)施例14所描述的程序,回收編碼含有信號(hào)肽的人OCIF的核苷酸,該核苷酸等同于人OCIF cDNA。在所說(shuō)的核苷酸被分離和提純后,它被插入表達(dá)載體pcDL-SRα296(分子和細(xì)胞生物學(xué),第8期,p466,1988),然后用它轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株DH5α(Gibco BRL)(見EP-A-0816380描述的程序)。這樣所獲得的名為pSRαOCIF的重組載體從所說(shuō)的轉(zhuǎn)化培養(yǎng)物中提取并純化。
采用EP-A-0816380的實(shí)施例14的程序獲得重組人成熟OCIF。具體地說(shuō),將CHO dhFr-細(xì)胞(ATCC,CRL9096)用上面產(chǎn)生的重組質(zhì)粒pSRαOCIF和表達(dá)二氫葉酸還原酶(DHFR)的質(zhì)粒(WO-A-92/01053中公開的質(zhì)粒pBAdDSV)進(jìn)行轉(zhuǎn)染,然后選擇DHFR-表達(dá)轉(zhuǎn)染子。表達(dá)大量OCIF的轉(zhuǎn)化體被克隆。選擇其條件培養(yǎng)基中含有高濃度OCIF的克隆,并獲得表達(dá)最大量OCIF的克隆5561。調(diào)節(jié)獲得的克隆5561培養(yǎng)物,過濾,然后應(yīng)用于肝素瓊脂糖-FF凝膠柱(2.6×10cm,Pharmacia Co.)并采用線性氯化鈉梯度洗脫液進(jìn)行柱層析。含有OCIF活性的部分用約0.6~1.2M氯化鈉作為洗脫液洗脫,然后加入親和層析柱(blue-5PW,0.5×5.0cm,Tosoh Co)并采用線性氯化鈉梯度作為洗脫液進(jìn)行親和層析。洗脫出的各部分在還原和非還原條件下進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳,含有所期望的提純的重組人成熟OCIF的部分被確定是那些產(chǎn)生與EP-A-0816380例14中產(chǎn)生的OCIF蛋白質(zhì)同樣條帶的部分,其表觀分子量為60000和120000。這個(gè)單體肽的氨基酸序列如序列表的SEQ.ID.NO.1所示,它與SEQ.ID.NO.4的全序列或WO-A-96/26217和EP-A-0816380的SEQ ID.No.5中氨基酸No.1到No.380相同。
然后用1/100體積的25%的三氟乙酸補(bǔ)充含有獲得的人OCIF的合并部分并將得到的混合物注入反相柱(購(gòu)自YMC CO.的PROTEIN-RP,2.0mm×250mm),該柱已經(jīng)用含有0.1%的三氟乙酸的30%的乙腈進(jìn)行了預(yù)平衡處理。然后該柱以0.2ml/分鐘的流速采用從30%到55%的乙腈線性梯度進(jìn)行洗脫50分鐘。分別收集兩個(gè)峰部分,然后凍干。在還原條件下在SDS-PAGE上顯示出表觀分子量120000的條帶的部分隨后在下列實(shí)施例中作為二聚體人OCIF使用(見WO-A-96/26217和EP-A-0816380的實(shí)施例17和18)。
1(b)含有OCIF和硫酸右旋糖酐的復(fù)合物的制備將如上面實(shí)施例1(a)中所述制備的提純后的二聚體人OCIF溶解在10mM磷酸鈉緩沖溶液中(pH6.0),緩沖液含有0.15M氯化鈉,從而得到濃度為1.5、2、5、6.5、10、12.5、20或50mg/ml的OCIF溶液。硫酸右旋糖酐鈉鹽硫5(MeitoSangyo Co.,Ltd制造,以下簡(jiǎn)稱“DS5”)溶解在水溶液中,從而獲得40、100、130、150、200、400、500、510或1000mg/ml的最后濃度,然后加入1N氫氧化鈉到最終pH為10、10.5或11。將獲得的水溶液在4、7、25或37℃下溫育1、3、6、18、24、48、72、96、144、168或288小時(shí)。
在溫育結(jié)束后,將4ml各溶液注入Superdex 200預(yù)制級(jí)凝膠過濾柱(柱的內(nèi)徑16mm;長(zhǎng)度60em,排阻極限分子量1,300,000;由Amersham PharmaciaBiotech制作),該柱預(yù)先用含有0.3M氯化鈉的10mM磷酸鈉緩沖液(pH6)平衡,然后以2毫升/分鐘的流速用同一緩沖液進(jìn)行洗脫。用紫外分光光度計(jì)監(jiān)測(cè)280nm的吸收,收集大約28到36分鐘保留時(shí)間內(nèi)的洗出液。在大約50到70分鐘的保留時(shí)間,不結(jié)合OCIF的游離DS5被洗脫。所有凝膠過濾步驟在室溫下進(jìn)行。獲得的含有期望的二聚體人OCIF和DS5的復(fù)合物的制備物在-60℃冷凍并儲(chǔ)存。每一種復(fù)合物的制備條件歸納在下表1。
表1
1(c)天然人OCIF的制備按照WO-A-96/26217和EP-A-0816380的實(shí)施例1到4中描述的方法從人胎兒肺成纖維細(xì)胞IMR-90(ATCC-CCL186)的培養(yǎng)物中制備天然生產(chǎn)的人OCIF。
實(shí)施例2含有OCIF和硫酸右旋糖酐(II)的復(fù)合物的制備按照上面的實(shí)施例1(a)的描述制備的提純的二聚體人OCIF溶于10mM的磷酸鈉緩沖溶液(pH6.0),這種溶液含有0.15M的氯化鈉,從而得到5mg/ml OCIF濃度的溶液。具有5000分子量的硫酸右旋糖酐鈉(DS5000,由Wako PureChemical Industries公司制造)溶于這樣得到的水溶液,DS5000最后濃度為150mg/ml,然后加入1N氫氧化鈉,最后的pH值為10.5。這種水溶液然后在4℃溫育24小時(shí)。
在溫育結(jié)束后,按照上面實(shí)施例1(b)的描述,對(duì)獲得的4ml溶液進(jìn)行Superdex200預(yù)制級(jí)凝膠過濾柱色譜。用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)280nm波長(zhǎng)處的吸收,收集保留時(shí)間為大約28到36分鐘的洗出液。沒有結(jié)合OCIF的游離DS5000在保留時(shí)間約為40到65分鐘內(nèi)洗脫。
所得的含有希望的二聚體人OCIF和DS5000的復(fù)合物的制備物被冷凍并在-60℃儲(chǔ)存。復(fù)合物的制備條件歸納在表2如下。
表2
實(shí)施例3等電點(diǎn)的測(cè)量如上所述在實(shí)施例1(a)中制備的提純的重組二聚體人OCIF和實(shí)施例1(b)制備的表1中制備序號(hào)為22的OCIF和硫酸右旋糖酐的復(fù)合物,使用IEFpH3~7緩沖劑試劑盒(Technical Frontier Co.)分別注入等電電泳凝膠IEF PAGE mini(pH范圍3到10,由IWAKI GLASS制作),按照下列方案使電壓作用于凝膠100V1小時(shí),隨后200V 1小時(shí),最后為500V30分鐘。在完成電泳后,每一種條件下獲得的凝膠用考馬斯藍(lán)染色。
由上述獲得的電泳凝膠測(cè)定的二聚體人OCIF的等電點(diǎn)大約為pI9,通過將OCIF和OCIF復(fù)合物的條帶位置與pI標(biāo)志物進(jìn)行比較,制備序號(hào)22的OCIF和硫酸右旋糖酐復(fù)合物的等電點(diǎn)大約為pI6.5。
實(shí)施例4含有OCIF和硫酸右旋糖酐的復(fù)合物中OCIF和硫酸右旋糖酐的分子比例的測(cè)量4(a)用過氧化物酶標(biāo)記的抗人OCIF單克隆抗體OI-4原液的制備在該步驟中,使用EZ-Link馬來(lái)酰亞胺活化的辣根過氧化物酶試劑盒(Pierce公司生產(chǎn)),按照該試劑盒提供的說(shuō)明書中所述的程序II,用過氧化物酶標(biāo)記抗人OCIF單克隆抗體。具體操作如下。
按照EP-A-0974671(WO-A-99/15691)的實(shí)施例4所述的方法,從產(chǎn)生抗體OI-4的雜交瘤(FERM BP-6419)的培養(yǎng)物中純化抗人OCIF單克隆抗體OI-4,然后用10mM磷酸鹽緩沖液(pH7.6)將其稀釋至最終蛋白濃度為1mg/ml。
在使用前,將S-乙酰硫代乙酸N-琥珀酰亞胺酯(在所述EZ-Link馬來(lái)酰亞胺活化的辣根過氧化物酶試劑盒中提供)溶于二甲基甲酰胺中,得到濃度為10mg/ml的溶液。加入4μl等份試樣到上面制備的稀釋的1ml含OI-4的溶液中,獲得的溶液在室溫下溫育30分鐘。溫育結(jié)束后,加入20μl通過在使用之前將5mg鹽酸羥胺溶解在100μl的馬來(lái)酰亞胺共軛緩沖液(提供在所述的EZ-Link馬來(lái)酰亞胺活化的辣根過氧化酶試劑盒中)中得到的溶液,然后在室溫溫育得到的溶液2小時(shí)。然后,將反應(yīng)混合物注入聚丙烯酰胺脫鹽柱(10ml,包含在所述EZ-Link馬來(lái)酰亞胺活化的辣根過氧化酶試劑盒中),該柱在使用前用30ml的馬來(lái)酰亞胺共軛緩沖液平衡。然后,在該柱中加入馬來(lái)酰亞胺共軛緩沖液。以0.5ml為一部分收集洗脫液。含有抗體的第7和第10部分合并。就在使用前將5mg的EZ-LINK馬來(lái)酰亞胺活化的辣根過氧化物酶(包含在所述EZ-Link馬來(lái)酰亞胺活化的辣根過氧化酶試劑盒中)溶于500微升的蒸餾水中,取100μl加入到合并的洗脫部分中,得到的混合物在室溫下溫育1小時(shí)。溫育后,加入等體積的甘油,所獲得的溶液在-20℃保存。
上述方法獲得的溶液用作為用過氧化物酶標(biāo)記的注抗人OCIF單克隆抗體OI-4(以下簡(jiǎn)稱為POD-OI-4)原液,以下簡(jiǎn)稱為“POD-OI-4原液”。
4(b)OCIF的定量通過采用兩個(gè)抗OCIF單克隆抗體進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)測(cè)量實(shí)施例1和實(shí)施例2中制備的任何復(fù)合物和參考實(shí)施例1制備的混合物中的OCIF的含量,詳細(xì)步驟如下。
按照EP-A-0974671(WO-A-99/15691)的實(shí)施例4所描述的方法,從產(chǎn)生抗體OI-26的雜交瘤(FERM BP-6421)的培養(yǎng)物中提純抗人OCIF單克隆抗體OI-26,然后溶解在0.1M的碳酸氫鈉中獲得蛋白質(zhì)終濃度為5μg/ml的溶液。將100μl的等分試樣轉(zhuǎn)移到96孔的微滴盤(Maxisorp,由NUNC制造)的每個(gè)孔中,然后將該盤密封,并在4℃下溫育過夜。溫育后,每一孔都用250微升的磷酸緩沖鹽(PBS)(pH7.4)沖洗三次,這種緩沖液含有0.1%聚山梨醇酯20。將20μl稀釋緩沖液(含有0.2M的TRIS鹽酸、40%Block Ace(購(gòu)自Dainippon Pharmaceutical公司)和0.1%聚山梨醇酯20;pH7.4]加入到每個(gè)孔中,然后,將盤保持在室溫下20分鐘以封閉未結(jié)合OI-26的孔的區(qū)域。
欲加入上述制備的OI-26結(jié)合孔中的樣品優(yōu)選采用上面用于封閉孔的稀釋緩沖液進(jìn)行稀釋。為了制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,含有已知濃度的人OCIF的稀釋緩沖液用作標(biāo)準(zhǔn)。稀釋緩沖液用作對(duì)照。將每種樣品50μl轉(zhuǎn)移到各個(gè)孔。
在樣品加入到這些孔中后,將50μl的通過用稀釋緩沖液
稀釋POD-OI-4原液(如在實(shí)施例4(a)所描述的方法制備)1500倍得到的溶液加入每個(gè)孔中,并且在室溫下溫育微滴盤2小時(shí)。然后,每個(gè)孔用250μl的含0.1%的聚山梨醇酯20的磷酸緩沖液(以下簡(jiǎn)稱PB pH7.4)沖洗四次。
將0.1M的檸檬酸和0.2M的磷酸氫二鈉混合,用作底物溶液(pH4.5)。將32.5ml等分試樣轉(zhuǎn)移到試管中,并加入6.5μl的過氧化氫。然后,將13mg的鄰苯二胺二鹽酸鹽(OPD)片(Wako Pure Chemical Industries,Ltd.生產(chǎn))溶解于上述溶液。將100微升等分試樣注入每個(gè)孔,用鋁膜覆蓋微滴盤,然后在室溫下溫育15分鐘。然后加入50微升的反應(yīng)終止液到每個(gè)孔中,這種終止液含有體積比為250∶50的純水和濃硫酸。在用振動(dòng)器(Titer Mixer MB-1,由JapanTrika制造)輕輕攪拌孔中的溶液后,采用微板讀數(shù)器(SPECTRAFLUORTECAN制造)測(cè)量490nm波長(zhǎng)處每個(gè)孔的吸收。
在從上述已知濃度的人OCIF的標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)曲線的基礎(chǔ)上,計(jì)算每份樣品中人OCIF的量。
4(c)硫酸右旋糖酐的定量如上實(shí)施例1和2所述產(chǎn)生的每種復(fù)合物中硫酸右旋糖酐的量,是通過苯酚硫酸方法作為中性糖來(lái)測(cè)定的,具體描述如下。
具有已知濃度在10到60μlg/ml范圍的DS5(Meito Sangyo Co.Ltd.生產(chǎn))或DS5000(Wako Pure Chemical Industries公司生產(chǎn))溶液是用稀釋溶液(0.01M檸檬酸、0.3M氯化鈉、0.01%聚山梨醇酯80水溶液pH6.0)制備的,用作標(biāo)準(zhǔn)溶液。將標(biāo)準(zhǔn)品、樣品或稀釋溶液各0.2ml轉(zhuǎn)移到每個(gè)試管。0.2ml的50mg/ml水性苯酚被加入其中,并快速攪拌。將得到的混合物在60℃水浴溫育20秒后,將1.0ml的濃硫酸加入其中。輕柔但快速攪拌后,試管被置于室溫溫育10分鐘,再次快速攪拌,然后被置于室溫溫育20分鐘。然后,試管中溶液在490nm波長(zhǎng)的吸光度用分光光度計(jì)(UV-20Shimadzu Seisakusho,K.K.制造)測(cè)量。
根據(jù)吸光度和標(biāo)準(zhǔn)曲線,測(cè)定了中性糖的含量。人OCIF含有一個(gè)糖鏈。因此,可根據(jù)所分析的制備物的中性糖含量測(cè)量值推導(dǎo)出人OCIF本身的中性糖含量值,從而計(jì)算出所分析的制備物中與人OCIF結(jié)合的硫酸右旋糖酐的含量。
4(d)含有OCIF和硫酸右旋糖酐的復(fù)合物中OCIF和硫酸右旋糖酐分子比的計(jì)算。
如例4(c)所述測(cè)定的被分析的制備物中硫酸右旋糖酐的含量除以如例4(b)所述測(cè)定的被分析的制備物的人OCIF的含量,得到在所分析的制備物中每1mg人OCIF中所含的硫酸右旋糖酐的量。
所獲得的數(shù)字用于根據(jù)設(shè)定的人OCIF單體分子量是60000,DS5的分子量是1950,DS5000的分子量是5000,借助計(jì)算每個(gè)OCIF單體分子的硫酸右旋糖酐分子的數(shù)目,計(jì)算所分析的制備物中單體OCIF和硫酸右旋糖酐的分子比。
結(jié)果在下列表3中顯示。
表3
實(shí)施例5OCIF/硫酸右旋糖酐復(fù)合物中OCIF和硫酸右旋糖酐之間的結(jié)合穩(wěn)定性如上面實(shí)施例4(c)所述,含有OCIF和硫酸右旋糖酐的復(fù)合物的凝膠過濾重復(fù)兩次,測(cè)量每次凝膠過濾后得到的復(fù)合物中的硫酸右旋糖酐的量。
5(a)OCIF和硫酸右旋糖酐的溫育使用實(shí)施例1(b)所述的步驟。如實(shí)施例1(a)所述制備的重組二聚體人OCIF溶于含有0.15M氯化鈉的10mM的磷酸鈉緩沖液(pH6.0)中,獲得OCIF5mg/ml濃度的溶液。將DS5溶于這個(gè)溶液中,獲得最后DS5濃度為150mg/ml,然后加入1N的氫氧化鈉溶液調(diào)整pH值到10.5。所獲得的溶液在4℃溫育7天,獲得含有人二聚體OCIF和DS5復(fù)合物的溶液。
5(b)第一次凝膠過濾按照實(shí)施例1(b)描述的方法,在實(shí)施例5(a)中溫育后獲得的含有人二聚體OCIF和DS5的復(fù)合物的溶液進(jìn)行凝膠過濾。收集保留時(shí)間約為28到36分鐘的部分,而未結(jié)合OCIF的游離硫酸右旋糖酐是在保留時(shí)間約為50到70分鐘內(nèi)洗脫的。
5(c)蛋白質(zhì)含量測(cè)量按照如下Lowry方法[Lowry,O.H.等人,生物化學(xué)雜志,193,265-275(1951)],測(cè)量復(fù)合物中的蛋白質(zhì)含量。
將0.2g五水硫酸銅(II)(Wako Pure Chemical)溶于水獲得50ml的最終體積。將0.4g酒石酸鈉二水合物(Wako Pure Chemical)溶于水獲得50ml的最終體積。將20g碳酸鈉溶于水獲得最終100ml的體積。在使用之前上述三種水溶液按照1∶1∶2的體積比混合(該溶液稱A溶液)。10g十二烷基硫酸鈉(Nacalai TesqueInc.)溶于水獲得最終200ml的體積(該溶液稱B溶液)。3.2g氫氧化鈉(Wako PureChemical)溶于水至最終體積為100ml(該溶液稱為C溶液)。A、B和C溶液在使用之前按照1∶2∶1的體積比混合。
在使用之前,福林(Folin-ciocalteu)試劑(Wako Pure Chemical)和水按照1∶5的體積比混合。2.76g的檸檬酸三鈉鹽二水合物(Wako PureChemical)、0.13g的單水檸檬酸(Wako Pure Chemical)、17.5g的氯化鈉和0.1g的聚山梨醇酯80溶于水至最終體積為1L(pH6.9),獲得的溶液稱為稀釋溶液。
9.5ml的稀釋溶液加入在含濃度小于0.1%的疊氮化鈉的0.9%氯化鈉水溶液中的含2mg/ml牛血清白蛋白(稱為“BSA”)的牛血清白蛋白(Pierce Co.Ltd)的標(biāo)準(zhǔn)溶液500μL中,得到的溶液稱為“100μg/ml BSA溶液”。3.5ml、3ml、2.5ml或2ml的稀釋溶液分別加入到1.5ml、2ml、2.5ml或3ml 100μg/ml BSA溶液中,得到的溶液分別稱為“30μg/ml BSA溶液”、“40μg/ml BSA溶液”、“50μg/ml BSA溶液”、“60μg/ml BSA溶液”。將3ml稀釋溶液加到1.5ml60μg/ml BSA中,得到的溶液稱為“20μg/ml BSA溶液”。
用稀釋液稀釋待確定蛋白質(zhì)含量的樣品,得到最后蛋白質(zhì)濃度約為40μg蛋白質(zhì)/ml的溶液。將1ml的20μg/ml BSA溶液、30μg/ml BSA溶液、40μg/mlBSA溶液、50μg/ml BSA溶液、60μg/ml BSA溶液、稀釋樣品或稀釋溶液(n=3)轉(zhuǎn)移至試管中,加入1ml的堿性銅試劑,將得到的溶液混合,在室溫下溫育10分鐘。然后加入0.5ml稀釋的福林試劑,混合得到的溶液,在室溫下溫育30分鐘。然后,用寬10mm的石英杯,在紫外分光光度計(jì)中(Lambda20Perkin ElmerCo Ltd.)測(cè)量波長(zhǎng)750nm處每種混合物的吸光值。然后,根據(jù)用標(biāo)準(zhǔn)BSA溶液的吸光值(作為換算為BSA的量的值)產(chǎn)生的校正曲線,計(jì)算樣品中含的蛋白質(zhì)的量。
5(d)硫酸右旋糖酐的定量分析采用實(shí)施例4(c)描述的步驟,測(cè)量了實(shí)施例5(b)中第一次凝膠過濾后獲得的復(fù)合物中結(jié)合人OCIF的硫酸右旋糖酐的含量。
5(e)第二次凝膠過濾上面實(shí)施例5(b)中獲得的合并收集部分轉(zhuǎn)移到兩個(gè)Centriprep過濾單元(YM-30,30,000MW cutoff,Millipore Amicon Co Ltd.),采用離機(jī)(himacCT60,Hitachi Seisakusho Co Ltd.)以2000rpm的速度離心20分鐘。收集從兩個(gè)Centriprep過濾單元得到的沒有過濾出去的濃縮溶液并混合。該溶液按照實(shí)施例1(b)的描述進(jìn)行凝膠過濾,收集保留時(shí)間大約為28到36分鐘的部分并合并。如實(shí)施例5(c)和5(d)所述測(cè)量合并部分中的復(fù)合物的蛋白質(zhì)和糖的含量。
5(f)第三次凝膠過濾實(shí)施例5(e)中獲得的合并收集部分轉(zhuǎn)移到兩個(gè)Centriprep過濾單元(YM-30,30,000MW cutoff,Millipore Amicon Co Ltd),采用離心機(jī)(himacCT60,Hitachi Seisakusho Co Ltd.)以2000rpm的速度離心20分鐘。收集兩個(gè)Centriprep過濾單元中沒有過濾出去的濃縮溶液并混合。得到的濃縮液按照實(shí)施例1(b)的描述進(jìn)行凝膠過濾,收集保留時(shí)間為大約28到36分鐘的部分物并混合。然后,合并部分中的復(fù)合物的蛋白質(zhì)和糖的含量按照例5(c)和例5(d)的描述進(jìn)行測(cè)量。
5(g)OCIF與硫酸右旋糖酐的分子比的計(jì)算在實(shí)施例5(b)中第一次凝膠過濾后、在實(shí)施例5(e)中第二次凝膠過濾后、在實(shí)施例5(f)中第三次凝膠過濾后獲得的部分中的復(fù)合物中存在的單體OCIF和硫酸右旋糖酐的分子比按照實(shí)施例4(d)進(jìn)行計(jì)算。得到的結(jié)果匯總在如下表4中。
表4
可以從上表立刻明顯發(fā)現(xiàn),本發(fā)明的復(fù)合物中OCIF和硫酸右旋糖酐的分子比經(jīng)過三次凝膠過濾還非常恒定,表明本發(fā)明的復(fù)合物中OCIF和硫酸右旋糖酐之間的結(jié)合高度穩(wěn)定。
實(shí)施例6肝素交聯(lián)柱上OCIF和硫酸右旋糖酐復(fù)合物的吸附程度6(a)肝素柱色譜本例中以每分鐘4ml的流速進(jìn)行所有的柱色譜步驟。
采用5ml的含有0.7M氯化鈉的10mM磷酸鈉緩沖液預(yù)平衡肝素交聯(lián)柱(HiTrap肝素HP柱,Lot.289212,Amersham Pharmacia Biotech)。取實(shí)施例1中表1的制備物,并用含有0.7M氯化鈉的10mM磷酸鈉緩沖液稀釋到最終蛋白質(zhì)濃度為0.1mg/ml。獲得的1ml稀釋溶液注入色譜柱,收集1ml的第一次洗提液(部分A)。再注入5ml的10mM的含有0.7M氯化鈉的10mM磷酸鈉緩沖液,收集第二次洗提液5ml(部分B)。最后,注入4ml的1含有2M氯化鈉的10mM磷酸鈉緩沖液,收集4ml的洗提液(部分C)。
6(b)洗提液中OCIF的含量測(cè)量將以10μg/ml的濃度溶解了抗人OCIF單克隆抗體OI-19(FERM BP-6420)的100μL的0.1M的碳酸氫鈉(pH9.6)轉(zhuǎn)移到96孔的微量滴定平板(MaxisorpNUNCCo Ltd.)的每一孔中。將平板密封并在4℃溫育過夜。然后,通過傾注,清除每個(gè)孔中的溶液,將300μL的50%的BLOCK ACE(購(gòu)自Dainippon PharmaceuticalCo.,Ltd.)加入每個(gè)孔中,在室溫下溫育平板2小時(shí)。在清除每個(gè)孔中的溶液后,用300μL含有0.1%聚山梨醇酯20的PBS(pH7.4)和SERA WASHER MW-96R(Bio Tec Co Ltd.)沖洗每個(gè)孔三次。
在如上所述預(yù)備了每個(gè)孔后,將實(shí)施例6(a)獲得的各20μl三種洗提液(部分A、B和C)采用含有40%Block Ace、10μg/ml的小鼠免疫球蛋白G和0.1%的聚山梨醇酯20的0.2M Tris-鹽酸(pH7.4)稀釋,獲得最終體積為120μL,然后用同樣體積的純水稀釋。同時(shí),已知量的人OCIF溶解于120μl含有40%Block Ace、10μg/ml的小鼠免疫球蛋白G和0.1%的聚山梨醇酯20的0.2MTris-HCl(pH7.4)中,然后用同樣體積的純水稀釋。將這樣得到的溶液用作標(biāo)準(zhǔn)。
100μL的每一種稀釋洗提液和標(biāo)準(zhǔn)溶液注入如上所述預(yù)備好的微量滴定平板的每一個(gè)孔中,然后在室溫用微板混合器(NS-PIuchi Seiei-Do,Co Ltd.)輕輕攪拌,將平板溫育2小時(shí)。然后,從每個(gè)孔中清除溶液,采用300μL的含有0.1%聚山梨醇酯20的PBS(pH7.4)和SERA WASHER MW-96R(Bio Tec CoLtd.)沖洗每個(gè)孔6次。在100μL的含有25%Block Ace、10μg/ml的小鼠免疫球蛋白G和0.1%的聚山梨醇酯20的0.1M Tris-HCl(pH7.4)中加入實(shí)施例4(a)制備的POD-OI-4原液,獲得體積比為0.01%的溶液,然后再注入每個(gè)孔中,在室溫用相同的微板混合器溫和攪拌2小時(shí)溫育平板。從每個(gè)孔中清除溶液,采用300μL的含有0.1%聚山梨醇酯20的PBS(pH7.4)和SERA WASHERMW-96R(Bio Tec Co Ltd.)沖洗每個(gè)孔6次。
在沖洗這些孔后,100μL的3,3`,5,5`-四甲聯(lián)苯胺(TMB)可溶試劑(Scytek Co Ltd.)加入每個(gè)孔中,然后在室溫用相同的微板混合器溫和攪拌溫育平板10到15分鐘。然后,100μl的TMB終止緩沖液(Scytek Co Ltd.)加入每個(gè)孔。用微板混合器溫和攪拌平板大約1分鐘后,采用微板讀數(shù)器(SPECTRATHERMOTECAN Co Ltd.)測(cè)量450nm處每個(gè)孔的吸光值。根據(jù)每個(gè)所述的標(biāo)準(zhǔn)溶液對(duì)濃度的吸光值畫出的標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算部分A、B和C每部分中含有的OCIF的量[標(biāo)注為(a)、(b)和(c)]。按照下式計(jì)算所測(cè)試的OCIF和硫酸右旋糖酐的復(fù)合物對(duì)肝素交聯(lián)柱的吸附程度。(c)(a)+(b)+(c)]]>在下表5中匯總了上面的實(shí)施例1制備的7個(gè)復(fù)合物的結(jié)果。也給出未復(fù)合的OCIF的對(duì)應(yīng)結(jié)果。從表中可以看出,未復(fù)合OCIF比本發(fā)明的復(fù)合物更強(qiáng)烈地結(jié)合肝素柱。還發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的復(fù)合物可以由其對(duì)肝素交聯(lián)柱的吸附程度進(jìn)一步表征。
表5
實(shí)施例7OCIF/硫酸右旋糖酐復(fù)合物的免疫檢測(cè)7(a)蛋白質(zhì)的含量的測(cè)量按照上面實(shí)施例5(c)描述的方法確定實(shí)施例1的復(fù)合物制備物中的蛋白質(zhì)的含量。
7(b)OCIF的量的免疫測(cè)量采用實(shí)施例6所述的ELISA技術(shù)測(cè)量免疫方法確定的實(shí)施例1的復(fù)合物制備物中OCIF的含量。
7(c)免疫檢測(cè)率的計(jì)算實(shí)施例7(b)獲得的值除以實(shí)施例7(a)獲得的對(duì)應(yīng)值,獲得的值稱為免疫檢測(cè)率。
這些結(jié)果歸納于下表6。也給出未復(fù)合OCIF的對(duì)應(yīng)結(jié)果。也發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的復(fù)合物可以用其免疫檢測(cè)率進(jìn)一步表征。
表6
參考實(shí)施例1OCIF和硫酸右旋糖酐的混合物的制備采用EP-A-1127578(WO-A-2000/24416)的實(shí)施例1公開的步驟如下制備OCIF和硫酸右旋糖酐鈉鹽(分子量5000或10000)的混合物。
按照實(shí)施例1(a)所述制備分子量大約為120000的提純的二聚體人OCIF,將其溶解到10mM的含有0.15M氯化鈉和0.01%聚山梨醇酯80的磷酸鈉緩沖液(pH6.0)中,得到OCIF濃度為0.25mg/ml的溶液。將實(shí)施例2描述的DS5000(Wako Pure Chemical Industries,Ltd.制造)或分子量為10000的硫酸右旋糖酐鈉鹽(Wako Pure Chemical Industries,Ltd.制造,以下稱為DS10000)溶解在上述水溶液中,得到最終硫酸右旋糖酐鈉鹽濃度為1或4mg/ml的溶液,再加入氫氧化鈉得到最終的pH值為7。所得水溶液在4℃溫育24小時(shí),得到含OCIF和DS5000或DS10000的期望制劑,然后用于與如下試驗(yàn)實(shí)施例1中進(jìn)行對(duì)比。
每一種混合物的制備條件歸納于下表7。
表7
試驗(yàn)實(shí)施例1含OCIF和硫酸右旋糖酐的復(fù)合物的血清濃度的測(cè)量1(a)注射和收集血液5周齡Wistar雌性大鼠(體重大約100g)禁食過夜。用含有0.01%聚山梨醇酯80的PBS(pH7.4)稀釋所要測(cè)試的實(shí)施例1、2或參考實(shí)施例1中制備的OCIF和硫酸右旋糖酐的制備物到濃度為0.25mg/ml制備注射液,然后注射溶液進(jìn)入一只試驗(yàn)大鼠的尾巴的靜脈,單劑量注射量為2ml/kg體重。注射六小時(shí)后,從大鼠的心臟取血。
1(b)血清分級(jí)分離1(a)中收集的血液在室溫下凝結(jié)30分鐘后,用直徑10cm的轉(zhuǎn)子以14000rpm離心血液3分鐘得到上清液血清。
1(c)血清中的OCIF的定量分析抗人OCIF單克隆抗體OI-19(參見EP-A-0974671/WO-A-99/15691)溶解在0.1M碳酸氫鈉溶液中獲得最終OCIF濃度為10μg/ml的溶液,將100μL的該溶液加入96孔微滴平板(MaxisorpNUNC制造)的每一個(gè)孔中,然后密封平板,在4℃下放置過夜。傾注法清除抗體溶液,再加入300μL的封閉緩沖溶液(50%Block Ace購(gòu)自Dainippon Pharmaceutical Co.,Ltd.)到每個(gè)孔中,該平板在室溫下放置2小時(shí)。然后用300μL的含0.1%聚山梨醇酯20的PBS(pH7.4)沖洗每個(gè)孔三次。
將100μL的純水和120μL稀釋緩沖溶液[成分0.2M Tris-HCl、40%Block Ace(購(gòu)自Dainippon Pharmaceutical Co.,Ltd.)、10μg/ml小鼠免疫球蛋白G和0.1%聚山梨醇酯20,pH7.4]加入20μL的如1(b)所述收集的待測(cè)試血清中,然后混合。作為對(duì)照,將100μL的純水和含有已知濃度的人OCIF二聚體的120μL的稀釋緩沖液加入20μL蒸餾水,然后混合。
100μL的每種獲得的血清制備物加入到每個(gè)孔中,平板在室溫下放置2小時(shí)。在反應(yīng)完成后用300μL的含有0.1%聚山梨醇酯20(pH7.4)的溶液沖洗每個(gè)孔6次。用稀釋溶液[含有0.1M的Tris-HCl、25%Block Ace(購(gòu)自DainipponPharmaceutical Co.Ltd.)、10μg/ml小鼠免疫球蛋白G和0.1%聚山梨醇酯20(pH7.4)]稀釋實(shí)施例4(a)獲得的POD-OI-4原液1000倍得到的溶液100μl加入到每個(gè)孔中,平板在室溫放置2小時(shí)。
然后,每個(gè)孔用含0.1%聚山梨醇酯20的300μL的PBS(pH7.4)沖洗6次。100μL的底物溶液(TMB可溶試劑Scytek生產(chǎn))加入每個(gè)孔,平板在室溫放置10到15分鐘。然后,100μL的反應(yīng)終止液(TMB終止緩沖液Scytek生產(chǎn))加入到每個(gè)孔中。
在采用振動(dòng)機(jī)(微板混合器NS-PIuchi Seiei-Do Co Ltd.制造)溫和攪拌后,采用微板讀數(shù)器(SPECTRA THERMOTECAN制作)測(cè)量450nm波長(zhǎng)處每個(gè)孔的吸光值。根據(jù)用標(biāo)準(zhǔn)OCIF溶液制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算試驗(yàn)血清的OCIF濃度。以類似于血清的方法,通過測(cè)量1(a)中制備的每個(gè)注射液中的OCIF濃度計(jì)算每公斤體重的OCIF的劑量(mg/kg)。
1(d)血清濃度按照1(c)所述的方法,對(duì)每個(gè)樣品定量分析1(b)得到的血清中的OCIF。試驗(yàn)結(jié)果表示在表8。
表8
*血清中的校正濃度是當(dāng)每公斤體重OCIF的劑量轉(zhuǎn)化為0.5mg/kg時(shí),血清中的OCIF濃度。
如表8所示,在以每公斤體重注射0.5mg/kg本發(fā)明的制備物6小時(shí)后血清的濃度比采用同樣劑量的參考制備物1注射后的濃度高2.2到11.7倍。
本發(fā)明的先優(yōu)點(diǎn)如上所示,與在WO-A-2000/24416中公開的含有OCIF和多糖的已知混合物相比,本發(fā)明的含有至少一種OCIF、其類似物或變異體和至少一種多糖或其衍生物的復(fù)合物在注射后在血液中的保留濃度明顯高得多。本發(fā)明的復(fù)合物可用于預(yù)防或治療各種骨代謝疾病諸如骨質(zhì)疏松癥、血鈣過多癥、骨溶解轉(zhuǎn)移、由于風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎產(chǎn)生的骨損失、由于類固醇藥物產(chǎn)生的骨減少、多重骨髓瘤、或由于腎臟功能障礙產(chǎn)生的骨減少或血鈣過多、腎病性骨營(yíng)養(yǎng)不良、骨關(guān)節(jié)炎等。
序-列表<110>三共株式會(huì)社<120>含有OCIF和多糖的復(fù)合物<130>EPP85710(FP-200229SW)<150>JP 2001-198985<151>2001-06-29<160>1<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>401<212>PRT<213>人<220><221>SIGNAL<222>(-21)..(-1)<223><220><221>mat_peptide<222>(+1)..(+380)<223><400>1Met Asn Asn Leu Leu Cys Cys Ala Leu Val Phe Leu Asp Ile Ser Ile-20 -15 -10Lys Trp Thr Thr Gln Glu Thr Phe Pro Pro Lys Tyr Leu His Tyr Asp-5 -11 5 10Glu Glu Thr Ser His Gln Leu Leu Cys Asp Lys Cys Pro Pro Gly Thr15 20 25Tyr Leu Lys Gln His Cys Thr Ala Lys Trp Lys Thr Val Cys Ala Pro30 35 40Cys Pro Asp His Tyr Tyr Thr Asp Ser Trp His Thr Ser Asp Glu Cys45 50 55Leu Tyr Cys Ser Pro Val Cys Lys Glu Leu Gln Tyr Val Lys Gln Glu60 65 70 75Cys Asn Arg Thr His Asn Arg Val Cys Glu Cys Lys Glu Gly Arg Tyr80 85 90Leu Glu Ile Glu Phe Cys Leu Lys His Arg Ser Cys Pro Pro Gly Phe95 100 105Gly Val Val Gln Ala Gly Thr Pro Glu Arg Asn Thr Val Cys Lys Arg110 115 120Cys Pro Asp Gly Phe Phe Ser Asn Glu Thr Ser Ser Lys Ala Pro Cys125 130 135Arg Lys His Thr Asn Cys Ser Val Phe Gly Leu Leu Leu Thr Gln Lys140 145 150 155Gly Asn Ala Thr His Asp Asn Ile Cys Ser Gly Asn Ser Glu Ser Thr160 165 170Gln Lys Cys Gly Ile Asp Val Thr Leu Cys Glu Glu Ala Phe Phe Arg175 180 185Phe Ala Val Pro Thr Lys Phe Thr Pro Asn Trp Leu Ser Val Leu Val190 195 200Asp Asn Leu Pro Gly Thr Lys Val Asn Ala Glu Ser Val Glu Arg Ile205 210 215Lys Arg Gln His Ser Ser Gln Glu Gln Thr Phe Gln Leu Leu Lys Leu220 225 230 235Trp Lys His Gln Asn Lys Asp Gln Asp Ile Val Lys Lys Ile Ile Gln240 245 250Asp Ile Asp Leu Cys Glu Asn Ser Val Gln Arg His Ile Gly His Ala255 260 265Asn Leu Thr Phe Glu Gln Leu Arg Ser Leu Met Glu Ser Leu Pro Gly270 275 280Lys Lys Val Gly Ala Glu Asp Ile Glu Lys Thr Ile Lys Ala Cys Lys285 290 295Pro Ser Asp Gln Ile Leu Lys Leu Leu Ser Leu Trp Arg Ile Lys Asn300 305 310 315Gly Asp Gln Asp Thr Leu Lys Gly Leu Met His Ala Leu Lys His Ser320 325 330Lys Thr Tyr His Phe Pro Lys Thr Val Thr Gln Ser Leu Lys Lys Thr335 340 345Ile Arg Phe Leu His Ser Phe Thr Met Tyr Lys Leu Tyr Gln Lys Leu350 355 360Phe Leu Glu Met Ile Gly Asn Gln Val Gln Ser Val Lys Ile Ser Cys365 370 375Leu380
權(quán)利要求
1.一種復(fù)合物,所述復(fù)合物含有至少一種選自破骨細(xì)胞形成抑制因子(OCIF)、其類似物和變異體的物質(zhì),它結(jié)合于至少一種選自多糖及其衍生物的物質(zhì)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的復(fù)合物,其中所述的選自O(shè)CIF、其類似物和變異體的物質(zhì)是天然類型或重組類型的。
3.按照權(quán)利要求1或2所述的復(fù)合物,其中所述的選自O(shè)CIF、其類似物和變異體的物質(zhì)是一種單體或二聚體。
4.按照權(quán)利要求3所述的復(fù)合物,其中所述的選自O(shè)CIF、其類似物和變異體的物質(zhì),是在非還原條件下采用SDS-PAGE測(cè)量時(shí)分子量為大約60000的人單體OCIF或采用SDS-PAGE在非還原條件下測(cè)量的分子量為大約120000的人二聚體OCIF。
5.按照權(quán)利要求1到4中任何一項(xiàng)所述的復(fù)合物,其中所述的OCIF含有序列表SEQ.ID.NO.1的-21到+380的氨基酸。
6.按照權(quán)利要求1到4中任何一項(xiàng)所述的復(fù)合物,其中所述的OCIF含有序列表SEQ.ID.NO.1的+1到+380的氨基酸。
7.按照權(quán)利要求1到6中任何一項(xiàng)所述的復(fù)合物,其中所述的多糖及其衍生物選自透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素、皮膚素酸、己酰肝素酸、角質(zhì)素酸、角叉膠、果膠、肝素、右旋糖酐和其衍生物。
8.按照權(quán)利要求7所述的復(fù)合物,其中所述多糖衍生物選自硫酸右旋糖酐及其鹽。
9.按照權(quán)利要求8所述的復(fù)合物,其中所述多糖衍生物是硫酸右旋糖酐的鈉鹽。
10.按照權(quán)利要求9所述的復(fù)合物,其中所述硫酸右旋糖酐的平均分子量為1500到12000。
11.按照權(quán)利要求9所述的復(fù)合物,其中所述硫酸右旋糖酐的平均分子量為1800到6000。
12.按照權(quán)利要求1到11中任何一項(xiàng)所述的復(fù)合物,其中所述選自O(shè)CIF、其類似物和變異體的物質(zhì)和所述選自多糖及其衍生物的物質(zhì)的分子比為1∶1到1∶10。
13.按照權(quán)利要求12所述的復(fù)合物,其中所述的分子比是1∶1到1∶8。
14.按照權(quán)利要求1到13中任何一項(xiàng)所述的復(fù)合物,其中所述含有OCIF或其類似物或變異體的復(fù)合物對(duì)肝素的吸附強(qiáng)度比游離的未復(fù)合OCIF或其類似物或變異體的吸附強(qiáng)度低。
15.按照權(quán)利要求14的復(fù)合物,其中按照下列步驟計(jì)算的對(duì)肝素的吸附度小于0.7(a)裝填了固定有肝素的交聯(lián)瓊脂糖珠的色譜柱采用含有0.1到0.8M氯化鈉的低離子強(qiáng)度緩沖液平衡;(b)將試驗(yàn)的復(fù)合物溶解在與(a)相同的低離子強(qiáng)度緩沖液中并注入柱中,然后收集第一次洗提液(部分A);(c)然后采用與(a)相同的低離子強(qiáng)度緩沖液進(jìn)一步洗脫,收集第二次洗提液(部分B);(d)然后采用含有1.0到2.0M氯化鈉的高離子強(qiáng)度緩沖液洗脫,收集第三次洗提液(部分C);(e)每一部分A、B、和C中的復(fù)合物含量(分別標(biāo)注為(a),(b)和(c))采用免疫測(cè)定法測(cè)量;(f)按照下列公式測(cè)定復(fù)合物對(duì)肝素的吸附度吸附度=(c)/[(a)(b)+(c)]。
16.按照權(quán)利要求1到15中任何一項(xiàng)所述的復(fù)合物,該復(fù)合物包括OCIF或其類似物或變異體和硫酸右旋糖酐或其鹽,其中通過酶聯(lián)免疫吸收測(cè)定法(ELISA)測(cè)定所述復(fù)合物中所述OCIF或其類似物或變異體的分子數(shù)目與通過利用Lowry方法測(cè)量總蛋白含量測(cè)定的所述復(fù)合物中OCIF或其類似物或變異體分子數(shù)目的比是0.5到1.2,其中ELISA方法利用從產(chǎn)生抗體OI-19的雜交瘤(FERMBP-6420)的培養(yǎng)物純化的抗人OCIF單克隆抗體OI-19作為結(jié)合到固相的抗體,流動(dòng)相中使用從產(chǎn)生抗體OI-4的雜交瘤(FERM BP-6419)的培養(yǎng)物純化的用辣根過氧化酶標(biāo)記的抗人OCIF單克隆抗體OI-4。
17.按照權(quán)利要求16所述的復(fù)合物,其中所述的比例為0.6到1.1。
18.按照權(quán)利要求16所述的復(fù)合物,其中所述的比例為0.7到1.1。
19.按照權(quán)利要求1所述的復(fù)合物,其中所述選自O(shè)CIF、其類似物和變異體的物質(zhì)是通過SDS-PAGE在非還原條件下測(cè)量的分子量是大約60000的人單體OCIF,或通過SDS-PAGE在非還原條件下測(cè)量的分子量是大約120000的人二聚體OCIF,所述多糖及其衍生物選自透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素、皮膚素酸、乙酰肝素酸、角質(zhì)素酸、角叉膠、果膠、肝素、右旋糖酐和其衍生物,所述選自O(shè)CIF、其類似物和變異體的物質(zhì)與所述選自多糖和其衍生物的分子比是1∶1到1∶10。
20.按照權(quán)利要求1所述的復(fù)合物,其中所述選自O(shè)CIF、其類似物和變異體的物質(zhì)是在非還原條件下采用SDS-PAGE測(cè)量的分子量是大約60000的人單體OCIF,或在非還原條件下采用SDS-PAGE測(cè)量的分子量是大約120000的人二聚體OCIF,所述多糖及其衍生物選自硫酸右旋糖酐和其鹽,所述選自O(shè)CIF、其類似物和變異體的物質(zhì)與所述選自多糖和其衍生物的物質(zhì)的分子比為1∶1到1∶10。
21.按照權(quán)利要求1所述的復(fù)合物,其中所述選自O(shè)CIF、其類似物和變異體的物質(zhì)是人單體或二聚體OCIF,其中所述單體或所述OCIF二聚體的一個(gè)單元包括序列表中SEQ.ID.NO.1所示的氨基酸+1至+380,所述的多糖衍生物是平均分子量為1500至12000的硫酸右旋糖酐的鈉鹽,所述選自O(shè)CIF、其類似物和變異體的物質(zhì)與所述硫酸右旋糖酐鈉鹽的分子比是1∶1至1∶10。
22.按照權(quán)利要求21所述的復(fù)合物,其中所述選自O(shè)CIF、其類似物和變異體的物質(zhì)與所述硫酸右旋糖酐鈉鹽的分子比是1∶1至1∶8。
23.按照權(quán)利要求21的復(fù)合物,其中所述選自O(shè)CIF、其類似物和變異體的物質(zhì)與所述硫酸右旋糖酐鈉鹽的分子比是1∶1至1∶5。
24.按照權(quán)利要求21至23中任何一項(xiàng)的復(fù)合物,其中所述多糖衍生物是平均分子量為1800至6000的硫酸右旋糖酐鈉鹽。
25.在給藥病人后延長(zhǎng)OCIF或其類似物或變異體保留在血流內(nèi)的時(shí)間的方法,該方法包括在給藥前將權(quán)利要求1至6中任何一項(xiàng)定義的至少一種所述OCIF、其類似物或其變異體與至少一種如權(quán)利要求1和7至11中任何一項(xiàng)定義的多糖或其衍生物復(fù)合。
26.一種藥物組合物,包括有效量的藥理學(xué)活性劑與其載體或稀釋劑,其中所述藥理學(xué)活性劑是按照權(quán)利要求1至24中任何一項(xiàng)的復(fù)合物。
27.按照權(quán)利要求26的藥物組合物,該組合物用于骨代謝疾病的治療和預(yù)防。
28.按照權(quán)利要求1至24中任何一項(xiàng)的復(fù)合物,該組合物用作藥物。
29.按照權(quán)利要求1至24中任何一項(xiàng)的復(fù)合物,該組合物用作預(yù)防或治療骨代謝疾病的藥物。
30.按照權(quán)利要求1至24中任何一項(xiàng)的復(fù)合物,該復(fù)合物用作預(yù)防或治療骨代謝疾病的藥物,所述骨代謝疾病選自骨質(zhì)疏松癥、骨質(zhì)減少、佩吉特氏疾病、骨髓炎、歸因于骨損失的傳染性病灶、血鈣過多、骨破折、歸因于風(fēng)濕病的關(guān)節(jié)損壞或骨質(zhì)減少、骨關(guān)節(jié)炎、牙周骨損失、骨的癌轉(zhuǎn)移、伴隨跌打損傷的骨壞死或骨細(xì)胞死亡、高雪氏病、鐮狀細(xì)胞血癥、紅斑狼瘡全身性或非外傷性損傷、骨質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良和歸因于實(shí)體癌或者骨的癌轉(zhuǎn)移或惡性溶血疾病的惡疾。
31.按照權(quán)利要求1至24中任何一項(xiàng)的復(fù)合物在制備預(yù)防或治療骨代謝疾病的藥物中的用途。
32.按照權(quán)利要求31的用途,其中所述骨代謝疾病選自骨質(zhì)疏松癥、骨質(zhì)減少、佩吉特氏疾病、骨髓炎、歸因于骨損失的傳染性病灶、血鈣過多、骨破折、歸因于風(fēng)濕病的關(guān)節(jié)損壞或骨質(zhì)減少、骨關(guān)節(jié)炎、牙周骨損失、骨的癌轉(zhuǎn)移、伴隨跌打損傷的骨壞死或骨細(xì)胞死亡、高雪氏病、鐮狀細(xì)胞血癥、紅斑狼瘡全身性或非外傷性損傷、骨質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良和歸因于實(shí)體癌或者骨的癌轉(zhuǎn)移或惡性溶血疾病的惡疾。
33.按照權(quán)利要求1至24中任何一項(xiàng)的復(fù)合物的制備方法,所述的方法包括在9.5至12的pH溫育至少一種選自如權(quán)利要求1至6中任何一項(xiàng)定義的OCIF、其類似物和變異體的物質(zhì)和至少一種選自如權(quán)利要求1和7至11中任何一項(xiàng)定義的多糖及其衍生物的物質(zhì),然后除去未結(jié)合所述OCIF、其類似物或變異體的任何游離多糖或其衍生物。
34.按照權(quán)利要求33的方法,其中在10至11的pH進(jìn)行所述的至少一種選自O(shè)CIF、其類似物和變異體的物質(zhì)和所述至少一種選自多糖及其衍生物的物質(zhì)的溫育。
35.按照權(quán)利要求33或權(quán)利要求34所述的方法,其中通過凝膠過濾層析法除去溫育后未結(jié)合所述OCIF、其類似物或變異體的任何游離多糖或其衍生物。
36.如權(quán)利要求1至24中任何一項(xiàng)定義的復(fù)合物,所述的復(fù)合物按照權(quán)利要求33至35中任何一項(xiàng)的方法制備。
全文摘要
一種新的復(fù)合物,該復(fù)合物含有至少一種選自破骨細(xì)胞形成抑制因子(OCIF)及其類似物及變異體的物質(zhì),該物質(zhì)與至少一種選自多糖及其衍生物的物質(zhì)結(jié)合,該復(fù)合物在給予患者時(shí)在血流中的滯留時(shí)間延長(zhǎng),這對(duì)于治療和預(yù)防骨代謝疾病是非常有用的。
文檔編號(hào)A61K47/48GK1442201SQ02155849
公開日2003年9月17日 申請(qǐng)日期2002年6月29日 優(yōu)先權(quán)日2001年6月29日
發(fā)明者山本真一, 岡田純一, 栗原厚, 沼澤琢, 近藤淳一, 津田英資, 望月伸一, 西宏高, 宮崎秀樹 申請(qǐng)人:三共株式會(huì)社
產(chǎn)品知識(shí)
行業(yè)新聞
- 手推車的制作方法【專利摘要】本實(shí)用新型涉及一種手推車,包括第一前斜支架和第二前斜支架,第一前斜支架的頂部及第二前斜支架的頂部均設(shè)有十字套管,第一前斜支架的底部及第二前斜支架的底部均設(shè)有通過螺栓固定的前腳輪,第一前斜支架的右側(cè)及第二前斜支架的
- 專利名稱:一種精神病患者輸液固定器的制作方法技術(shù)領(lǐng)域:本實(shí)用新型屬于醫(yī)療輔助器械領(lǐng)域,特別涉及一種精神病患者輸液固定器。 背景技術(shù):精神病是一種因大腦功能重度失調(diào)而導(dǎo)致的精神失常,患者臨床表現(xiàn)為胡言亂語(yǔ)、苦笑無(wú)常、打人毀物等,對(duì)暴躁型精神患
- 專利名稱:內(nèi)科用病床的制作方法技術(shù)領(lǐng)域:本實(shí)用新型涉及醫(yī)療器械裝置技術(shù)領(lǐng)域,尤其涉及一種內(nèi)科用病床。 背景技術(shù):目前,在醫(yī)院、診所,病人使用的病床是由床身、床頭和床身下端的支腿構(gòu)成,內(nèi)科病人在病床上因病產(chǎn)生嘔吐時(shí),經(jīng)常將醫(yī)生或陪護(hù)人員弄得手
- 下肢肌肉萎縮護(hù)理裝置制造方法【專利摘要】本實(shí)用新型涉及一種神經(jīng)外科護(hù)理設(shè)備,特別涉及一種下肢肌肉萎縮護(hù)理裝置,其技術(shù)方案是:箱體的底部固定電機(jī),箱體的中間部位連接轉(zhuǎn)動(dòng)軸,偏心輪固定在轉(zhuǎn)動(dòng)軸上,所述的轉(zhuǎn)動(dòng)軸上設(shè)有傳動(dòng)齒輪,電機(jī)通過鏈條連接轉(zhuǎn)動(dòng)
- 專利名稱:一種新型的心電圖導(dǎo)電液涂抹擦的制作方法技術(shù)領(lǐng)域:一種新型的心電圖導(dǎo)電液涂抹擦技術(shù)領(lǐng)域[0001]本實(shí)用新型涉及一種醫(yī)療器械,尤其是一種適合心電圖測(cè)量過程中用于導(dǎo)電液涂抹的涂抹擦。背景技術(shù):[0002]心電圖儀是臨床診斷和科研常用的
- 專利名稱:具藥用功能口香糖的制備方法技術(shù)領(lǐng)域:本發(fā)明屬于輕工業(yè)食品技術(shù)領(lǐng)域,涉及口香糖的制備,具體為一種具有藥用功能的口香糖的制備方法。背景技術(shù): 口香糖作為一種眾口皆碑,老少皆宜的餐間零食,不僅能清新口氣,生津凝香,怡爽口喉,而且還具緩解
- 專利名稱:一種具備生物活性的種植體制備方法技術(shù)領(lǐng)域:本發(fā)明涉及醫(yī)用器材制備方法,具體涉及一種具備生物活性的種植體制備方法。背景技術(shù):純鈦和鈦合金因其生物毒性低、相容性好、理化性能適于人體等優(yōu)點(diǎn),被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域,鈦金屬種植體也已逐漸成為
- 專利名稱:用于關(guān)節(jié)內(nèi)粘彈性補(bǔ)充的方案的制作方法技術(shù)領(lǐng)域:本發(fā)明涉及風(fēng)濕病學(xué)和整形外科。更具體而言,本發(fā)明涉及通過粘彈性補(bǔ)充 (viscosupplementation)治療軟骨組織病癥(例如骨關(guān)節(jié)炎)。背景技術(shù):骨關(guān)節(jié)炎(OA)為漸進(jìn)性退化
- 具有無(wú)線避障裝置的智能輪椅的制作方法【專利摘要】本實(shí)用新型涉及一種具有無(wú)線避障裝置的智能輪椅。目前市場(chǎng)上的智能輪椅,沒有配置無(wú)線避障裝置,使用起來(lái)不是很方便實(shí)用。本實(shí)用新型組成包括:輪椅裝置(1),所述的輪椅裝置包括前滾輪裝置(17)、后滾
- 一種手臂骨折懸掛保護(hù)架的制作方法【專利摘要】本實(shí)用新型公開了一種手臂骨折懸掛保護(hù)架,包括兩條背帶,兩條背帶上均設(shè)有一個(gè)能沿背帶移動(dòng)的滑塊,滑塊上設(shè)有限制滑塊移動(dòng)的螺母,兩條背帶的下方固定有一塊橫截面為半圓弧形的底板,底板內(nèi)設(shè)有一塊橫截面為半
- 專利名稱:充氣(液)式止血引流管的制作方法技術(shù)領(lǐng)域:本實(shí)用新型涉及的是手術(shù)器械,具體是一種止血引流管。背景技術(shù):目前在外科手術(shù),特別是對(duì)腹腔疾病實(shí)施手術(shù)中。對(duì)于創(chuàng)面止血是很令醫(yī)生頭疼的問題,須將止血紗布敷在手術(shù)創(chuàng)面上,然后用手按住紗布來(lái)止血
- 專利名稱:速溶阿膠及其制備工藝的制作方法技術(shù)領(lǐng)域:本發(fā)明涉及一種速溶阿膠及其制備工藝。阿膠藥用歷史悠久,是祖國(guó)醫(yī)學(xué)寶庫(kù)的珍品。長(zhǎng)期以來(lái),以卓著的療效和神奇的營(yíng)養(yǎng)滋補(bǔ)作用而著稱于世,深受國(guó)內(nèi)外用戶的歡迎。但是傳統(tǒng)阿膠生產(chǎn)周期長(zhǎng),特別是出膠后膠
- 專利名稱:磁共振肌電信號(hào)觸發(fā)器的制作方法技術(shù)領(lǐng)域:本發(fā)明涉及圖像采集裝置,尤其涉及一種磁共振肌電信號(hào)觸發(fā)器。 背景技術(shù):速度編碼才目位對(duì)比磁共振成像(velocity-encoded phase-contrast magnetic reso
- 專利名稱:利用熒光面陣成像的牙菌斑檢測(cè)裝置的制作方法技術(shù)領(lǐng)域:本發(fā)明屬于口腔醫(yī)學(xué)檢測(cè)裝置技術(shù)領(lǐng)域,具體涉及一種基于熒光面陣成像的牙菌斑檢測(cè)裝置。背景技術(shù):牙菌斑是一種粘附在牙齒表面或口腔其他軟組織上的生物膜,包括大量的細(xì)菌、 細(xì)胞間物質(zhì)、脫
- 一種微創(chuàng)手術(shù)器械的制作方法【專利摘要】本實(shí)用新型公開了一種微創(chuàng)手術(shù)器械,由第一鉗柄和第二鉗柄交叉于一連接點(diǎn)形成首端為夾頭、末端為控制夾頭張開或閉合的手柄;第二鉗柄的首端端部具有一套線部;第一鉗柄和第二鉗柄閉合時(shí),套線部與第一鉗柄首端相抵靠在
- 一種新型自動(dòng)化婦科診療輔助裝置制造方法【專利摘要】本實(shí)用新型提供一種新型自動(dòng)化婦科診療輔助裝置,包括沖洗瓶,主機(jī),曝氣石,電動(dòng)泵,磁化沖洗手柄,手柄座,支架,沖洗頭,消毒杯,放液螺栓,導(dǎo)線,插頭和連接管,所述的沖洗平設(shè)置在主機(jī)的右面;所述的
- 小血管磁性吻合器的制造方法【專利摘要】本實(shí)用新型的目的是提供一種小血管磁性吻合器,主要為兩個(gè)平行設(shè)置的圓柱體的第一磁性裝置和第二磁性裝置,第一磁性裝置和第二磁性裝置的前后兩側(cè)設(shè)置有固定軌道進(jìn)行固定便于操作,第一磁性裝置的尺寸大于第二磁性裝置
- 一種復(fù)方百合干解酒毒沖劑的制作方法【專利摘要】本發(fā)明公開了一種復(fù)方百合干解酒毒沖劑,按照質(zhì)量百分?jǐn)?shù)的原料包括百合干20-45%、桑葚5-15%、陳皮8-15%、酸棗8-25%、菊花5-10%、草果3-12%、肉豆蔻8-17%、葛根10-25
- 專利名稱:一種治療下肢慢性潰瘍的藥物及其制備方法技術(shù)領(lǐng)域:本發(fā)明涉及一種治療下肢慢性潰瘍的藥物及其制備方法,屬中藥領(lǐng)域。背景技術(shù):下肢潰瘍是一種外科疾癥,特別是慢性下肢潰瘍更屬于疑難病癥,這種潰瘍長(zhǎng)期不愈合或愈合后仍反復(fù)發(fā)作,嚴(yán)重影響人們的
- 專利名稱:一種防電腦輻射的保健品的制作方法技術(shù)領(lǐng)域:本發(fā)明涉及保健品,特別是涉及一種防電腦輻射的保健品。背景技術(shù):電腦輻射會(huì)直接影響到內(nèi)分泌系統(tǒng)的穩(wěn)亂,導(dǎo)致皮膚新陳代謝不規(guī)律。加上電腦有磁性,會(huì)聚積一些灰塵、和不潔的空氣,這些都會(huì)影響到皮膚
- 軟包裝輸液用貼膜蓋的制作方法【專利摘要】本實(shí)用新型屬于醫(yī)藥內(nèi)包材【技術(shù)領(lǐng)域】,具體涉及一種軟包裝輸液用貼膜蓋,包括管體和設(shè)于管體內(nèi)的隔板,所述管體設(shè)為階梯形的一體結(jié)構(gòu),共三段,分別為第一段、第二段和第三段,第一段與第二段相連的位置設(shè)有隔板,