專利名稱：給予體外部分成熟的樹突細胞治療腫瘤的制作方法
給予體外部分成熟的樹突細胞治療腫瘤本申請是申請?zhí)枮?00380108975. 6，申請日為2003年12月5日的同名申請的分
案申請。相關申請本申請要求于2002年12月6日申請的美國臨時申請60/431，267的優(yōu)先權，此處引入其全部內容作為參考。
背景技術：
樹突細胞(DCs)被認為是腫瘤主動免疫療法的首選載體。動物試驗表明，基于DC 的免疫療法具有保護小鼠免于生成腫瘤和消除已形成腫瘤的潛力。這種成功至少部分地重現(xiàn)于小規(guī)模的人體臨床試驗中。從小規(guī)模的安全性或理論驗證試驗，向闡明活性或有效性的大規(guī)模試驗的過渡，由于DC制備的艱巨和繁重而停滯不前(見下文)。因此，盡管這種產(chǎn)品具有很大的治療潛在性，很少有公司對開發(fā)基于DC的腫瘤疫苗感興趣。腫瘤內(IT)注射DCs是一種特殊形式的基于DC的免疫療法。注射后，DCs從凋亡或垂死的腫瘤細胞中攝取抗原，并遷移到淋巴結將抗原提呈給T細胞。實際上在動物模型中發(fā)現(xiàn)這種治療的有效性與腫瘤的凋亡程度相關(Cand ido等人，Cancer Res. 61 228-236,2001)，其表明這種方法與注射DCs前采用化學療法或放射療法治療腫瘤完全相容。此外，已有好幾個小組證明，這種聯(lián)合治療對已經(jīng)形成的腫瘤特別有效(Nikitina等人，Int. J. Cancer 94 :825-833, 2001 ；Tanaka 等人，Int. J. Cancer 101 :265-269,2002 ； Tong 等人，Cancer Res. 61 :7530-7535, 2001)。由于腫瘤細胞是抗原的來源，在腫瘤內注射前需要選擇和制備腫瘤抗原，就像目前它們在大多數(shù)體外基于DC治療的方法中應用的那樣。腫瘤抗原的選擇常常受公司對專有地位的要求所驅動，而迄今為止已鑒別的少數(shù)腫瘤抗原是否能提供顯著的臨床療效還有待證明。此外，使用這種腫瘤抗原通常產(chǎn)生單價疫苗，如果腫瘤細胞下調免疫抗原的表達水平，單價疫苗可能會失去其效力。當然，在符合優(yōu)良制造規(guī)范(GMP)要求的條件下制造腫瘤抗原的要求在傳統(tǒng)的基于DC免疫方法上增加了額外的費用。DC s的腫瘤內注射使樹突細胞處于免疫抑制的腫瘤環(huán)境中。已知腫瘤產(chǎn)生細胞因子，其滅活DC s或能夠使T細胞反應偏向效應較小的Th2-型反應。幾個研究小組使用遺傳修飾的DCs，以期克服這些抑制性影響，具體是通過產(chǎn)生細胞因子白介素12(IL-12 ； Nishioka 等人，Cancer Res. 59 :4035-4041,1999 ;Melero 等，Gene Therapy 6:1779-1784, 1999)或表達CD40配基(Kikuchi等人，Blood 96 :91-99,2000)。這些小組描述的結果令人鼓舞，進一步表明了腫瘤內注射DCs作為一種治療方法的可行性。Triozzi等人(Cancer 89 =2647-2654,2000)描述了轉移性黑色素瘤或乳腺癌患者的DCs IT注射。他們在4名黑色素瘤患者和2名乳癌患者中獲得了腫瘤消退的結果。消退病灶活組織檢查顯示浸潤的T細胞，表明DC實際已經(jīng)激活了針對腫瘤細胞的免疫反應。 所有這些數(shù)據(jù)表明人體腫瘤內注射DCs是可行的，可以提供顯著的臨床療效。然而，已觀察到MHC II類抗原和B7-2共刺激分子對注射的DCs有明顯的下調。這些關鍵性分子的下調將會降低DCs的免疫刺激潛力，但如本發(fā)明所提供的，這可以通過給藥前DCs的部分成熟而避免。DCs以未成熟形式存在于外周組織中，準備攝取和加工抗原。正是這些未成熟細胞，在GM-CSF和IL-4存在時，被單核細胞所產(chǎn)生的DCs最接近地模擬。多種刺激可啟動 DCs的成熟，成熟過程中細胞失去其有效攝取抗原的能力，而獲得其T細胞刺激功能。這一過程是復雜的，至少在體外要持續(xù)48小時才能完成。成熟的另一個結果是細胞遷移性質方面發(fā)生變化。例如，成熟誘導若干趨化因子受體，包括CCR7，CCR7引導細胞至流向淋巴結的 T細胞區(qū)域，在該區(qū)域內成熟的DCs激活T細胞，抵抗I類和II類MHC分子提呈至DC表面的抗原。誘導耐受性與DCs交叉提呈的(自身)抗原有關(Kurts等人，J. Exp. Med. 186 239-245，1997)，現(xiàn)在主要的假說假定未成熟DC不斷把抗原提呈給免疫系統(tǒng)，以維持耐受性(Kurts等人，J. Exp. Med. 184 :923_930，1996)，認為需要體內成熟DCs以產(chǎn)生有效的免疫刺激。現(xiàn)已明確DC成熟可能產(chǎn)生免疫刺激或免疫抑制性DCs (Chakraborty等人， Clin. Immunol. 94 =88-98,1999)。現(xiàn)今尚未闡明導致兩種結果中任何一種的成熟刺激物的確切性質，但普遍接受免疫刺激DCs產(chǎn)生IL-12并表達⑶40配基(Albert等人，Nature Immunol. 2 :988-989,2001 ；Lanzavecchia, Haematologica 84 Supp I. EHA 4 :23-25, 1999)。因此，部分成熟的DC應可用于IT注射，特別是當已知使未成熟樹突狀細胞成熟的刺激物可導致⑶40配基表達和IL-12的產(chǎn)生時。發(fā)明概述本發(fā)明提供一種方法，用于產(chǎn)生抗腫瘤免疫應答，包括給予含有已經(jīng)體外部分成熟的樹突細胞的細胞群體，以使個體在給藥后，部分成熟的樹突細胞保留攝取腫瘤抗原的能力并能誘導免疫應答。盡管腫瘤內整體的免疫抑制環(huán)境，本方法允許在腫瘤和腫瘤基床 (bed)內對腫瘤抗原的有效攝取和加工。由于對樹突細胞免疫刺激性的負面影響，這種免疫抑制環(huán)境會妨礙樹突細胞的功能。而且，不能給予腫瘤成熟的樹突細胞，因為該細胞不能有效地加工抗原。部分成熟的樹突細胞可直接給藥至已存在的腫瘤內。而且，可給藥至腫瘤基床、腫瘤內部和周圍的組織區(qū)域，可在治療即外科手術除去或切除腫瘤之前或之后進行，在化療、 放療或其組合治療之前、同時或之后進行，等等。部分成熟的樹突細胞還可以給藥至直接流向腫瘤或腫瘤周圍區(qū)域的淋巴結或淋巴區(qū)域。此外，部分成熟的樹突細胞可給藥至直接為腫瘤或腫瘤基床或腫瘤侵襲器官或具有腫瘤的器官輸送血液或淋巴液的循環(huán)血管或淋巴區(qū)域內。更進一步，部分成熟的樹突細胞通常可給藥至循環(huán)或淋巴系統(tǒng)，以便細胞能被運送到腫瘤區(qū)域。本發(fā)明可用的樹突細胞或其前體，可從例如皮膚、脾臟、骨髓、胸腺、淋巴結、臍帶血或外周血等中獲得。此外，樹突細胞可從待治療個體或與待治療個體HLA相匹配的健康個體獲得。在與成熟劑接觸并配制成用于個體給藥的組合物之前，樹突細胞或其前體可以冷凍保存。用于本發(fā)明方法的樹突細胞是在體外部分成熟的。用于誘導樹突細胞成熟的適當試劑包括，例如但不限于，卡介苗(BCG)、干擾素Y (I FN Y)、脂多糖(LPS)、腫瘤壞死因子a (TNFa);咪唑并喹啉化合物，例如咪唑并喹啉_4_胺化合物，如4_氨基_2_乙氧基甲基-α，α-二甲基-IH-咪唑并[4，5-c]_l-乙醇(命名為R848)或1_(2_甲基丙基)_1Η_咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺，及其衍生物(W000/47719，此處全部引用作為參考)，合成的雙鏈多核糖核苷酸，例如聚[I] 聚[C(12)U]，等等；Toll-樣受體(TLR)激動劑，例如TLR-3， TLR-4，TLR-7和/或TLR-9 ;含有已知誘導DC成熟的非甲基化CpG基序的核酸序列等，或其組合。用于本發(fā)明的BCG可包括完整BCG，BCG細胞壁成分，BCG-來源的 Iipoarabidomannans,或BCG任何其它組分。在某些實施方案中，BCG為熱滅活BCG或福爾馬林處理BCG。雖然作為選擇BCG可單獨使用，但一般BCG和IFNy聯(lián)合使用來誘導樹突細胞的部分成熟。BCG的有效量一般每毫升組織培養(yǎng)基約為IO5-IO7Cfu, IFN Y的有效量一般每毫升組織培養(yǎng)基約為100-1000單位。在另一個實施方案中樹突細胞活化劑為咪唑并喹啉R898。TLR-4激動劑R898的有效劑量通常使用大約1_50 μ g/ml，更常用每毫升組織培養(yǎng)基為5-10 μ g?？蓡为毷褂眠溥虿⑧部蓪⑵渑c例如有效量的BCG和/或IFN Y聯(lián)合使用。本發(fā)明還包括組合物，該復合物包含，在樹突細胞成熟劑存在條件下體外部分成熟的樹突細胞，與之結合的生理可接受的載體、緩沖液和/或賦形劑，用于患腫瘤個體給藥。本發(fā)明中組合物所用的部分成熟樹突細胞通常上調共刺激分子例如，但不限于CD80、 ⑶86或⑶54的表達。所述細胞可表達或不表達細胞表面標志⑶83，但仍能攝取和加工抗原。所述組合物通常包括約IO2-IOltl,也可包括更多部分成熟的樹突細胞。給藥個體前，樹突細胞部分成熟后可冷凍保存一段時間?？蓮哪[瘤患者體內分離細胞，用于制備本發(fā)明組合物包含的部分成熟樹突狀細胞，或從與患者HLA相匹配的個體分離細胞，用于制備部分成熟的樹突細胞。發(fā)明詳述樹突細胞是在多種淋巴和非-淋巴組織中發(fā)現(xiàn)的多種抗原提呈細胞。(見Liu， Cell, 106 :259-62(2001) ；Steinman, Ann. Rev. Immunol. 9 :271-96 (1991))。樹突細胞包括脾淋巴樹突細胞、表皮郎格罕氏細胞以及血液循環(huán)中的遮蔽(veiled)細胞。總起來說，根據(jù)其形態(tài)、表面II類MHC的高水平表達和缺少某些其它T細胞、B細胞、單核細胞和自然殺傷細胞表達的表面標志來劃分樹突細胞群。具體而言，單核細胞-來源的樹突細胞(也稱為單核細胞樹突細胞)通常表達⑶I lc、⑶80、⑶86，為HLA-DR+JSS⑶14'相反，單核細胞樹突細胞的前體(一般為單核細胞)通常為CD14+。單核細胞樹突細胞的前體可從任何存在它們的組織，具體而言淋巴組織，例如脾、骨髓、淋巴結和胸腺中獲得。單核細胞樹突細胞的前體也可從循環(huán)系統(tǒng)中分離。外周血也是單核細胞樹突細胞前體的易得來源。臍帶血是單核細胞樹突細胞前體的另一個來源?？蓮亩喾N有機體中分離單核細胞樹突細胞的前體，其中有機體內的免疫應答是可引發(fā)的。這類有機體包括動物，例如包括人類和非人類動物，例如靈長類動物、哺乳動物(包括犬、貓、小鼠和大鼠)、鳥類(包括雞)以及其轉基因物種。在某些實施方案中，可從健康受試者或需要免疫刺激的受試者體內，分離單核細胞樹突細胞的前體和/或未成熟的樹突細胞，例如如腫瘤患者或可能受益于或需要細胞免疫刺激的其它受試者(即細菌或病毒感染等等的受試者)。樹突細胞前體和/或未成熟的樹突細胞也可從HLA-匹配的健康個體獲得，用于部分活化和給藥至需要免疫刺激的HLA-匹配受試者。
樹突細胞前體和未成熟的樹突細胞本領域已知從多種來源包括血液和骨髓中分離富含樹突細胞前體和未成熟樹突細胞的細胞群體的方法。例如，可通過收集肝素抗凝血液、單采血液成分術或白細胞除去法、制備血沉棕黃層、形成玫瑰花結、離心、密度梯度離心(例如使用FieolI (例如 FICOLL- PAQUE ) >PERC0LL (膠體硅粒子(直徑15-30nm)包被非解析聚乙烯吡咯烷酮(PVP))、蔗糖等)、細胞差速裂解、過濾等，分離樹突細胞前體和未成熟樹突細胞。在某些實施方案中，可通過例如收集受試者血液，去纖維蛋白原以除去血小板并裂解紅細胞，制備白細胞群。可通過例如PERC0LL 梯度離心、抗體淘選(panning)等方法，任選性地對于單核細胞樹突細胞前體而富集樹突細胞前體和未成熟樹突細胞。任選性地可在密閉的無菌體系內制備樹突細胞前體和未成熟樹突細胞。此處所用術語"密閉的無菌體系"或"密閉系統(tǒng)"是指減少或消除其暴露于非無菌環(huán)境或循環(huán)空氣或其它非無菌情況。用于分離樹突細胞前體和未成熟樹突細胞的密閉系統(tǒng)，通常不包括在頂部開口試管中的密度梯度離心、室外細胞轉移、在組織培養(yǎng)平板或未密封搖瓶中細胞的培養(yǎng)等等。在一個代表性實施方案中，密閉系統(tǒng)容許在不暴露于非無菌空氣的情況下，將樹突細胞前體和未成熟樹突細胞從起始收集器中無菌轉移到可密封的組織培養(yǎng)皿內。另一個報導用于分離樹突細胞前體的方法是，采用商品化的處理塑料基質(例如小珠或磁性小珠)，選擇性去除附著的單核細胞及其它"非樹突細胞前體"(見例如美國專利號5，994，126和5，851，756)。棄去附著的單核細胞和非樹突細胞前體，保留非粘附細胞，用于體外培養(yǎng)和成熟。在另一方法中，單米血液成分術的細胞培養(yǎng)于塑料培養(yǎng)袋中，向其中加入塑料即聚苯乙烯或苯乙烯微載體珠以提高袋子的表面面積。細胞充分培養(yǎng)一段時間，至某些細胞粘附于珠上，而將非粘附細胞從袋中洗去。(Maffei等人,Transfusion 40: 1419-1420(2000) ；W0 02/44338，在此引入作為參考)。在某些其它實施方案中，單核細胞樹突細胞前體通過與單核細胞結合基質粘附而分離，如WO 03/010292所述，在此引入其公開內容作為參考。例如，白細胞群(例如通過白細胞除去法分離的)可與單核細胞樹突細胞前體的粘附基質接觸。當白細胞群與基質接觸時，白細胞群體中的單核細胞樹突細胞前體優(yōu)先粘附于基質上。其它白細胞(包括其它潛在性樹突細胞前體)結合基質親合力降低，從而容許單核細胞的樹突細胞前體優(yōu)先富集在基質表面上。適當?shù)幕|包括，例如表面面積與體積之比較大的那些基質?；|可以是例如微?；蚶w維狀基質。適當?shù)奈⒘；|包括，例如玻璃微粒、塑料微粒、玻璃包被的塑料微粒、玻璃包被的聚苯乙烯微粒及其他適于吸附蛋白質的珠粒。適于本發(fā)明使用的纖維狀基質包括微毛細管和微絨毛膜等等。微?；蚶w維狀基質通常在基本不降低粘附細胞存活力的情況下，容許將粘附的單核細胞樹突細胞前體洗脫下來。微?；蚶w維狀基質可以是基本無孔的， 以便從基質上洗脫單核細胞樹突細胞前體或樹突細胞。"基本無孔的"基質是指至少存在于基質中的大部分氣孔比細胞小，以使基質內誘捕的細胞減至最少。通過加入結合介質，可任選地增強單核細胞樹突細胞前體與基質的粘附。適當?shù)慕Y合介質包括單核細胞樹突細胞前體培養(yǎng)基(例如AM-V ,RPMI 1640,DMEM,X-VIVOl5 , 等等)，單獨或以任意組合補充例如細胞因子(例如粒細胞/巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、白細胞介素4 (IL-4)，或白細胞介素13 (IL-13));血漿、血清(例如人血清，如自體的或異源血清)；純化的蛋白質，如血清白蛋白；二價陽離子(例如鈣和/或鎂離子)；以及其它有助于單核細胞樹突細胞前體與基質特異性粘附的分子，或阻止非單核細胞樹突細胞前體與基質粘附的分子。在某些實施方案中，血漿或血清可經(jīng)加熱滅活。加熱滅活的血漿既可以是與白細胞同體的也可以是異體的。單核細胞樹突細胞前體粘附到基質上后，非粘附白細胞與單核細胞樹突細胞前體 /基質復合物分開。任何適當?shù)姆椒ň捎糜诜钦掣郊毎c復合物的分離。例如，可以沉淀非粘附白細胞和復合物的混合物，去除或排干非粘附白細胞和培養(yǎng)基上清液。作為選擇，可以離心混合物，去除或排干包含非粘附白細胞的上清液，使其與沉淀復合物分開。在另一方法中，可從富含白細胞的細胞群中分離單核細胞樹突細胞前體，其中白細胞利用切向流過濾裝置制備(如2003年6月19日申請，國際專利號PCT/US03/19428所述，此處引入作為參考)。用于分離富含單核細胞樹突細胞前體的細胞群體的切向流過濾裝置，可包含具有交互流動(cross-flow)室的移除單元、濾液室和位于二者之間的濾器。 濾器在一側截留表面和交互流動室進行流體交流，在另一側濾過表面和濾液室進行流體交流。交互流動室具有入口，適于將包括白細胞的血液成分樣品導入交互流動室，與濾器截留面平行。同時，交互流動室提供出口，居中置于槽內正對著濾器截留表面的部分。適合用于切向流過濾裝置的濾器平均孔徑通常約1-10微米。濾器平均孔徑可為約3-7微米。還可包括以設定樣品進入速率提供進入交叉流動室入口的裝置，以及控制濾液通過濾器進入濾液室的過濾速度的裝置。過濾速度控制裝置限制過濾速度低于濾器的非對抗過濾速度。包括血液組分在內的樣品，可由源裝置例如白細胞除去法裝置，或含有從白細胞除去法裝置收集的樣品的容器提供。單核細胞樹突細胞前體和用于前體富集的細胞群，可離體培養(yǎng)以分化、部分成熟和/或擴增。此處所用分離的未成熟樹突細胞、樹突細胞前體以及其它細胞，是指經(jīng)手工處理與其天然環(huán)境分開存在的細胞，而非天然產(chǎn)物。分離的細胞可以純化、半純化的形式存在，或處于非天然環(huán)境下。簡言之，離體分化一般包括在一種或多種分化劑存在的情況下， 培養(yǎng)單核細胞樹突細胞前體、或具有樹突細胞前體的細胞群。適當?shù)姆只瘎┛砂?，例如細胞生長因子(例如細胞因子如(GM-CSF)、白細胞介素4(IL-4)、白細胞介素7 (IL-7)、白細胞介素13(IL-13)和/或其組合)。在某些實施方案中，單核細胞樹突細胞前體分化形成單核細胞來源的未成熟樹突細胞。樹突細胞前體可在適當?shù)呐囵B(yǎng)條件下進行培養(yǎng)和分化。適當?shù)慕M織培養(yǎng)基包括， 但不限于，AM-V ，RPMI1640，DMEM，X-VIVO15 等等。可向組織培養(yǎng)基中補充血清、氨基酸、維生素、細胞因子如GM-CSF和/或IL-4、IL-7、IL-13、二價陽離子等等，以促進細胞的分化。在某些實施方案中，樹突細胞前體可培養(yǎng)于無血清培養(yǎng)基中。培養(yǎng)條件可任選排除任何動物來源的產(chǎn)物。典型的用于樹突細胞培養(yǎng)基的細胞因子組合包括GM-CSF和IL-4、IL-7 或IL-13，每種約500單位/ml。樹突細胞前體分化形成未成熟的樹突細胞時，表型類似于皮膚郎格罕氏細胞。未成熟的樹突細胞一般為⑶14_和⑶11c+，低水平表達⑶86和⑶83， 并能通過特異的細胞內吞作用俘獲可溶性抗原。樹突細胞成熟劑可包括，例如但不限于，BCG、IFN Y、LPS、TNF α、咪唑并喹啉化合物，例如咪唑并喹啉-4-胺化合物如4-氨基-2-乙氧基甲基- α，α - 二甲基-IH-咪唑并[4, 5-c]喹啉-I-乙醇(稱為R848)或I-(2-甲基丙基)-IH-咪唑并[4，5_c]喹啉_4_胺， 以及它們的衍生物(W000/47719，此處引入作為參考)；合成的雙鏈多核糖核苷酸，例如聚:聚[C(12)U]等;Toll-樣受體(TLR)激動劑，如TLR-3、TLR-4、TLR_7和/或TLR-9 ;包含已知誘導DC成熟的未甲基化CpG基序的核酸序列等，或其任意組合。BCG有效劑量一般為每毫升組織培養(yǎng)基大約105-107cfu。IFNy有效劑量一般為每毫升組織培養(yǎng)基約100-1000U。 卡介苗(BCG)為M. bovis的無毒株。用于此處的BCG指完整BCG以及細胞壁組分、BCG來源的Iipoarabidomannans以及其它BCG組分。BCG任選是滅活的,例如加熱滅活BCG、福爾馬林處理BCG等。咪唑并喹啉化合物例如咪唑并喹啉-4-胺化合物，如4-氨基-2-乙氧基甲基-α，α-二甲基-IH-咪唑并[4，5_c]喹啉_1_乙醇(稱為R848)的使用有效劑量為每毫升培養(yǎng)基約1-50 μ g，更典型地，每毫升培養(yǎng)基使用大約5-10 μ g。咪唑并喹啉化合物可單獨使用，或與例如BCG和/或IFN Y或其它TLR激動劑組合使用。一般未成熟DCs與有效劑量的樹突細胞成熟劑，例如BCG和IFN Y作用大約1_10 小時。完全成熟一般至少需要溫育24小時，更典型地溫育大約48-72小時。未成熟的樹突細胞可在適當?shù)呐囵B(yǎng)條件下進行培養(yǎng)和部分成熟。適當?shù)慕M織培養(yǎng)基包括:AIM-V 、RPMI 1640、DMEM、X_VIV015 等等?？上蚪M織培養(yǎng)基中補充氨基酸、維生素、細胞因子如GM-CSF 和/或IL-15、二價陽離子等，以促進細胞的成熟。典型的細胞因子組合為500單位/ml的 GM-CSF 和 100ng/ml 的 IL-15?？刹捎帽绢I域針對樹突細胞已知的方法來監(jiān)控未成熟樹突細胞的部分成熟?？刹捎帽绢I域熟知技術，如流式細胞術、免疫組織化學等，來檢測細胞表面標記物。還可以通過細胞因子的產(chǎn)生(例如通過ELI SA、其它免疫測定法或利用寡核苷酸陣列方法)來監(jiān)控細胞。在樹突細胞成熟劑，例如GM-CSF和IL-4存在情況下，根據(jù)本發(fā)明培養(yǎng)和部分成熟的 DCs中，可采用本領域熟知方法測定磷酸化JAK2(janus激活激酶2)的水平，以指示成熟的啟始。細胞表面標記物和細胞因子的誘導表達，以及信號分子磷酸化作用，例如jak2，也被看作樹突細胞適于給予個體以誘導免疫應答的指示劑。未成熟的樹突細胞僅成熟一段時間，以使樹突細胞部分成熟。完全成熟的DCs失去了攝取抗原的能力并上調共刺激性細胞表面分子以及多種細胞因子的表達。具體而言， 成熟DCs MHCI類和II類抗原的表達水平高于未成熟的樹突細胞，成熟的樹突細胞通常鑒定為⑶80+、⑶83+、⑶86+和CD14—。MHC高表達導致DC表面抗原密度增加，而共刺激分子 ⑶80和⑶86的上調，通過共刺激分子的對應物(counterpart)，例如T細胞上的⑶28，使T 細胞活化信號得以加強。用于本發(fā)明的部分成熟的樹突細胞，-般包括曾暴露于樹突細胞成熟劑，表現(xiàn)出共刺激分子——包括但不限于⑶80、⑶86和/或⑶54的表達上調的樹突細胞。該細胞可表達或不表達CD83，但保持攝取和加工抗原的能力。此外，部分成熟的樹突細胞可產(chǎn)生TNF- α、IL-6、IL-10和/或IL-12，一般未成熟樹突細胞不會產(chǎn)生這些分子。完全成熟的樹突細胞不是本發(fā)明的優(yōu)選，因為它們不能有效加工抗原。此外，用于現(xiàn)有方法中的未成熟樹突細胞也不是所需的，因為腫瘤內一般自然形成免疫抑制環(huán)境，包括已知會防止未成熟樹突細胞抗原加工的較大濃度的細胞因子。在本發(fā)明中，部分成熟的未成熟樹突細胞下調細胞表面上的細胞因子受體，降低它們對存在于腫瘤內部空間的細胞因子的免疫抑制影響的敏感性或反應性，使細胞可有效加工存在于腫瘤內的腫瘤抗原。一旦部分成熟的樹突細胞在腫瘤內成熟，其通過例如TNF-α和IL-12的產(chǎn)生、趨化因子受體CCR7的表達進行確定，細胞可遷移到淋巴結處，在那里細胞將與T細胞接觸，上調對腫瘤抗原的免疫應答。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，在成熟之前或部分成熟后給予患者之前，DCs可以保存， 例如低溫保存。可以使用的低溫保存劑，包括但不限于，二甲亞砜(DMSO)、甘油、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、白蛋白、葡聚糖、蔗糖、乙二醇(ethylene glycol)、i_赤蘚醇、D-核糖醇、 D-甘露醇、D-山梨糖醇、i-肌醇、D-乳糖、氯化膽堿、氨基酸、甲醇、乙酰胺、單乙酸甘油酯和無機鹽?？刂坡倮鋮s是非常關鍵的。不同的防冷凍劑和不同的細胞類型一般采用不同的最佳冷卻速率。一般應使水結成冰的融結(fusion)階段的熱減至最少。冷卻過程可利用，例如可程序控制的冷凍裝置或甲醇浴方法來完成。程序化冷凍裝置容許確定最佳冷卻速率，便于標準化并可以重復的冷卻。程序化控制速率冷凍器，例如Cryomed或Planar，可以將冷凍方式調整至所需的冷卻速率曲線。在徹底冷凍后，單核細胞前體細胞、未成熟的DCs或部分成熟的DCs，可迅速轉入長期的低溫保存容器內。在一個典型的實施方案中，樣品可低溫保存于液氮(_196°C) 或其蒸氣(_165°C)內。對于造血干細胞，具體而言自骨髓或外周血的造血干細胞，所述原則、操作、冷凍保存和長期保存，非常適合于本發(fā)明的細胞。其論述可參見，例如下面的參考文獻，在此引入作為參考Taylor等人，Cryobiology27 =269-78(1990) ；Gorin, Clinics in Haematology 15 19-48(1986) ；Bone -Marrow Conservation,Culture and Transplantation，Proceedings of a Panel，Moscow，Jul. 22—26，1968，International Atomic Energy Agency, Vienna,pp.107—186。 優(yōu)選地，冷凍細胞迅速解凍(例如保持于37-41 °C的水浴中)，解凍后立即冷卻。可能需要處理細胞以免解凍后細胞凝集?？墒褂枚喾N方法阻止凝集，包括但不限于，冷凍之前和/或之后加入DNase (Spitzer等Cancer 45 :3075-85 (1980))、低分子量葡聚糖和朽1檬酸鹽、輕乙基淀粉(Stiff等，Cryobiology 20 :17-24 (1983)),等等。如果防冷凍劑對人體有毒性，應在治療應用之前將其從解凍的部分成熟DCs中除去。一種除去防冷凍劑的方法是將其稀釋至極微濃度。冷凍的部分成熟DCs —經(jīng)解凍和恢復，即可按照本文關于非冷凍的部分成熟DCs的描述進行給藥。體內給予部分成熟的樹突細胞本發(fā)明提供了給予腫瘤患者部分成熟樹突細胞或富含這種細胞的細胞群體的方法。在某些實施方案中，通過獲得樹突細胞前體或未成熟的樹突細胞，在樹突細胞成熟劑， 例如BCG和IFN Y，或任一其它如上文列舉的成熟劑存在的情況下，分化和部分成熟這些細胞，來實現(xiàn)上述方法。部分成熟的樹突細胞可使用本領域技術人員熟知的方法和組合物與生理學可接受的載體、賦形劑、緩沖液或稀釋劑一起配制。部分成熟的樹突細胞可直接給與需要免疫刺激的患者。一般大約IO2-IOltl的細胞懸浮于藥物可接受的載體中。細胞直接注射入腫瘤，或注射入腫瘤或腫瘤基床近旁、鄰近或與腫瘤或腫瘤基床相接觸的循環(huán)或淋巴區(qū)域，以保證細胞可以接近腫瘤抗原。例如但不限于，細胞可直接給藥至腫瘤內、在外科手術除去或切除腫瘤后的腫瘤基床、腫瘤周圍、與腫瘤直接接觸的引流(draining)淋巴結、流向或供給腫瘤或腫瘤侵襲器官的血管或淋巴管內，例如門靜脈或肺靜脈或動脈等等?？稍谄渌[瘤治療，例如化療或放療的同時或之后，給予本發(fā)明的部分成熟的樹突細胞。此外，本發(fā)明部分成熟的樹突細胞可與其它試劑共同給藥，所述試劑起助劑作用，使樹突狀細胞成熟，和/或對腫瘤或靠近或鄰近腫瘤區(qū)域內的抗原進行加工。此外，樹突細胞還可以配制或混合到緩釋基質內，植入腫瘤或腫瘤基床內部或周圍區(qū)域，以便細胞緩慢釋放到腫瘤或腫瘤基床內部，與腫瘤抗原接觸?？刹捎萌魏芜m于給藥的劑型和方式給予本發(fā)明部分成熟的樹突細胞。例如，細胞可與藥物可接受的載體結合，可采用注射器、導管、插管等等給藥。如上所述，細胞可配制于緩釋基質內。當以這種方式給藥時，制劑可通過適于使用的基質的方法給藥。其它適用于本發(fā)明的給藥方法和方式為本領域技術人員所熟知。本發(fā)明的組合物可本身用于個體治療。此外，也可將組合物與任何其它方法組合使用來治療腫瘤。例如，本發(fā)明方法可與腫瘤外科手術切除術、化療(細胞毒性藥物，凋亡試劑，抗體等等)、放射療法、冷凍療法、近距療法、免疫療法(給予抗原特異性成熟的活化樹突細胞、NK細胞，腫瘤抗原特異性抗體等)等等組合使用。這些方法中的任一種或全部也可以任意組合使用。組合治療可以同時或順次進行，由治療醫(yī)師所確定的任何順序給藥。在另一個實施方案中，樹突細胞與受體受試者具有相同的MHC (HLA)單倍型。確定受試者HLA單倍型的方法為本領域已知。在相關實施方案中，部分成熟的樹突細胞與受體受試者是異體的。異體細胞一般與至少一個MHC等位基因相匹配(例如共有至少一個但并非所有MHC等位基因)。在一個不太典型的實施方案中，樹突細胞和受體受試者彼此完全是異體的，但都至少有一個共同的MHC等位基因。
實施例下列實施例僅用于說明本發(fā)明的各個方面，而不應以任何方式解釋為對本發(fā)明的限定。實施例I在本實例中，通過切向流過濾分離的單核細胞樹突細胞前體，用補充有2%人血清白蛋白(HSA)和500U/ml GM-CSF的X-VIVOl5 ,在培養(yǎng)瓶或細胞袋中以濃度為每毫升 IO6的單核細胞培養(yǎng)。5天后，來自培養(yǎng)瓶和細胞袋的DC S，或者留下不處理(iDCs)，或者在 BCG(1 :400稀釋)和干擾素Y (IFN y , 500U/ml) (pmDC s)存在條件下部分成熟4小時。收集細胞，洗滌并與等量放射熒光標記的PKH67-A549腫瘤細胞混合48小時。孵育后，洗滌細胞，用藻紅蛋白(PE)標記的CDllc特異性單克隆抗體進行染色，并經(jīng)流式細胞術分析。提供于表I的數(shù)值表示DC內的⑶Ilc+細胞，也即標記的PKH67抗原陽性細胞(MFI =平均熒光強度)的百分比。對照包括分析前剛與PKH67-A549細胞混合的DCs。表I.處理%CDllc+ PKH67+細胞MFIiDCs-培養(yǎng)瓶87. 6235. 2pmDCs-培養(yǎng)瓶90. 7610. 2iDCs-袋72. 8403. 5pmDCs-袋91. 3557. 5這些數(shù)據(jù)表明，如攝取抗原的細胞百分比或腫瘤細胞吸收物質的數(shù)值所測量的， 在本實驗中，部分成熟的DCs與未成熟的樹突細胞相比，在抗原攝取方面更好。在另一個實例中，經(jīng)外科手術除去生長腫瘤后，對患者進行了白細胞除去法。通過切向流過濾從白細胞除去法產(chǎn)物中純化單核細胞。純化的單核細胞如上所述進行分化和通過暴露于熱滅活和福爾馬林固定的BCG(5xl06cfu/ml) IFNy (500U/ml)部分成熟。配制用于給藥的部分成熟的樹突細胞，并在超聲引導下注射入個體腫瘤基床。體外測定發(fā)現(xiàn)，從個體分離的樹突細胞，能誘導腫瘤異性的細胞毒T細胞應答。此外，還發(fā)現(xiàn)腫瘤復發(fā)時間被阻滯或在很大程度是被推遲。實施例2在本實施例中，采用熟知方法將人結腸癌細胞移植給小鼠，使之產(chǎn)生異種移植腫瘤。腫瘤形成后，將動物分組，向每組動物腫瘤內給予安慰劑、未成熟的樹突細胞或者部分成熟的樹突細胞。隨后測定各組腫瘤的大小并進行比較。簡言之，通過向右肋腹皮下注射100，000個腫瘤細胞，在雌性Balb/c小鼠身上生成人CT26結腸癌腫瘤。治療開始于第15天，此時所有小鼠均已明顯帶有腫瘤，腫瘤大小為 10mm2-45mm2o按照標準方案從雌性Balb/c小鼠股骨髓制備樹突細胞。簡言之，紅細胞裂解后的骨髓細胞與鼠GM-CSF(200U/ml)和I L_4 (200U/ml)，在補充有10%胎牛血清的RPMI 1640 中孵育13-14天，在第3和第7天后加入含細胞因子的新鮮培養(yǎng)基。為獲得部分成熟的樹突細胞，將細胞暴露于稀釋400倍的滅活卡介苗(BCG)和每毫升500單位的鼠Y干擾素 (IFNy)中，其中滅活前BCG活性為每毫升O. 5-lxlO6菌落形成單位。細胞孵育8小時，然后用14.5%的甲泛葡胺(metrizamide)分層并于4 , 1750rpm離心15分鐘。收集交界面細胞，洗滌，在10%二甲亞砜(DMSO)中可存活地凍存于液氮內。在37°C下解凍后，細胞洗滌兩次，重懸，濃度為每50微升I百萬個細胞。在第15和17天腹膜內給予環(huán)磷酰胺處理荷瘤小鼠(50mg/kg)。在第16，17，18和 21天將樹突狀細胞注射到腫瘤內(模擬注射50 μ I的磷酸鹽緩沖鹽水、未成熟的DC或者成熟8小時的DC)。隔日測定腫瘤的生長，測60天。在磷酸鹽緩沖鹽水腫瘤內處理組中，第40天或之前全部4只小鼠腫瘤均大于 100mm2。相反，腫瘤內用未成熟DC處理的小鼠腫瘤生長減緩，第40天4只小鼠中有2只腫瘤小于100mm2。第40天用部分成熟DC處理的4只小鼠中有3只腫瘤小于100mm2，并且這些動物中有2只在第50天仍沒有明顯的腫瘤。實施例3在本實施例中，采用熟知方法將人結腸癌細胞注射給小鼠，使之產(chǎn)生異種移植腫
12瘤。在第一次注射腫瘤細胞后，再給予動物一個劑量的腫瘤細胞。15天后，將動物分組，向每組動物腫瘤內給予安慰劑、未成熟的樹突細胞或者部分成熟的樹突細胞。隨后測定各組腫瘤的大小并進行比較。簡言之，通過向右肋腹皮下注射100，000個腫瘤細胞，在雌性Balb/c小鼠身上生成人CT26結腸癌腫瘤。隨后在第3天向左肋注射100，000個腫瘤細胞。治療開始于第15 天，此時所有小鼠右肋腹均已明顯帶有腫瘤，腫瘤大小為10mm2-45mm2。按照標準方案從雌性Balb/c小鼠股骨髓制備樹突細胞。簡言之，紅細胞裂解后的骨髓細胞與鼠GM-CSF(200U/ml)和I L_4 (200U/ml)，在補充有10%胎牛血清的RPMI 1640 中孵育13-14天，在第3和第7天后加入含細胞因子的新鮮培養(yǎng)基。為獲得部分成熟的樹突細胞，將細胞暴露于400倍稀釋的滅活卡介苗(BCG)和每毫升500單位的鼠Y干擾素 (IFNy)中，其中滅活前BCG活性為每毫升O. 5-lxlO6集落形成單位。細胞然后用14.5% 的甲泛葡胺分層并于4°C，每分鐘1750rpm離心15分鐘。收集交界面細胞，洗滌，并在10% 二甲亞砜(DMSO)中可存活地凍存于液氮內。在37°C下解凍后，細胞洗滌兩次，重懸，濃度為每50微升I百萬個細胞。在第15和17天腹膜內給予環(huán)磷酰胺處理荷瘤小鼠(50mg/kg)。在第16，17，18和 21天，將樹突細胞注射到右肋腹腫瘤內(或者模擬注射50 μ I的磷酸鹽緩沖鹽水、未成熟的 DC、成熟8小時的DC或者成熟24小時的DC)。隔日測定腫瘤的生長，測60天。在磷酸鹽緩沖鹽水腫瘤內處理組中，全部5只小鼠在第35天之前右肋腹腫瘤大于 IOOmm2, 3/5的動物在第40天或之前左肋腹腫瘤大于100mm2。相反，用未成熟DC治療腫瘤內(僅右側)的小鼠腫瘤生長減緩一只小鼠在第60天雙側均無明顯腫瘤，并且5只小鼠中的4只在第40天雙側腫瘤均小于100mm2。用8小時部分成熟DC處理的5只小鼠中有3 只到第50天時腫瘤完全消解。用24小時部分成熟DC處理的組中腫瘤生長進一步下降。5 只小鼠中的3只在第50天雙側腫瘤完全消解，一只動物左肋腹腫瘤完全消解，右肋腹腫瘤部分控制(第40天< IOOmm2)，一只動物兩側腫瘤部分控制(第40天兩側都< 50mm2)。實施例4在本實施例中，如上所述用人腫瘤細胞在小鼠腫瘤身上產(chǎn)生異源腫瘤。通過將細胞暴露于咪唑并喹啉R898或R898聯(lián)合BCG和IFN Y的樹突細胞成熟劑，使分化的未成熟的樹突細胞部分成熟。向腫瘤內給予部分成熟的樹突細胞、未成熟的樹突細胞和安慰劑，比較各組腫瘤的大小。簡言之，按照實施例2在小鼠身上形成腫瘤。按照實施例2和3制備樹突細胞，不過部分成熟細胞是通過將細胞暴露于5 μ g/ml的免疫反應調節(jié)劑(樹突細胞成熟劑)R848， 或5 μ g/ml的免疫反應調節(jié)劑R848與實施例2和3所述濃度的BCG和干擾素Y中8小時而獲得。處理方法同實施例3。磷酸鹽緩沖鹽水腫瘤內注射的小鼠的腫瘤生長未得到控制。 單獨用R848部分成熟DC處理的5只小鼠中，有一只腫瘤生長完全消解，而聯(lián)合用R848與 BCG和IFNy部分成熟DC腫瘤內處理的5只小鼠中，有3只腫瘤生長完全消解。來自實施例3和4中腫瘤完全消解的9只小鼠，在腫瘤消退后約30天用I百萬個腫瘤細胞在右肋腹攻擊。沒有動物出現(xiàn)可檢測的腫瘤生長，表現(xiàn)出對CT26腫瘤細胞的免疫保護作用。實施例5
本實施例中，對以上實施例中制備的樹突細胞進行表面分子的表達檢定。簡言之， 實驗2-4制備的小鼠樹突細胞，通過熒光抗體染色后流式細胞術分析，來檢定細胞表面分子的表達。結果以表面標志表型陽性細胞的百分比和某表面標志的平均熒光強度表示，如表2和3。表權利要求
1.產(chǎn)生抗腫瘤免疫應答的方法，包括給予具有腫瘤的個體含有已經(jīng)體外部分成熟的樹 突細胞的細胞群，其中在個體給藥后，所述部分成熟的樹突細胞能夠攝取和加工抗原，并能 夠誘導抗腫瘤免疫應答。
2.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中樹突細胞從皮膚、脾臟、骨髓、胸腺、淋巴結、臍帶 血或外周血中獲得。
3.根據(jù)權利要求2所述的方法，其中樹突細胞從待治療個體獲得。
4.根據(jù)權利要求2所述的方法，其中樹突細胞從與待治療個體HLA相匹配的健康個體 獲得。
5.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中樹突細胞在樹突細胞成熟劑存在的條件下部分成熟。
6.根據(jù)權利要求5所述的方法，其中樹突細胞成熟劑為卡介苗(BCG)、干擾素、(I FNy)、脂多糖(LPS)、腫瘤壞死因子a (TNF a)、咪唑并喹啉化合物、合成的雙鏈多核糖核 苷酸、To 11-樣受體激動劑(TLR),含有已知誘導DC成熟的未甲基化CpG基序的核酸序列， 或其任意組合。
7.根據(jù)權利要求6所述的方法，其中BCG可包括完整BCG，BCG細胞壁成分，BCG-來源 的 lipoarabidomannans,或 BCG 組分。
8.根據(jù)權利要求6所述的方法，其中BCG為熱滅活BCG或福爾馬林-處理的BCG。
9.根據(jù)權利要求6所述的方法，其中有效劑量的BCG為每毫升組織培養(yǎng)基約 105-107cfu，有效劑量的I FNy為每毫升組織培養(yǎng)基大約100-大約1000單位。
10.根據(jù)權利要求6所述的方法，其中咪唑喹啉化合物為咪唑并喹啉-4-胺化合物。
11.根據(jù)權利要求10所述的方法，其中咪唑并喹啉-4-胺化合物為4-氨基-2-乙氧基 甲基-a，a-二甲基-1H-咪唑并[4，5_c]喹啉_1_乙醇，或1_ (2-甲基丙基)_1H_咪唑并 [4，5-c]喹啉-4-胺，或其衍生物。
12.根據(jù)權利要求6所述的方法，其中合成的雙鏈多核糖核苷酸為聚[I] 聚[C(12)U]。
13.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中部分成熟的樹突細胞直接給藥至腫瘤內。
14.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中部分成熟的樹突細胞給藥至外科手術除去或切 除腫瘤后的腫瘤基床內。
15.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中部分成熟的樹突細胞給藥至腫瘤周圍的組織區(qū)域。
16.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中部分成熟的樹突狀細胞給藥至直接引流腫瘤區(qū) 域的淋巴結內。
17.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中部分成熟樹突細胞直接給藥至為腫瘤或腫瘤侵 襲器官輸送血液或淋巴液的循環(huán)脈管內。
18.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中部分成熟的樹突細胞給藥至循環(huán)系統(tǒng)，以便細胞 可以輸送到腫瘤或腫瘤侵襲器官。
19.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中給予部分成熟樹突細胞作為放療、化療或其組合 的輔劑。
20.根據(jù)權利要求19所述的方法，其中在放療、化療或其組合治療之前、同時或之后給予部分成熟的樹突細胞。
21.一種組合物，包含在樹突細胞成熟劑存在條件下體外部分成熟的樹突細胞，與用于體內給藥的藥物可接受載體相結合。
22.根據(jù)權利要求21所述的組合物，其中部分成熟的樹突細胞上調共刺激分子CD80、 ⑶86和/或⑶54，并保留攝取和加工抗原的能力。
23.根據(jù)權利要求21所述的組合物，其中組合物包含大約IO2-大約101°的部分成熟樹突細胞。
24.根據(jù)權利要求21所述的組合物，其中部分成熟樹突細胞在部分成熟之后冷凍保存。
25.根據(jù)權利要求21所述的組合物，其中部分成熟樹突細胞從待給藥患者體內分離。
26.根據(jù)權利要求21所述的組合物，其中部分成熟樹突細胞與待給藥患者HLA相匹配。
27.根據(jù)權利要求21所述的組合物，其中部分成熟的樹突細胞直接給藥至腫瘤內。
28.根據(jù)權利要求21所述的組合物，其中部分成熟的樹突細胞給藥至外科手術除去或切除腫瘤后的腫瘤基床內。
29.根據(jù)權利要求21所述的組合物，其中部分成熟的樹突細胞給藥至腫瘤周圍的組織區(qū)域。
30.根據(jù)權利要求21所述的組合物，其中部分成熟的樹突細胞給藥至直接引流腫瘤區(qū)域的淋巴結內。
31.根據(jù)權利要求21所述的組合物，其中部分成熟樹突細胞直接給藥至為腫瘤、腫瘤基床或腫瘤侵襲器官輸送血液或淋巴液的循環(huán)脈管內。
32.根據(jù)權利要求21所述的方法，其中部分成熟的樹突細胞給藥至循環(huán)系統(tǒng)，以便細胞可以輸送到腫瘤、腫瘤基床或腫瘤侵襲器官。
全文摘要
本發(fā)明提供可用于腫瘤個體給藥的包含部分成熟樹突細胞的細胞群體。與樹突細胞成熟試劑作用約1-約10小時或更久的部分成熟的樹突細胞，可在腫瘤部位有效攝取和加工腫瘤抗原，并完全成熟，隨后可遷移至治療個體的淋巴結處。一旦到達淋巴結內，已完全成熟的抗原提呈樹突細胞分泌適當?shù)募毎蜃?例如TNFα和IL-12)，與T細胞作用誘導后續(xù)的抗腫瘤免疫應答。
文檔編號A61K35/36GK102600461SQ20121002770
公開日2012年7月25日 申請日期2003年12月5日 優(yōu)先權日2002年12月6日
發(fā)明者M·L·博希 申請人:西北生物治療藥物公司