專利名稱：一種體外誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞分化成為神經(jīng)細(xì)胞方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，涉及神經(jīng)細(xì)胞誘導(dǎo)的方法，具體涉及一種體外誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞分化成為神經(jīng)細(xì)胞方法，尤其涉及嘌呤衍生物(Purmorphamine)誘導(dǎo)01ig2+-GFP+-mES的神經(jīng)細(xì)胞分化的方法及其用途。
背景技術(shù)：
脊髓損傷(Spinal cord injury, SCI)是臨床常見(jiàn)的外傷性疾患之一。SCI的發(fā)生大多源于交通傷、墜落傷或運(yùn)動(dòng)傷等，近年呈上升趨勢(shì)。SCI —旦形成，常常導(dǎo)致嚴(yán)重的行為功能障礙，給患者、家庭和社會(huì)帶來(lái)極大負(fù)擔(dān)。近年來(lái)，再生醫(yī)學(xué)給脊髓損傷的治療帶來(lái)新的希望。胚胎干細(xì)胞(ESC)以其具有很強(qiáng)的增殖和分化能力，可被大量地誘導(dǎo)分化成為神經(jīng)元、少突膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞等優(yōu)勢(shì)，成為再生醫(yī)學(xué)移植供體的理想來(lái)源。但由于 胚胎干細(xì)胞直接移植體內(nèi)具有形成畸胎瘤的危險(xiǎn)，因此應(yīng)用胚胎干細(xì)胞移植治療脊髓損傷一般先在體外誘導(dǎo)分化出神經(jīng)前體細(xì)胞或神經(jīng)細(xì)胞，然后再移植進(jìn)脊髓組織，具體而言，目前臨床實(shí)施胚胎干細(xì)胞移植治療脊髓損傷的過(guò)程包括如下兩部分一是體外誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞分化成為純度高、數(shù)量多、有功能的神經(jīng)細(xì)胞；二是移植到脊髓內(nèi)的細(xì)胞可遷移、增殖以及與宿主組織形成很好的整合，從而發(fā)揮功能。當(dāng)前，胚胎干細(xì)胞的體外誘導(dǎo)分化方法中，還存在著誘導(dǎo)分化的細(xì)胞純度低、數(shù)量少等問(wèn)題。神經(jīng)分化的過(guò)程受多種信號(hào)通路的調(diào)控，其中音渭酸(Sonic hedgehog, SHH)信號(hào)通路起著重要的作用。嘌呤衍生物Purmorphamine是小分子化合物，已經(jīng)被證實(shí)能與SHH信號(hào)通路中的Smoothened結(jié)合，激活SHH信號(hào)通路，被認(rèn)為是SHH的替代物，在發(fā)育中起著重要的作用。目前已知，Olig基因是堿性螺旋一環(huán)一螺旋(basic helix-loop-helix,bHLH)轉(zhuǎn)錄因子家族的一員，包括Oligl和01ig2兩種，最初被認(rèn)為是少突膠質(zhì)細(xì)胞或其前體細(xì)胞特異性表達(dá)的基因而得名；01igl特異性地參與少突膠質(zhì)細(xì)胞的發(fā)育，而01ig2早在胚胎8. 5天時(shí)少突膠質(zhì)細(xì)胞尚未發(fā)生時(shí)就已經(jīng)表達(dá)。有研究表明，01ig2在脊髓胚胎發(fā)育中，位于腹側(cè)的2/3區(qū)域，在SHH(胚胎發(fā)育過(guò)程中由脊索產(chǎn)生的一種因子)的誘導(dǎo)下早期能促進(jìn)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元、抑制V2區(qū)中間神經(jīng)元的生成；后期則促進(jìn)少突膠質(zhì)細(xì)胞，抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞的生成，揭示01ig2與其它轉(zhuǎn)錄因子的協(xié)同作用共同調(diào)節(jié)神經(jīng)元和少突膠質(zhì)細(xì)胞的順序發(fā)生。目前，尚未見(jiàn)有關(guān)應(yīng)用Purmorphamine替代SHH,誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞分化,獲得純度高、數(shù)量多、有功能的脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元和少突膠質(zhì)細(xì)胞，以及Purmorphamine替代SHH,能否引起SHH信號(hào)通路、背-腹軸通路、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元和少突膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)育中相關(guān)基因的變化，同時(shí)誘導(dǎo)分化的少突膠質(zhì)前體細(xì)胞移植到脊髓損傷組織內(nèi)，能否與宿主整合，進(jìn)而遷移、分化來(lái)發(fā)揮修復(fù)損傷的作用的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞的方法，具體涉及一種體外誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞分化成為神經(jīng)細(xì)胞方法，尤其涉及嘌呤衍生物(Purmorphamine)誘導(dǎo)01ig2+-GFP+-mES的神經(jīng)細(xì)胞分化的方法。本發(fā)明的進(jìn)一步目的是提供所述的方法在制備修復(fù)脊髓損傷的制劑中的用途。本發(fā)明采用擬胚體介導(dǎo)的神經(jīng)誘導(dǎo)法，以01 i g2-GFP+-mES作為細(xì)胞模型，利用該細(xì)胞系在神經(jīng)誘導(dǎo)分化過(guò)程中表達(dá)少突膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子2 (Oligodendrocytetranscription factor 2, 01ig2)、并能方便觀測(cè)到綠色突光蛋白(Green FluorescentProtein, GFP)的表達(dá),從而,提供Purmorphamine結(jié)合低濃度的全反式維甲酸定向誘導(dǎo)分化為脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元和少突膠質(zhì)前體細(xì)胞的方法。本發(fā)明的目的通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)一、建立 01ig2+-GFP+-mES 細(xì)胞模型
在小鼠胚胎干細(xì)胞的01ig2基因上轉(zhuǎn)入GFP蛋白建立01ig2+-GFP+-mES細(xì)胞模型。采用無(wú)血清培養(yǎng)方式，以不同濃度的Purmorphamine誘導(dǎo)擬胚體(EBs),通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)、免疫細(xì)胞化學(xué)、FACs和RT-PCR等方法觀察其對(duì)胚胎干細(xì)胞定向分化為脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元和少突膠質(zhì)細(xì)胞的作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Purmorphamine可以完全替代SHH促進(jìn)胚胎干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞分化；促進(jìn)01ig2基因的表達(dá)；從而促進(jìn)在EB8D后向脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元分化，分化率超過(guò)50%，引起與脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元相關(guān)基因的表達(dá)變化；促進(jìn)在EB12D后向少突膠質(zhì)細(xì)胞分化，分化率超過(guò)80%，引起與少突膠質(zhì)細(xì)胞相關(guān)基因、背-腹軸通路和SHH信號(hào)通路相關(guān)基因的表達(dá)變化。二、建立大鼠脊髓撞擊傷模型證實(shí)獲得的細(xì)胞移植后的作用應(yīng)用NYU-Impactor II建立大鼠脊髓撞擊傷模型，將Purmorphamine誘導(dǎo)分化01ig2+-GFP+-mES獲得的01ig2+-GFP+-0PC移植到脊髓損傷組織內(nèi)，通過(guò)免疫組織化學(xué)、透射電鏡、Western blot、行為學(xué)和神經(jīng)電生理等方法觀察移植細(xì)胞是否促進(jìn)脊髓功能的恢復(fù)，證實(shí)獲得的細(xì)胞移植在脊髓損傷恢復(fù)中所起的作用。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Purmorphamine作為SHH的替代物，能有效地誘導(dǎo)01ig2+-GFP+-mES分化為高純度、有功能的脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元和少突膠質(zhì)細(xì)胞，并引起相關(guān)基因的改變；移植所誘導(dǎo)的01ig2+-GFP+-0PC可以促進(jìn)大鼠脊髓損傷后功能和形態(tài)的部分恢復(fù)，從而促進(jìn)脊髓損傷后再生和功能重建的作用，為臨床應(yīng)用細(xì)胞移植治療脊髓損傷提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。本發(fā)明中，所述的01ig2+-GFP+-mES是利用遺傳工程的方法，通過(guò)四環(huán)素誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)，在小鼠胚胎干細(xì)胞(Mouse embryonic stem cell,mESC)的01ig2基因座上插入GFP制成；其在神經(jīng)誘導(dǎo)分化過(guò)程中，能直觀地判斷誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞的出現(xiàn)和篩選，也便于細(xì)胞移植時(shí)，通過(guò)觀察GFP的表達(dá)來(lái)確定移植細(xì)胞在宿主體內(nèi)的遷移、分化和增殖等。本發(fā)明中，所述的01ig2+-GFP+-0PC是由Purmorphamine誘導(dǎo)分化01ig2+-GFP+-mES 制得。本發(fā)明的體外誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞分化成為神經(jīng)細(xì)胞方法，是采用擬胚體介導(dǎo)的神經(jīng)誘導(dǎo)法，即綜合RA誘導(dǎo)法和五步法使01ig2+-GFP+-mES向脊髓的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元和少突膠質(zhì)細(xì)胞分化的方法，其包括以下步驟①將01ig2+-GFP+-mES放入含有白血病抑制因子(LIF，20u/ml)的胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)2d ；
②放入含有全反式維甲酸RA (O. 5 μ Μ)和不同濃度Purmorphaine的神經(jīng)分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)4d ；③放入含有bFGF (10ng/ml)的神經(jīng)分化培養(yǎng)基分別培養(yǎng)2d和6d，采用熒光激活的細(xì)胞分選(FACs)篩選01ig2+-GFP+-陽(yáng)性細(xì)胞；④分別在神經(jīng)元培養(yǎng)基和少突膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，誘導(dǎo)生成脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元和少突膠質(zhì)細(xì)胞。本發(fā)明方法的步驟④中，所述的在神經(jīng)元培養(yǎng)基中培養(yǎng)為貼壁培養(yǎng)7 14d ;所述的在少突膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)為貼壁培養(yǎng)14d。本發(fā)明的方法中,Purmorphamine通過(guò)影響SHH信號(hào)通路和背-腹軸通路中的相關(guān)基因表達(dá)，分別通過(guò)上調(diào)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元和少突膠質(zhì)細(xì)胞的相關(guān)基因來(lái)誘導(dǎo)01ig2+-GFP+-mES定向分化為脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元和少突膠質(zhì)細(xì)胞；
誘導(dǎo)分化的01ig2+-GFP+_0PC移植到大鼠脊髓撞擊傷模型后能夠和宿主整合，在宿主體內(nèi)繼續(xù)增殖和分化，分化成為成髓鞘的少突膠質(zhì)細(xì)胞，促進(jìn)神經(jīng)絲蛋白和髓鞘蛋白的恢復(fù)，促進(jìn)髓鞘再生和神經(jīng)功能的恢復(fù)，顯著改善SCI大鼠愈后。本發(fā)明的神經(jīng)細(xì)胞分化的方法具有以下優(yōu)點(diǎn)①嘌呤衍生物Purmorphamine替代SHH,誘導(dǎo)01ig2+-GFP+_mES定向分化為脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元，誘導(dǎo)分化率超過(guò)50% ；②嘌呤衍生物Purmorphamine替代SHH，誘導(dǎo)Ol ig2+-GFP+_mES定向分化為少突膠質(zhì)細(xì)胞，誘導(dǎo)分化率超過(guò)80% ；③嘌呤衍生物Purmorphamine在01ig2+-GFP+_mES神經(jīng)誘導(dǎo)分化過(guò)程中引起運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元和少突膠質(zhì)細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)；④嘌呤衍生物Purmorphamine在01ig2+-GFP+_mES神經(jīng)誘導(dǎo)分化過(guò)程中引起SHH信號(hào)通路和背-腹軸通路中相關(guān)基因的表達(dá)；⑤應(yīng)用NYU脊髓致傷儀,成功構(gòu)建大鼠脊髓撞擊傷模型；⑥誘導(dǎo)得到的01ig2+-GFP+_0PC移植到脊髓損傷模型后，成功在宿主體內(nèi)進(jìn)行增殖并分化，分化為少突膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元，促進(jìn)髓鞘再生和神經(jīng)功能的恢復(fù)。


圖I是本發(fā)明中01ig2+-GFP+-mES和MEF的形態(tài)圖，其中，A C:01ig2+-GFP+-mES在MEF上生長(zhǎng)，克隆邊緣清晰，結(jié)構(gòu)緊密，隆起生長(zhǎng)，細(xì)胞間界線不清楚；A bar = 100 μ m ；B bar = 50 μ m ；C bar = 10 μ m ;★示 MEF, ▲示01ig2+-GFP+-mES。圖2是本發(fā)明中01ig2+-GFP+_mES的免疫熒光鑒定圖，其中，AmESC 的 Oct-3/4 和 Sox-I 的共標(biāo)；B mESC 的 Oct-3/4 和 Sox_2 的共標(biāo)，bar = 50 μ m ;免疫熒光染色顯示，01ig2+-GFP+-mES 細(xì)胞克隆的 Oct-3/4、Sox-I 和 Sox_2染色強(qiáng)陽(yáng)性，而01ig2+-GFP+-mES周圍的MEF完全不著色。圖3是本發(fā)明中01ig2+-GFP+_mES免疫熒光染色的陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)分析圖，其中，陽(yáng)性細(xì)胞百分率=陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/DAPI復(fù)染細(xì)胞總數(shù)。圖4表明01ig2+_GFP+_陽(yáng)性細(xì)胞在EB不同階段的表達(dá)，
其中，bar = 50 μ m，不同階段的EB均有上百個(gè)細(xì)胞組成，其形態(tài)基本為圓球形，表面不光滑；EB2D無(wú)01ig2表達(dá)，EB6D開(kāi)始表達(dá)01ig2，隨著誘導(dǎo)時(shí)間延長(zhǎng)，01ig2的表達(dá)逐漸增多，至EB12D 01ig2表達(dá)量最高。圖5 表明 Purmorphamine 誘導(dǎo) 01ig2 和 Nestin 的表達(dá)，其中，圖A EB6D神經(jīng)球01ig2和Nestin共表達(dá),bar = 100 μ m ;圖B :是A圖方框中的高倍圖，箭頭表示“玫瑰花環(huán)”的神經(jīng)管樣狀，bar = 25 μ m0圖6表明免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)01ig2和Hb9在EB8D的表達(dá)，其中，圖A:免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)01ig2和Hb9在不同處理組中的表達(dá)，bar =ΙΟΟμπι ;圖B :統(tǒng)計(jì)直方圖顯示EB8D，01ig2和Hb9在不同處理組中的陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)率；Purmorphamine 組與 SHH 組和 Control 組相比較，林P < O. 01。圖7表明免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)01ig2在神經(jīng)元不同階段的表達(dá)，·其中，圖A 01ig2和Tujl在神經(jīng)元不同階段的免疫熒光染色，a :表示神經(jīng)元前體細(xì)胞；b :表示成熟神經(jīng)元，bar = 100 μ m ;圖B :統(tǒng)計(jì)直方圖顯示，01ig2在神經(jīng)元不同階段的陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)率；神經(jīng)元前體細(xì)胞組與成熟神經(jīng)元組相比較，< O. 01。圖8表明免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元相關(guān)蛋白的表達(dá)，其中，圖A-a :倒置相差顯微鏡下觀察，bar = 50 μ m ；b :神經(jīng)元的Hb9陽(yáng)性表達(dá)，bar = 50 μ m ；c :神經(jīng)元的MNR2陽(yáng)性表達(dá)，bar = 100 μ m ；d :神經(jīng)元的Isll陽(yáng)性表達(dá)，bar=10 μ m ；e :神經(jīng)元的01ig2陰性表達(dá)，bar = 10 μ m ；f :神經(jīng)元的Hoxb4陽(yáng)性表達(dá)，bar =ΙΟμπι;圖B :統(tǒng)計(jì)直方圖顯示，脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元相關(guān)蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率。圖9表明RT-PCR檢測(cè)脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元相關(guān)基因的表達(dá)，其中，圖A :PCR產(chǎn)物的2%瓊脂糖凝膠電泳；圖B :RT_PCR半定量統(tǒng)計(jì)圖。圖10是相差顯微鏡下01ig2+-GFP+_0PC的形態(tài)，其中，a和b :相差顯微鏡下觀察,可見(jiàn)雙極或三極的OPC ；c和d分別為a和b的突光相差顯微鏡下觀察；a, c bar = 100 μ m ；b, d bar = 50 μ m。圖11是相差顯微鏡下01ig2+_GFP+_少突膠質(zhì)譜系的形態(tài)，其中，a :可見(jiàn)大量OPC從神經(jīng)球中遷出，bar = 50 μ m ;b :可見(jiàn)雙極的0PC, bar =50 μ m ；c :箭頭表示未成熟的少突膠質(zhì)細(xì)胞，bar = 25 μ m ；d :箭頭表示成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞，bar = 10 μ m。圖12是熒光相差顯微鏡下01ig2+_GFP+_少突膠質(zhì)譜系的形態(tài)，其中，a :可見(jiàn)大量OPC從球中遷出，bar = 50 μ m ；b :可見(jiàn)未成熟的少突膠質(zhì)細(xì)胞，箭頭表示未成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞，bar = 50 μ m ；c :示成熟的少突膠質(zhì)細(xì)胞,bar = 25 μ m ;d是c方框中的高倍圖，箭頭表示成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞，bar = ΙΟμπι。圖13是01ig2+_GFP+_成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞的免疫熒光染色，其中，a:少突膠質(zhì)細(xì)胞的01ig2和CNPase共表達(dá)，bar = 25 μ m;b :少突膠質(zhì)細(xì)胞的 01ig2 和 GC 共表達(dá)，bar = 25 μ m。圖14表明星形膠質(zhì)細(xì)胞不表達(dá)01ig2 (bar = 25 μ m)。圖15是SHH信號(hào)通路中相關(guān)基因在01ig2+-GFP+_mES神經(jīng)誘導(dǎo)分化過(guò)程中表達(dá)，其中，圖A :PCR產(chǎn)物的2 %瓊脂糖凝膠電泳；圖B :統(tǒng)計(jì)折線圖顯示，SHH信號(hào)通路中相關(guān)基因在神經(jīng)誘導(dǎo)分化過(guò)程中的表達(dá)變化。
圖16是背-腹軸中的相關(guān)基因在01ig2+-GFP+_mES神經(jīng)誘導(dǎo)分化過(guò)程中的表達(dá)，其中，圖A :PCR產(chǎn)物的2 %瓊脂糖凝膠電泳；圖B :統(tǒng)計(jì)折線圖顯示，背-腹軸中的相關(guān)基因在神經(jīng)誘導(dǎo)分化過(guò)程中的表達(dá)變化。圖17表明SCI行為學(xué)評(píng)分，其中，A =BBB評(píng)分；B =Tarlov評(píng)分；n = 6，與假手術(shù)組比較，*P < O. 05。圖18表明脊髓后索髓鞘相對(duì)光密度值(η = 12，< O. 01)。圖19表明移植細(xì)胞在SCI后脊髓組織內(nèi)分化，其中，A :01ig2和GFAP共表達(dá)；B :01ig2和NG2共表達(dá)，箭頭表示移植細(xì)胞是少突膠質(zhì)前體細(xì)胞；C 01ig2和MAP2共表達(dá)，箭頭表示移植細(xì)胞和神經(jīng)元共標(biāo)；D 01ig2和MBP共表達(dá)，箭頭表示移植細(xì)胞表達(dá)MBP，bar = 10 μ m。 圖20是脊髓后索髓鞘在移植前后的超微結(jié)構(gòu)，其中，A和B:假手術(shù)組，B是A的高倍圖，/示致密髓鞘；(和0:細(xì)胞移植前(即SCI后7d)，D是C中方框中的高倍圖，☆示空泡樣變性，▲示小膠質(zhì)細(xì)胞，★示變性的髓鞘，箭頭表示無(wú)髓鞘軸突；E和F :細(xì)胞移植組，*示少突膠質(zhì)細(xì)胞，箭頭表示再生的髓鞘結(jié)構(gòu)松散。圖21是細(xì)胞移植后SCI大鼠的Tarlov和BBB評(píng)分圖，其中，A :Tarlov評(píng)分；B BBB評(píng)分，η = 6，I示移植時(shí)間，*P < O. 05vs假手術(shù)組，▲ P < O. 05vs手術(shù)對(duì)照組。圖22是細(xì)胞移植前后SCI大鼠MEP檢測(cè)圖，其中，A :假手術(shù)組；B :細(xì)胞移植前(即SCI后7d) ；C :細(xì)胞移植后lw(即SCI后14d) ；D :細(xì)胞移植后2w(即SCI后21d) ；E :細(xì)胞移植后4w(SCI后35d) ；F MEP的潛伏期(ms) ；G MEP 的波幅(mv) ;n = 6。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例101ig2+-GFP+-mES的培養(yǎng)和鑒定1，實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞小鼠(CF-I)胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)，原代培養(yǎng)；，2，01ig2+-GFP+-mES細(xì)胞系由復(fù)旦大學(xué)長(zhǎng)江學(xué)者特聘教授張素春教授提供。，3，主要試劑明膠Gelatin、DAPI、DMSO :購(gòu)自 Sigma (美國(guó))；DME/F12谷氨酰胺、β -巰基乙醇、非必需氨基酸、丙酮酸鈉、胰酶-EDTA，胎牛血清(FBS):購(gòu)自Gibco BRL公司(美國(guó))；6孔和24孔細(xì)胞培養(yǎng)板、離心管、巴斯德吸管購(gòu)自Greiner公司(德國(guó))；突光封片劑購(gòu)自Vector公司(美國(guó))；小鼠抗0ct-3/4 抗體(Santa Cruz, SC-5279)、山羊抗 Sox2 抗體(R&D，AF2018)、山羊抗 Soxl 抗體(R&D, AF3369)；驢抗山羊熒光Alexa Fluor 594標(biāo)記IgG 二抗，驢抗小鼠熒光Alexa Fluor 488標(biāo)記IgG 二抗購(gòu)自Invitrogen公司(美國(guó))；其它試劑均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?，主要儀器設(shè)備
相差顯微鏡(Nikon-TS100),突光顯微鏡(Nikon-Eclipse TE 2000-S),濕度CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(Heraus)，超凈工作臺(tái)(蘇靜集團(tuán)安森公司)，Milli-Q超純水制備系統(tǒng)(MiIlipore, D-5623)，離心機(jī)(Eppendorf)，液氮罐(Mve)，凍存盒(Nalgene)。5，主要試劑配制表I小鼠胚胎成纖維培養(yǎng)基
試劑名稱體積終濃度
DMEM89ml89%
FBSIOml10%· I OOxNonessential Amino acidsI ml1%表2MEF凍存液
試劑名稱體積終濃度
DMEM6ml60%
FBS2ml20%
DMSO2ml20%表3胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)基
_試劑名稱__終濃度
DMEM87 ml87%
FBSIOml10%L-glutamine(200mM)+p-ME (55mM)I ml1%
Sodimn Pyruate (IOOmM)I ml1%
I OOxNonessential Amino acids I ml 1% _LJF_0.1 ml_lOQOU/ml表4胚胎干細(xì)胞凍存液
_試劑名稱_#|R_終濃度
mESC 培養(yǎng)基8ml80%
FBSIml10%
__DMSO _Iml10%6，實(shí)驗(yàn)方法I)小鼠胚胎干細(xì)胞的培養(yǎng)CF-I系小鼠購(gòu)于中科院細(xì)胞所，將雄性和雌性成年小鼠按I : 2于5:00PM左右合籠，第二天7:30AM前檢查陰栓，檢栓當(dāng)日中午記為孕O. 5d，取孕13. 5d小鼠胚胎分離胎鼠成纖維細(xì)胞(MEF)。
2)制備MEF飼養(yǎng)層MEF 分離(I)常規(guī)處理13. 5d孕鼠，獲得胚胎，去除胚胎外組織，用PBS洗胚胎三次；(2)常規(guī)處理胚胎組織；(3)將(2)的組織移至15ml離心管中，加入約5ml O. 25%胰酶溶液消化30min后，用MEF培養(yǎng)基終止；1000rpm，離心5min收集細(xì)胞；(4)接種細(xì)胞按照每只胚胎接種3瓶T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶的比例接種；(5)接種24h后更換新鮮MEF培養(yǎng)基。細(xì)胞匯合至90%時(shí)，部分凍存于液氮中，留作種子細(xì)胞；部分繼續(xù)擴(kuò)增培養(yǎng)(3代以內(nèi))，照射后凍存于液氮中，復(fù)蘇后直接作為飼養(yǎng)層細(xì)胞應(yīng)用。 MEF凍存MEF生長(zhǎng)至90%融合的細(xì)胞，吸去培養(yǎng)液，PBS清洗，加入O. 25 %胰酶-EDTA消化，用含血清的MEF培養(yǎng)基中止消化，細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至IOml離心管中，IOOOrpm,離心5min ;細(xì)胞沉淀用MEF凍存液重懸，移入凍存管，-80°C過(guò)夜，次日移入液氮罐中長(zhǎng)期保存，凍存的細(xì)胞密度為lX106cellS/cm2。MEF復(fù)蘇從液氮中取出細(xì)胞凍存管，浸入37°C水浴鍋，使冰晶融化，融化的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至裝有培養(yǎng)液的離心管中，吹打混勻，常溫，IOOOrpm,離心5min，細(xì)胞沉淀用MEF培養(yǎng)基重懸，細(xì)胞密度按照O. 7X105cellS/cm2接種于6孔培養(yǎng)板；第二天更換培養(yǎng)液，去除死細(xì)胞，2- 3d即可傳代，或制備飼養(yǎng)層。MEF照射MEF傳代培養(yǎng)2 4次后，用6ciCo Y處理照射，總劑量達(dá)8000rads，滅活其有絲分裂活性，照射后換新鮮的培養(yǎng)液，置37°C平衡至少4h，消化、以I X 106cells/cm2分支凍存于液氮中；使用時(shí)MEF需提前復(fù)蘇，接種至O. I %明膠包被的6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中即可，細(xì)胞密度按照O. 7X105cells/cm2接種。3)01ig2+-GFP+-mES 的培養(yǎng)將01ig2+-GFP+-mES細(xì)胞接種在MEF飼養(yǎng)層上，加入mESC培養(yǎng)基，37°C，5% CO2條件下培養(yǎng)，隔日更換培養(yǎng)液，3 4d傳代。(I)01ig2+-GFP+-mES 的消化、傳代提前Id制備MEF飼養(yǎng)層，于第2d吸去培養(yǎng)液，PBS清洗3次后，加入mESC細(xì)胞培養(yǎng)液，37°C培養(yǎng)箱中平衡至少lh，吸去mESCs細(xì)胞培養(yǎng)液，PBS清洗3次，加入O. 05%胰酶-EDTAlml，37°C水浴鍋中放置5min后，加入培養(yǎng)基終止消化，IOOOrpm,離心5min，以I X 104cells/cm2的密度傳代至含有mESC細(xì)胞培養(yǎng)液的六孔培養(yǎng)板上，剩余細(xì)胞用于EB的神經(jīng)誘導(dǎo)分化。(2)01ig2+-GFP+-mES 的凍存和復(fù)蘇胰酶法消化01ig2+-GFP+-mES, IOOOrpm,離心5min后去除上清，加入mESC凍存液制成細(xì)胞懸液，裝入凍存管，凍存盒中_80°C過(guò)夜，次日轉(zhuǎn)移到液氮中長(zhǎng)期保存；將凍存管由液氮中取出，浸入37°C水浴鍋，當(dāng)僅剩一小塊冰晶時(shí)，將凍存管取出，吸出細(xì)胞懸液，加入到預(yù)先備有9ml mESC細(xì)胞培養(yǎng)基的15ml離心管中，輕吹打使細(xì)胞混勻；常溫，IOOOrpm,離心5min，除去上清液，再重復(fù)用培養(yǎng)基洗一次；加入2ml細(xì)胞培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，逐滴接種至預(yù)先鋪有MEF并平衡后的6孔板中；隔24h后給細(xì)胞換液。4)免疫細(xì)胞化學(xué)染色
體外培養(yǎng)5 7d的01ig2+-GFP+-mES細(xì)胞，用免疫熒光細(xì)胞化學(xué)方法檢測(cè)細(xì)胞表面抗原0ct-3/4、Sox-I、Sox-2的表達(dá)，以確定其全能性和未分化性。(I)吸出培養(yǎng)基，用PBS洗3次，；(2)吸出PBS，加入4%多聚甲醛室溫固定20min ;(3)吸出固定液，用PBS洗3次，每次IOmin ；(4)加入 O. 3% Triton X-100，室溫靜置 15min ;PBS 洗 3 次，每次 IOmin ;(5)加入驢血清封閉，室溫靜置15min ；(6)吸出血清，加入相應(yīng)的一抗(I 2000抗Oct-3/4+l 2000抗Sox-Ι和抗Sox-2)，4°C冰箱過(guò)夜；PBS洗3次，每次IOmin ；
(7)加入驢抗山羊熒光Alexa Fluor 594標(biāo)記IgG 二抗和驢抗小鼠熒光Alexa Fluor 488 標(biāo)記 IgG 二抗，室溫靜置 60min ；(8)加入 DAPI (I 1000 稀釋)染細(xì)胞核 IOmin ；PBS 洗 3 次，每次 IOmin ；(9)封片劑封片，熒光顯微鏡下觀察、照相。5)陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)應(yīng)用ImageJ軟件對(duì)拍好的熒光照片進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。分別計(jì)數(shù)DAPI、0ct_3/4、Sox-U Sox-2的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)后，進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差(無(wú)土《S)表示，用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析處理，組間比較用t檢驗(yàn)。結(jié)果顯示,如圖I所示，原代MEF細(xì)胞不純，除有成纖維樣細(xì)胞外,還有神經(jīng)樣細(xì)胞、心肌細(xì)胞以及一些類型不明確的細(xì)胞；經(jīng)過(guò)細(xì)胞傳代后雜細(xì)胞迅速減少，傳2 3代后細(xì)胞成分趨于單一，均為成纖維細(xì)胞。經(jīng)6tlCo Y照射后，細(xì)胞失去增殖能力，貼壁培養(yǎng)可維持10 14d，照射后的細(xì)胞有序排列呈長(zhǎng)梭形或條帶狀，細(xì)胞之間相互接觸呈單層排列。細(xì)胞質(zhì)中央為卵圓形核，周邊向外伸出纖維狀偽足(見(jiàn)圖I中女)。作為mESC飼養(yǎng)層的適宜細(xì)胞密度為 O. 75X 105cells/cm2。01ig2+-GFP+-mES細(xì)胞在小鼠成纖維細(xì)胞即飼養(yǎng)層上呈團(tuán)聚狀生長(zhǎng)，細(xì)胞克隆呈典型集落狀生長(zhǎng)，呈圓形或橢圓形，克隆邊緣清晰、光滑，細(xì)胞體積小而排列緊密，呈圓形，核大、核仁清晰，細(xì)胞核/細(xì)胞質(zhì)比高?？寺≈苓吪cMEF飼養(yǎng)層界限清楚，無(wú)分化跡象(見(jiàn)圖I中▲)。一般接種2 3d后集落接近匯合狀態(tài)，需進(jìn)行傳代。傳代比例一般為I : 6
I 8。通過(guò)對(duì)長(zhǎng)期培養(yǎng)傳代的01ig2+-GFP+-mES定期檢測(cè)其特異性抗原的表達(dá)來(lái)鑒定該細(xì)胞的全能性、未分化性(如圖2所示)，并通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)其特異性標(biāo)志物Oct-3/4，Sox-I,Sox-2的陽(yáng)性率(如圖3所示)。統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明01ig2+-GFP+-mES的0ct_3/4，Sox-1, Sox-2的陽(yáng)性細(xì)胞率分別為84. 24±0· 04%,83. 28±0· 04%,85. 18±0· 05%，均超過(guò)80%，表明在此培養(yǎng)體系下的01ig2+-GFP+-mES能保持良好的全能性和未分化性。本實(shí)施例的結(jié)果表明，采用有飼養(yǎng)層的體外培養(yǎng)方式培養(yǎng)01 ig2+-GFP+-mESC，通過(guò)對(duì)胚胎干細(xì)胞相關(guān)基因0ct-3/4、Sox-1、Sox-2的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)0ct-3/4、Sox-I、Sox_2的細(xì)胞陽(yáng)性率均超過(guò)80%以上，表明該培養(yǎng)體系下的01ig2+-GFP+-mESC維持著未分化的狀態(tài)，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供可信的種子細(xì)胞。實(shí)施例2Purmorphamine誘導(dǎo)01ig2+-GFP+_mESC定向分化為脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元
I)細(xì)胞與實(shí)施例I相同。2)主要試劑和用品RA :購(gòu)自Sigma公司(美國(guó))；N2、B27、Neurobasal 培養(yǎng)基購(gòu)自 Gibco BRL 公司(美國(guó))；Purmorphamine :購(gòu)自 Calbiochem 公司(美國(guó))；bFGF、NT3、⑶NF、BDNF, PDGF-AA :購(gòu)自 R&D 公司(美國(guó))；RNA酶抑制劑、Oligo (dT)、dNTP、DNA聚合酶購(gòu)自Takara公司(中國(guó)大連)；弓丨物上海生工公司合成；M-MLV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、Total RNA抽提試劑用Trizol :購(gòu)自Invitrogen公司(美國(guó))；兔抗Tujl 抗體(Convance, PRB-435P)、小鼠抗 Tujl 抗體(Sigma, T8660)、山羊抗 Hb9 抗體(Santa cruz, SC-22542)、小鼠抗 MNR2 抗體(DHSB，81. 5C10)，兔抗 Isll 抗體(Chemicon, AB5754)，小鼠抗 Hoxb4 抗體(R&D, AF3369)，小鼠抗 Nkx2. 2 抗體(DHSB,74. 5A5),山羊抗 01ig2 抗體(Santa cruz, SC-19969)小鼠抗 Nestin 抗體(Chemicon,MAB353)；驢抗兔熒光Alexa Fluor 594標(biāo)記IgG 二抗，驢抗小鼠熒光Alexa Fluor 594標(biāo)記IgG 二抗購(gòu)自Invitrogen公司(美國(guó))；無(wú)RNA酶槍頭、離心管購(gòu)自Axyge公司(美國(guó))；其余用品與實(shí)施例I相同。3)主要實(shí)驗(yàn)儀器EPICS ALTRA流式細(xì)胞儀(Beckman)，PCR儀(Bio-Rad)，紫外凝膠成像分析儀(Syngene)，GS-800光密度掃描儀(BIO-RAD)，恒溫冰凍切片機(jī)CM1900 (LEICA)，高速臺(tái)式低溫離心機(jī)(Eppendorf)，電熱恒溫箱DHP-9052(上海華進(jìn)醫(yī)療器械有限公司)，Nanodrop2000超微量分光光度計(jì)(Thermo)。4)主要試劑配制表5 改良的神經(jīng)培養(yǎng)基(ModifiedNS Medium, MNS)
權(quán)利要求
1.一種體外誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞分化成為神經(jīng)細(xì)胞方法，其特征在于，采用擬胚體介導(dǎo)的神經(jīng)誘導(dǎo)法，以01ig2-GFP+-mES作為細(xì)胞模型，以嘌呤衍生物Purmorphamine結(jié)合全反式維甲酸定向誘導(dǎo)所述的01ig2-GFP+-mES細(xì)胞分化為脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元和少突膠質(zhì)前體細(xì)胞；包括下述步驟 ①將01ig2+-GFP+-mES放入含有白血病抑制因子LIF的胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)2天; ②放入含有全反式維甲酸RA和嘌呤衍生物Purmorphaine的神經(jīng)分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)4天; ③放入含有bFGF的神經(jīng)分化培養(yǎng)基分別培養(yǎng)2天和6天，采用熒光激活的細(xì)胞篩選01ig2+-GFP+-陽(yáng)性細(xì)胞； ④分別在神經(jīng)元培養(yǎng)基和少突膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，誘導(dǎo)生成脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元和少突膠質(zhì)細(xì)胞。
2.按權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述步驟①的01ig2+-GFP+-mES是利用遺傳工程的方法，通過(guò)四環(huán)素誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)，在小鼠胚胎干細(xì)胞的01ig2基因座上插入GFP制成。
3.按權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述步驟①的胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)基中含有白血病抑制因子LIF的濃度為20u/ml。
4.按權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述步驟②的神經(jīng)分化培養(yǎng)基中含有全反式維甲酸RA的濃度為O. 5μΜ。
5.按權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述步驟③的神經(jīng)分化培養(yǎng)基中bFGF的含量為 10ng/ml。
6.按權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述步驟④的在神經(jīng)元培養(yǎng)基中培養(yǎng)為貼壁培養(yǎng)7 14d。
7.按權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述步驟④的在少突膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)為貼壁培養(yǎng)14d。
8.按權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述的01ig2-GFP+-mES細(xì)胞分化為脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元，其分化率超過(guò)50%。
9.按權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述的01ig2-GFP+-mES細(xì)胞分化為少突膠質(zhì)細(xì)胞分化，其分化率超過(guò)80%。
10.權(quán)利要求I所述的方法在用于制備修復(fù)脊髓損傷的制劑中的用途。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，涉及一種體外誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞分化成為神經(jīng)細(xì)胞方法，尤其涉及嘌呤衍生物Purmorphamine誘導(dǎo)Olig2+-GFP+-mES的神經(jīng)細(xì)胞分化的方法及其用途。本發(fā)明采用擬胚體介導(dǎo)的神經(jīng)誘導(dǎo)法，以O(shè)lig2-GFP+-mES作為細(xì)胞模型，以嘌呤衍生物Purmorphamine結(jié)合全反式維甲酸定向誘導(dǎo)所述的Olig2-GFP+-mES細(xì)胞分化為脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元和少突膠質(zhì)前體細(xì)胞；經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，所述的Purmorphamine可作為SHH的替代物，有效地誘導(dǎo)Olig2+-GFP+-mES分化為高純度、有功能的脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元和少突膠質(zhì)細(xì)胞，并引起相關(guān)基因表達(dá)改變；移植實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，所誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞能促進(jìn)大鼠脊髓損傷后功能和形態(tài)的部分恢復(fù)，具有促進(jìn)脊髓損傷后再生和功能重建的作用。
文檔編號(hào)A61P25/00GK102899285SQ20111021742
公開(kāi)日2013年1月30日 申請(qǐng)日期2011年7月29日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月29日
發(fā)明者孫燕, 彭裕文, 張素春, 李瑞錫 申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)