專(zhuān)利名稱(chēng)：禽傳染性法氏囊病與巴氏桿菌病二價(jià)基因工程疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及禽基因工程新疫苗。具體地說(shuō)，涉及禽傳染性法氏囊病與巴氏桿菌病二價(jià)基因工程新疫苗。
背景技術(shù)：
傳染性法氏囊病病毒(IBDV)，屬雙鏈RNA病毒科，能引起雞和火雞發(fā)生傳染性法氏囊病或Gumboro病。它通過(guò)破壞雞法氏囊的B淋巴細(xì)胞引起3～12周齡雛雞的免疫抑制。
IBDV的基因組由2段雙鏈RNA組成。較小的那段(A)編碼VP1，是雙鏈RNA依賴(lài)的RNA聚合酶。較大的那段(B)含有2個(gè)開(kāi)放性閱讀框?？?為VP5蛋白編碼?？?為一個(gè)多聚蛋白質(zhì)編碼，此多聚蛋白可被蛋白水解酶自動(dòng)加工成3個(gè)病毒蛋白，即VP2，VP4，VP3。其中VP2和VP3是該病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)。VP2是IBDV主要的宿主保護(hù)性抗原。它至少含有3個(gè)獨(dú)立的可誘導(dǎo)綜合性抗體的單抗原決定簇。
由于本病至今仍無(wú)很好的治療方法，而免疫接種提高雞的特異抵抗力，一直是防治IBD的最佳方法。目前對(duì)雞進(jìn)行免疫的疫苗多為活疫苗，根據(jù)其毒力可分為弱毒型、中毒型和強(qiáng)毒型3種。弱毒型疫苗易被母源抗體中和，強(qiáng)毒型疫苗則因毒力強(qiáng)而很少使用。現(xiàn)在較為普遍使用的是中毒型疫苗。無(wú)論是弱毒型或中毒型疫苗在進(jìn)行減毒過(guò)程中其免疫作用力就逐漸失去?，F(xiàn)在經(jīng)常見(jiàn)到的疫苗免疫失敗就是由于這些減毒活疫苗的質(zhì)量不穩(wěn)定，變異株和超強(qiáng)毒株的出現(xiàn)等原因所造成的。另外，也有可能是減毒疫苗重新返強(qiáng)毒，導(dǎo)致強(qiáng)毒散播。
隨著對(duì)IBDV分子生物學(xué)特性研究的不斷深入，對(duì)其變異機(jī)理和毒力決定因素的認(rèn)識(shí)也在不斷深化。許多科學(xué)家致力于使用基因工程的方法來(lái)改善和加強(qiáng)對(duì)IBDV的預(yù)防免疫工作。最近幾年，在使用重組技術(shù)表達(dá)IBDV的結(jié)構(gòu)蛋白方面已有以下幾個(gè)方面的報(bào)道1)亞單位疫苗的研究報(bào)道；2)在大腸桿菌中表達(dá)的VP2蛋白；3)在酵母菌體內(nèi)表達(dá)的VP2重組蛋白；4)IBDV的核酸疫苗研究；5)表達(dá)IBDV VP2蛋白的重組火雞皰疹病毒(HVT)vHVT001，vHVT002。

發(fā)明內(nèi)容
我們通過(guò)基因工程的方法克隆了在湖北荊州發(fā)病的IBDV超強(qiáng)野毒株的VP2基因，構(gòu)建了原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX-KG-VP2，并成功地在Pasteurells multocida C48-16(簡(jiǎn)稱(chēng)P.multocida C48-16)中實(shí)現(xiàn)了表達(dá)。表達(dá)產(chǎn)物為胞液中可溶性蛋白質(zhì)，可直接用該菌誘導(dǎo)雞產(chǎn)生針對(duì)IBDV的抗體，并對(duì)雞提供保護(hù)作用。此基因工程疫苗具有廣泛的應(yīng)用前景。
P.multocida C48-16是一種弱毒的禽霍亂菌株。此菌株是黑龍江獸藥一廠(chǎng)將多殺性巴氏桿菌強(qiáng)毒株通過(guò)豚鼠培養(yǎng)190代后再通過(guò)雞胚40代育成的弱毒菌株。它是一種非常安全有效的預(yù)防禽巴氏桿菌病的活疫苗。從1972年培養(yǎng)成功至今一直是我國(guó)首選的預(yù)防禽多殺性巴氏桿菌病的活菌疫苗。通過(guò)我們的研究發(fā)現(xiàn)它是一個(gè)比較理想的基因工程疫苗活載體菌，除可應(yīng)用于傳染性法氏囊病以外，還可應(yīng)用于其它疾病的基因工程疫苗的研究制備。
此外，我們克隆的IBDV強(qiáng)野毒株的VP2基因在基因數(shù)據(jù)庫(kù)(GenBank)中未發(fā)現(xiàn)與之序列完全相同的病毒株，因此可以肯定它是一種新的變異毒株。
因此，本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)存在的缺點(diǎn)和不足，提供一種禽傳染性法氏囊病和巴氏桿菌病的二價(jià)基因工程疫苗。具體地說(shuō)1)提供一種可以預(yù)防禽傳染性法氏囊病和巴氏桿菌病的二價(jià)基因工程疫苗；2)提供一種用P.multocida C48-16菌株制備活載體基因工程疫苗的方法；3)提供一種新的IBDV病毒株VP2基因序列。
本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的1、IBDV VP2基因的克隆方法1)病料RNA的提取取IBD病雞法氏囊組織病料約1克，加液氮磨碎，用sangon UNIQ-10Trizol RNA抽提試劑盒進(jìn)行RNA提取。
2)RT-PCR擴(kuò)增IBDV的VP2基因設(shè)計(jì)套式PCR引物，用外套引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和第一次PCR，用第一次PCR產(chǎn)物稀釋1000倍后用內(nèi)套引物進(jìn)行第二次擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果見(jiàn)圖1。
3)構(gòu)建pGEX-KG-VP2質(zhì)粒將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳并使用上海華舜生物工程有限公司生產(chǎn)的小量膠回收試劑盒進(jìn)行回收。將凝膠回收產(chǎn)物連接到pMD18-T質(zhì)粒載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。
提取轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒DNA。用限制性核酸內(nèi)切酶Bam HI和Hind III酶切已回收的質(zhì)粒DNA和pGEX-KG質(zhì)粒。電泳回收VP2基因和片段化的pGEX KG質(zhì)粒。將VP2基因與片段化pGEX-KG相連。完成pGEX-KG-VP2質(zhì)粒的構(gòu)建。用該菌轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，培養(yǎng)大腸桿菌后提純質(zhì)粒DNA。
2、P.multocida C48-16感受態(tài)細(xì)胞的制備和轉(zhuǎn)化P.multocida C48-16感受態(tài)細(xì)胞的制備1)挑取禽多殺性巴氏桿菌C48-16單菌落于LB+2％血漿的培養(yǎng)液中，37℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。
2)取飽和培養(yǎng)的P.multocida C48-16LB培養(yǎng)液400微升，加于40毫升LB培養(yǎng)液中37℃振蕩培養(yǎng)3小時(shí)左右，至培養(yǎng)液出現(xiàn)較明顯絮狀物，置冰上冷卻。轉(zhuǎn)入50毫升離心管中，5000g×10min離心收集菌體沉淀。
3)用0.1mol/L mops漂洗一次。
4)加4毫升含50mmol/L CaCl2的0.1mol/L mops溶液重懸菌體，冰上放置20小時(shí)。
5)次日，將菌液在5000g×5min，離心。去上清，用含50mmol/L CaCl2的0.1mol/Lmops重懸菌體，此為P.multocida C48-16感受態(tài)細(xì)胞。
P.multocida C48-16菌株的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)1)取P.multocida C48-16感受態(tài)細(xì)胞200微升，加pGEX-KG-VP2 1微克，冰浴3小時(shí)，加入LB培養(yǎng)液400微升，42℃水浴2分鐘，冷卻后28℃振搖2小時(shí)。
2)將復(fù)蘇液100微升，涂布于LB-AMP-2％血漿的平板上，37℃培養(yǎng)過(guò)夜。次日見(jiàn)有菌落生長(zhǎng)。
用PCR鑒定含有目的基因的菌落。
該菌株命名為Pasteurella multocida C48-16/pGEX-KG-VP2。
3、傳染性法氏囊病病毒新型變異株VP2測(cè)序分析結(jié)果本毒株為具有很強(qiáng)致病性的超強(qiáng)毒株，其cDNA序列和推斷的氨基酸序列為atg aca aac ctg caa gat caa acc caa cag att gtt ccg ttc ata cgg48Met Thr Asn Leu Gln Asp Gln Thr Gln Gln Ile Val Pro Phe Ile Arg
1 5 10 15agc ctt ctg atg cca aca acc gga ccg gcg tcc att ccg gac gac acc 96Ser Leu Leu Met Pro Thr Thr Gly Pro Ala Ser Ile Pro Asp Asp Thr20 25 30cta gag aag cac act ctc agg tca gag acc tcg acc tac aat ttg act 144Leu Glu Lys His Thr Leu Arg Ser Glu Thr Ser Thr Tyr Asn Leu Thr35 40 45gtg ggg gac aca ggg tca ggg cta att gtc ttt ttc cct ggt ttc cct 192Val Gly Asp Thr Gly Ser Gly Leu Ile Val Phe Phe Pro Gly Phe Pro50 55 60ggc tca att gtg ggc gct cac tac aca ctg cag agc aat ggg aac tac 240Gly Ser Ile Val Gly Ala His Tyr Thr Leu Gln Ser Asn Gly Asn Tyr65 70 75 80aag ttc gat cag atg ctc ctg act gcc cag aac cta ccg gcc agc tac 288Lys Phe Asp Gln Met Leu Leu Thr Ala Gln Asn Leu Pro Ala Ser Tyr85 90 95aac tac tgc agg cta gtg agt cgg agt ctc aca gtg agg tca agc aca 336Asn Tyr Cys Arg Leu Val Ser Arg Ser Leu Thr Val Arg Ser Ser Thr100 105 110ctc cct ggt ggc gtt tat gca cta aat ggc acc ata aac gcc gtg acc 384Leu Pro Gly Gly Val Tyr Ala Leu Asn Gly Thr Ile Asn Ala Val Thr115 120 125ttc caa gga agc ctg agt gaa ctg aca gat gtt agc tac aat ggg ttg 432Phe Gln Gly Ser Leu Ser Glu Leu Thr Asp Val Ser Tyr Asn Gly Leu130 135 140atg tct gca aca gcc aac atc aac gac aaa att ggg aac gtc cta gta 480Met Ser Ala Thr Ala Asn Ile Asn Asp Lys Ile Gly Asn Val Leu Val145 150 155 160ggg gag ggg gta acc gtc ctc agc tta ccc aca tca tat gat ctt ggg 528Gly Glu Gly Val Thr Val Leu Ser Leu Pro Thr Ser Tyr Asp Leu Gly165 170 175tat gtg aga ctc ggt gac ccc att ccc gct ata ggg ctc gac cca aaa 576Tyr Val Arg Leu Gly Asp Pro Ile Pro Ala Ile Gly Leu Asp Pro Lys
180 185 190atg gta gca aca tgt gac agc agt gac agg ccc aga gtc tac act ata 624Met Val Ala Thr Cys Asp Ser Ser Asp Arg Pro Arg Val Tyr Thr Ile195 200 205act gca gcc gat gat tac caa ttc tca tca cag tac caa gca ggt ggg 672Thr Ala Ala Asp Asp Tyr Gln Phe Ser Ser Gln Tyr Gln Ala Gly Gly210 215 220gta aca atc aca ctg ttc tca gct aat atc gat gcc atc aca agc ctc 720Val Thr Ile Thr Leu Phe Ser Ala Asn Ile Asp Ala Ile Thr Ser Leu225 230 235 240agc atc ggg gga gaa ctt gtg ttt caa aca agc gtc caa ggc ctt ata 768Ser Ile Gly Gly Glu Leu Val Phe Gln Thr Ser Val Gln Gly Leu Ile245 250 255ctg ggt gct acc atc tac ctt ata ggc ttt gat ggg act gcg gta atc 816Leu Gly Ala Thr Ile Tyr Leu Ile Gly Phe Asp Gly Thr Ala Val Ile260 265 270acc aga gct gtg gcc gcg gac aat ggg cta acg gcc ggc act gac aac 864Thr Arg Ala Val Ala Ala Asp Asn Gly Leu Thr Ala Gly Thr Asp Asn275 280 285ctt atg cca ttc aat att gtg att cca acc agc gag ata acc cag cca 912Leu Met Pro Phe Asn Ile Val Ile Pro Thr Ser Glu Ile Thr Gln Pro290 295 300atc aca tcc atc aaa ctg gag ata gtg acc tcc aaa agt ggt ggt cag 960Ile Thr Ser Ile Lys Leu Glu Ile Val Thr Ser Lys Ser Gly Gly Gln305 310 315 320gcg ggg gat cag atg tca tgg tca gca agt ggg agc cta gca gtg acg 1008Ala Gly Asp Gln Met Ser Trp Ser Ala Ser Gly Ser Leu Ala Val Thr325 330 335atc cac ggt ggc aac tat cca ggg gcc ctc cgt ccc gtc aca cta gta 1056Ile His Gly Gly Asn Tyr Pro Gly Ala Leu Arg Pro Val Thr Leu Val340 345 350gcc tac gaa aga gtg gca aca ggg tct gtc gtt acg gtc gcc ggg gtg 1104Ala Tyr Glu Arg Val Ala Thr Gly Ser Val Val Thr Val Ala Gly Val
355 360 365agc aac ttc gag ctg atc cca aat cct gaa cta gca aag aac ctg gtc 1152Ser Asn Phe Glu Leu Ile Pro Asn Pro Glu Leu Ala Lys Asn Leu Val370 375 380aca gaa tac ggc cga ttt gac cca ggg gcc atg aac tac aca aaa ttg 1200Thr Glu Tyr Gly Arg Phe Asp Pro Gly Ala Met Asn Tyr Thr Lys Leu385 390 395 400ata ctg agt gag agg gac cgt ctt ggc atc aag acc gta tgg cca aca 1248Ile Leu Ser Glu Arg Asp Arg Leu Gly Ile Lys Thr Val Trp Pro Thr405 410 415agg gag tac act gac ttt cgc gag tac ttc atg gag gtg gcc gac ctc 1296Arg Glu Tyr Thr Asp Phe Arg Glu Tyr Phe Met Glu Val Ala Asp Leu420 425 430aac tct ccc ctg aag att gca gga gca ttt ggc ttc aaa gac ata atc 1344Asn Ser Pro Leu Lys Ile Ala Gly Ala Phe Gly Phe Lys Asp Ile Ile435 440 445cgg gcc ata agg 1356Arg Ala Ile Arg450在GenBank中與此序列最相近的IBDV序列有g(shù)i|6519813|dbj|AB024076.1|Identities＝1347/1356(99％)gi|9230678|gb|AF240686.1|AF240686 Identities＝1346/1356(99％)gi|1669530|dbj|D49706.1|Identities＝1345/1356(99％)gi|2262071|gb|L42284.1|IBDVKS Identities＝1344/1356(99％)gi|13957668|gb|AF262030.1|AF262030 Identities＝1340/1351(99％)gi|28629198|gb|AF533670.1|Identities＝1343/1356(99％)gi|1296812|emb|X92760.1|IBDVVP523 Identities＝1343/1356(99％)gi|20805925|gb|AF508176.1|Identities＝1342/1356(98％)4、Pasteurella multocida C48-16/pGEX-KG-VP2的誘導(dǎo)表達(dá)1)取Pasteurella multocida C48-16/pGEX-KG-VP2單菌落，接種于含2％雞血清的LB-AMP培養(yǎng)液中。28℃培養(yǎng)20小時(shí)。使菌體達(dá)到飽和。
2)取1％飽和菌液轉(zhuǎn)接于含2％雞血清的10毫升LB-AMP培養(yǎng)液中，28℃振蕩培養(yǎng)至出現(xiàn)明顯混濁物，加400微升0.5mol/L乳糖28℃培養(yǎng)16小時(shí)。
5、誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物的抗原性檢測(cè)1)將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入10毫升離心管中，5000g×10分鐘離心收集菌體。加1毫升TE重懸菌體。加50mg/ml溶菌酶20微升，1％Triton X-100，100微升，置37℃水浴1小時(shí)。
2)-70℃和室溫凍融3次。超聲波破碎10次，每次30秒。
3)4℃1000g×10分鐘，取上清液進(jìn)行抗原蛋白活性的檢測(cè)。
a、瓊脂免疫擴(kuò)散法檢測(cè)表達(dá)產(chǎn)物結(jié)果見(jiàn)圖2。
b、ELISA檢驗(yàn)結(jié)果使用中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所的標(biāo)準(zhǔn)IBDV陽(yáng)性抗血清，對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行了間接ELISA檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)下表

根據(jù)樣品OD值/空白對(duì)照OD值≥2.1為陽(yáng)性的判斷標(biāo)準(zhǔn)，樣品1在1/12800稀釋倍數(shù)時(shí)為陽(yáng)性(P/N＝2.50)；樣品2在1/12800稀釋倍數(shù)時(shí)為陽(yáng)性(P/N＝2.35)；樣品3在1/6400稀釋倍數(shù)時(shí)為陽(yáng)性(P/N＝2.87)。
6、攻毒保護(hù)實(shí)驗(yàn)1)材料試驗(yàn)雞，1日齡本地雞。IBDV標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒BC6/85株，購(gòu)自中國(guó)獸藥監(jiān)察所。IBD活疫苗，F(xiàn)ATRO S.P.A生產(chǎn)，購(gòu)自荊州市獸醫(yī)站。IBD瓊脂擴(kuò)散免疫沉淀試驗(yàn)(AGP)診斷抗原及陽(yáng)性血清，哈爾濱獸醫(yī)研究所研制。
2)方法a、試驗(yàn)雞飼養(yǎng)至9日齡，對(duì)每只雞采血，以AGP檢測(cè)血清中IBDV抗體。試驗(yàn)雞只IBD瓊擴(kuò)抗體應(yīng)為陰性。將健康、無(wú)IBD瓊擴(kuò)抗體的40只雞，隨機(jī)分為4個(gè)組，每組10只。A組，口服載有IBDV VP2重組質(zhì)粒的多殺性巴氏桿菌弱毒菌，2億個(gè)/只；B組，皮下注射口服載有VP2重組質(zhì)粒的多殺性巴氏桿菌弱毒菌，5千萬(wàn)個(gè)/只；C組，口服IBD活疫苗；D組，為空白對(duì)照組。在10日齡及20日齡各免疫兩次。
b、采血，在翅膀內(nèi)側(cè)針刺放血，以0.5ml塑管收集。在以IBDV標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒BC6/85株攻擊試驗(yàn)雞之前，對(duì)每只雞采血一次，析出血清供作AGP。
c、30日齡時(shí)，對(duì)全部試驗(yàn)雞感染IBDV標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒BC6/85株，口服，0.1ml/只(0.1gIBDV標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒BC6/85株稀釋為10ml)。IBDV標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒BC6/85株攻擊后72小時(shí)，剖殺全部試驗(yàn)雞，觀(guān)察法氏囊的異常變化。
d、免疫保護(hù)作用大小的判定，以法氏囊的病變程度為直接相關(guān)依據(jù)，以IBDV的AGP抗體的產(chǎn)生為間接相關(guān)依據(jù)。法氏囊的異常變化，在色澤上，有不同程度的黃色或紅色；在大小上，有不同程度的腫大，囊內(nèi)皺褶邊緣變圓；外表面漿膜下及囊腔內(nèi)有膠凍樣或干酪樣滲出物，或出血性炎癥。
.3)結(jié)果表I攻毒后剖檢法氏囊的變化組別試驗(yàn)雞明顯病變輕微病變正常只只％只％只％A 101 109 90B 102 208 80C 101 102 207 70D 105 503 302 20表I中，經(jīng)t檢驗(yàn)，A組與D組，B組與D組之間差異極顯著；C組與D組之間差異顯著。
表II IBD瓊脂擴(kuò)散免疫沉淀試驗(yàn)檢測(cè)AGP抗體的結(jié)果組別試驗(yàn)雞血樣陽(yáng)性血樣陰性血樣份份％份％A 1010100 0 0B 1010100 0 0C 109 901 10D 100 0 10100表I和表II中結(jié)果表明，將載有IBDV VP2重組質(zhì)粒的多殺性巴氏桿菌弱毒菌給雞口服和皮下注射，均可產(chǎn)生顯著的免疫保護(hù)作用，且可刺激雞的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生AGP抗體。
本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)和積極效果1、本基因工程菌可以預(yù)防雞傳染性法氏囊病和雞巴氏桿菌病，預(yù)防免疫效果好，且安全性非常好。
2、闡明了一種新型超強(qiáng)毒株的抗原蛋白基因序列，該序列可進(jìn)行基因工程抗原的應(yīng)用開(kāi)發(fā)。
3、可用本方法將Pasteurella multocida C48-16菌株開(kāi)發(fā)成其它基因工程疫苗。因?yàn)樵摼暝谖覈?guó)已經(jīng)開(kāi)發(fā)應(yīng)用了三十多年，到目前一直被認(rèn)為是非常安全低毒的活菌疫苗，作為疫苗開(kāi)發(fā)生產(chǎn)具有生產(chǎn)成本低的優(yōu)點(diǎn)。


中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心用于專(zhuān)利程序的培養(yǎng)物保藏受理通知書(shū)(收據(jù))分類(lèi)命名Pasteurella multocida C48-16/pGEX-KG-VP2保藏日期2003年6月19日保藏單位中國(guó)武漢武漢大學(xué)郵編430072保藏編號(hào)CCTCC NOM203056圖1為IBDV VP2基因擴(kuò)增電泳圖，其中1-擴(kuò)增IBDV VP2基因電泳顯色；2-200bp ladder電泳顯色；圖2為P.multocida C48-16/pGEX-KG表達(dá)產(chǎn)物瓊脂免疫擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)圖，其中3-IBDV瓊擴(kuò)陽(yáng)性血清(哈爾濱獸醫(yī)研究所)4-未稀釋表達(dá)產(chǎn)物；5-2倍稀釋表達(dá)產(chǎn)物；6-4倍稀釋表達(dá)產(chǎn)物；7-8倍稀釋表達(dá)產(chǎn)物；8-16倍稀釋表達(dá)產(chǎn)物；9-32倍稀釋表達(dá)產(chǎn)物。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明的應(yīng)用有
(1)用于雞傳染性法氏囊病和雞巴氏桿菌病的預(yù)防。用于雞傳染性法氏囊病的預(yù)防時(shí)應(yīng)按前述方法用乳糖進(jìn)行誘導(dǎo)后，收取細(xì)胞洗幾次后通過(guò)飲水方式或皮下注射方式進(jìn)行。飲水劑量相當(dāng)于飽和誘導(dǎo)菌液的1/3～1/2ml。皮下注射劑量相當(dāng)于飽和誘導(dǎo)菌液的1/10～1/20ml。
(2)用本發(fā)明的IBDV VP2基因序列進(jìn)行其它基因工程疫苗和基因工程抗原研究制備。
(3)可用P.multocida C48-16菌株作為其它基因工程疫苗的活載體菌進(jìn)行研究開(kāi)發(fā)。
權(quán)利要求
1.一種禽傳染性法氏囊病與巴氏桿菌病二價(jià)基因工程疫苗，其特征是Pasteurella multocida C48-16/pGEX-KG-VP2，CCTCC NOM203056；在pGEX-KG質(zhì)粒上連接有傳染性法氏囊病VP2蛋白基因，該菌在進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)后，通過(guò)口服或注射免疫雞可使雞體內(nèi)產(chǎn)生抗傳染性法氏囊病毒的抗體，在用標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒株攻毒時(shí)為雞提供保護(hù)作用。
2.一種傳染性法氏囊病毒新型野毒株的VP2基因序列，其特征是其DNA序列和推導(dǎo)的氨基酸序列atg aca aac ctg caa gat caa acc caa cag att gtt ccg ttc ata cgg48Met Thr Asn Leu Gln Asp Gln Thr Gln Gln Ile Val Pro Phe Ile Arg1 5 10 15agc ctt ctg atg cca aca acc gga ccg gcg tcc att ccg gac gac acc96Ser Leu Leu Met Pro Thr Thr Gly Pro Ala Ser Ile Pro Asp Asp Thr20 25 30cta gag aag cac act ctc agg tca gag acc tcg acc tac aat ttg act144Leu Glu Lys His Thr Leu Arg Ser Glu Thr Ser Thr Tyr Asn Leu Thr35 40 45gtg ggg gac aca ggg tca ggg cta att gtc ttt ttc cct ggt ttc cct192Val Gly Asp Thr Gly Ser Gly Leu Ile Val Phe Phe Pro Gly Phe Pro50 55 60ggc tca att gtg ggc gct cac tac aca ctg cag agc aat ggg aac tac240Gly Ser Ile Val Gly Ala His Tyr Thr Leu Gln Ser Asn Gly Asn Tyr65 70 75 80aag ttc gat cag atg ctc ctg act gcc cag aac cta ccg gcc agc tac288Lys Phe Asp Gln Met Leu Leu Thr Ala Gln Asn Leu Pro Ala Ser Tyr85 90 95aac tac tgc agg cta gtg agt cgg agt ctc aca gtg agg tca agc aca336Asn Tyr Cys Arg Leu Val Ser Arg Ser Leu Thr Val Arg Ser Ser Thr100 105 110ctc cct ggt ggc gtt tat gca cta aat ggc acc ata aac gcc gtg acc384Leu Pro Gly Gly Val Tyr Ala Leu Asn Gly Thr Ile Asn Ala Val Thr115 120 125ttc caa gga agc ctg agt gaa ctg aca gat gtt agc tac aat ggg ttg432Phe Gln Gly Ser Leu Ser Glu Leu Thr Asp Val Ser Tyr Asn Gly Leu130 135 140atg tct gca aca gcc aac atc aac gac aaa att ggg aac gtc cta gta480Met Ser Ala Thr Ala Asn Ile Asn Asp Lys Ile Gly Asn Val Leu Val145 150 155 160ggg gag ggg gta acc gtc ctc agc tta ccc aca tca tat gat ctt ggg528Gly Glu Gly Val Thr Val Leu Ser Leu Pro Thr Ser Tyr Asp Leu Gly165 170 175tat gtg aga ctc ggt gac ccc att ccc gct ata ggg ctc gac cca aaa576Tyr Val Arg Leu Gly Asp Pro Ile Pro Ala Ile Gly Leu Asp Pro Lys180 185 190atg gta gca aca tgt gac agc agt gac agg ccc aga gtc tac act ata624Met Val Ala Thr Cys Asp Ser Ser Asp Arg Pro Arg Val Tyr Thr Ile195 200 205act gca gcc gat gat tac caa ttc tca tca cag tac caa gca ggt ggg672Thr Ala Ala Asp Asp Tyr Gln Phe Ser Ser Gln Tyr Gln Ala Gly Gly210 215 220gta aca atc aca ctg ttc tca gct aat atc gat gcc atc aca agc ctc720Val Thr Ile Thr Leu Phe Ser Ala Asn Ile Asp Ala Ile Thr Ser Leu225 230 235 240agc atc ggg gga gaa ctt gtg ttt caa aca agc gtc caa ggc ctt ata768Ser Ile Gly Gly Glu Leu Val Phe Gln Thr Ser Val Gln Gly Leu Ile245 250 255ctg ggt gct acc atc tac ctt ata ggc ttt gat ggg act gcg gta atc816Leu Gly Ala Thr Ile Tyr Leu Ile Gly Phe Asp Gly Thr Ala Val Ile260 265 270acc aga gct gtg gcc gcg gac aat ggg cta acg gcc ggc act gac aac864Thr Arg Ala Val Ala Ala Asp Asn Gly Leu Thr Ala Gly Thr Asp Asn275 280 285ctt atg cca ttc aat att gtg att cca acc agc gag ata acc cag cca912Leu Met Pro Phe Asn Ile Val Ile Pro Thr Ser Glu Ile Thr Gln Pro290 295 300atc aca tcc atc aaa ctg gag ata gtg acc tcc aaa agt ggt ggt cag960Ile Thr Ser Ile Lys Leu Glu Ile Val Thr Ser Lys Ser Gly Gly Gln305 310 315 320gcg ggg gat cag atg tca tgg tca gca agt ggg agc cta gca gtg acg1008Ala Gly Asp Gln Met Ser Trp Ser Ala Ser Gly Ser Leu Ala Val Thr325 330 335atc cac ggt ggc aac tat cca ggg gcc ctc cgt ccc gtc aca cta gta1056Ile His Gly Gly Asn Tyr Pro Gly Ala Leu Arg Pro Val Thr Leu Val340 345 350gcc tac gaa aga gtg gca aca ggg tct gtc gtt acg gtc gcc ggg gtg1104Ala Tyr Glu Arg Val Ala Thr Gly Ser Val Val Thr Val Ala Gly Val355 360 365agc aac ttc gag ctg atc cca aat cct gaa cta gca aag aac ctg gtc1152Ser Asn Phe Glu Leu Ile Pro Asn Pro Glu Leu Ala Lys Asn Leu Val370 375 380aca gaa tac ggc cga ttt gac cca ggg gcc atg aac tac aca aaa ttg1200Thr Glu Tyr Gly Arg Phe Asp Pro Gly Ala Met Asn Tyr Thr Lys Leu385 390 395 400ata ctg agt gag agg gac cgt ctt ggc atc aag acc gta tgg cca aca1248Ile Leu Ser Glu Arg Asp Arg Leu Gly Ile Lys Thr Val Trp Pro Thr405 410 415agg gag tac act gac ttt cgc gag tac ttc atg gag gtg gcc gac ctc1296Arg Glu Tyr Thr Asp Phe Arg Glu Tyr Phe Met Glu Val Ala Asp Leu420 425 430aac tct ccc ctg aag att gca gga gca ttt ggc ttc aaa gac ata atc1344Asn Ser Pro Leu Lys Ile Ala Gly Ala Phe Gly Phe Lys Asp Ile Ile435 440 445cgg gcc ata agg1356Arg Ala Ile Arg450
3.一種制備禽傳染性法氏囊病與巴氏桿菌病二價(jià)基因工程疫苗的方法，其特征是1)病料RNA的提取取IBD病死雞法氏囊組織病料約1克，加液氮磨碎，用sangon UNIQ-10Trizol RNA抽提試劑盒進(jìn)行RNA提取；2)RT-PCR擴(kuò)增傳染性法氏囊病毒(IBDV)的VP2基因設(shè)計(jì)套式PCR引物，用外套引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和第一次PCR，用第一次PCR產(chǎn)物稀釋1000倍后用內(nèi)套引物進(jìn)行第二次擴(kuò)增；3)pMD18-T-VP2質(zhì)粒的構(gòu)建將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳并使用上海華舜生物工程有限公司生產(chǎn)的小量膠回收試劑盒進(jìn)行回收，將凝膠回收產(chǎn)物連接到pMD18-T質(zhì)粒載體上構(gòu)建成為pMD18-T-VP2質(zhì)粒，用此質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。4)構(gòu)建pGEX-KG-VP2質(zhì)粒將帶有pMD18-T-VP2質(zhì)粒的大腸桿菌DH5α的轉(zhuǎn)化菌進(jìn)行培養(yǎng)，質(zhì)粒提取，用限制性核酸內(nèi)切酶雙酶切后與同樣酶切的pGEX-KG質(zhì)粒進(jìn)行連接，得到pGEX-KG-VP2質(zhì)粒。用連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。然后進(jìn)行轉(zhuǎn)化子的篩選和培養(yǎng)及pGEX-KG-VP2質(zhì)粒的提取純化；5)用pGEX-KG-VP2質(zhì)粒轉(zhuǎn)化P.multocida C48-16P.multocida C48-16感受態(tài)細(xì)胞的制備挑取P.multocida C48-16單菌落于LB+2％血漿的培養(yǎng)液中，37℃振蕩培養(yǎng)至飽和；取培養(yǎng)液400微升，加于40毫升LB培養(yǎng)液中37℃振蕩培養(yǎng)3小時(shí)左右，至培養(yǎng)液OD600為0.1后置冰浴上冷卻；5000g×10min離心收集菌體。用0.1mol/L mops漂洗一次后加4毫升含50mmol/L CaCl2的0.1mol/L mops溶液重懸菌體，冰上放置20小時(shí)。將菌液在5000g×5min離心。去上清，用50mmol/L CaCl2的0.1mol/L mops重懸菌體，此為P.multocida C48-16感受態(tài)細(xì)胞；P.multocida C48-16的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)取P.multocida C48-16感受態(tài)細(xì)胞200微升，加pGEX-KG-VP21微克，冰浴3小時(shí)，加入LB培養(yǎng)液400微升，42℃水浴2分鐘，冷卻后28℃振搖2小時(shí)。將復(fù)蘇液100微升涂布于LB-AMP-2％血漿的平板上，37℃培養(yǎng)過(guò)夜；次日見(jiàn)有菌落生長(zhǎng)；用PCR鑒定含有目的基因的菌種；該菌種命名為Pasteurella multocida C48-16/pGEX-KG-VP2。
4.Psateurella multocida C48-16/pGEX-KG-VP2的應(yīng)用，其特征是1)用于雞傳染性法氏囊病和禽巴氏桿菌病的預(yù)防；2)用本發(fā)明的IBDV VP2基因序列進(jìn)行其它基因工程疫苗和基因工程抗原研究制備；3)可用P.multocida C48-16菌株作為其它基因工程疫苗的活載體菌進(jìn)行研究開(kāi)發(fā)。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)一種禽傳染性法氏囊病與巴氏桿菌病二價(jià)基因工程疫苗；涉及禽基因工程新疫苗。本新疫苗為一種加載了禽傳染性法氏囊病VP2蛋白基因的多殺性巴氏桿菌弱毒株，即Pasteurella multocida C
文檔編號(hào)A61K39/12GK1522760SQ0312537
公開(kāi)日2004年8月25日 申請(qǐng)日期2003年9月4日 優(yōu)先權(quán)日2003年9月4日
發(fā)明者榮俊, 程太平, 劉曉娜, 楊待建, 鄒國(guó)林, 俊 榮 申請(qǐng)人:長(zhǎng)江大學(xué)