專利名稱：從無聲桿捕鳥蛛中得到的阻斷鈣通道的多肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及從無聲桿捕鳥蛛(Theraphosidae aphonopelma)蜘蛛毒液中發(fā)現(xiàn)的多肽及基本上具有與上述多肽相同氨基酸順序和相同活性的多肽。該多肽及其可藥用鹽阻斷細(xì)胞(包括無脊椎動(dòng)物和脊椎動(dòng)物的各種生物的神經(jīng)細(xì)胞和肌細(xì)胞)中的鈣通道。本發(fā)明還涉及上述肽及其鹽本身阻斷細(xì)胞(例如生物的肌肉和神經(jīng)系統(tǒng)的細(xì)胞)中鈣通道和治療哺乳動(dòng)物的鈣通道介導(dǎo)的疾病與癥狀的用途。而且，本發(fā)明還涉及含有所述肽及其鹽的組合物。
鈣拮抗劑化合物具有廣泛的用途。已知鈣拮抗劑可臨床用于治療許多疾病，其中包括絞痛、高血壓、心肌病、室上性心律失常、食管馳緩不能(aesophogeal achalasia)、早產(chǎn)和雷諾病。見W.G.Nayler，Calcium Antagonists，Academic Press，Harcourt Brace Jovanovich Publishers，New York，NY 1988，本文引入其教導(dǎo)作為參考。并且，此類化合物用于細(xì)胞(如神經(jīng)和肌肉細(xì)胞)的生理學(xué)研究。
本發(fā)明涉及無聲桿捕鳥蛛蜘蛛毒液中發(fā)現(xiàn)的多肽。本發(fā)明的多肽及含有本發(fā)明多肽的級(jí)份如下無聲桿捕鳥蛛的肽6-6具有氨基酸順序，SEQ ID No∶1。
無聲桿捕鳥蛛的肽6-8具有氨基酸順序，SEQ ID No∶2。
無聲桿捕鳥蛛的肽7-6.1具有氨基酸順序，SEQ ID No∶3。
無聲桿捕鳥蛛的肽7-13.1具有氨基酸順序，SEQ ID No∶4。
無聲桿捕鳥蛛的肽7-13.2具有氨基酸順序，SEQ ID No∶5。
無聲桿捕鳥蛛的肽7-15.2具有氨基酸順序，SEQ ID No∶6。
無聲桿捕鳥蛛的肽7-17.1具有氨基酸順序，SEQ ID No∶7。
無聲桿捕鳥蛛的肽7-17.3具有氨基酸順序，SEQ ID No∶8。
無聲桿捕鳥蛛的肽7-17.4具有氨基酸順序，SEQ ID No∶9。
本發(fā)明的多肽阻斷細(xì)胞中鈣通道。因此，這些多肽本身可用于阻斷細(xì)胞中鈣通道。這些多肽也可用于控制無脊椎有害動(dòng)物及治療哺乳動(dòng)物中由細(xì)胞鈣通道功能介導(dǎo)的疾病和癥狀。
那些具有與上述多肽基本相同的氨基酸順序及基本相同的鈣通道阻斷活性的多肽也在本發(fā)明范圍之內(nèi)。
本發(fā)明還涉及含有上述多肽的藥物組合物和施用上述多肽的方法。
通過本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員熟知的電刺激擠取的一般方法，從無聲桿捕鳥蛛蜘蛛得到毒液。所用方法以防止全毒液被腹部的回流液和血液污染的方法為好。這種方法是本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員所熟知的。得到的全毒液冷凍存放(約-78℃)，直至用于如下述的精制。通過反相高效液相層析(HPLC)用不同的制備及半制備柱如C-4和C-18 Vydac
柱(Rainin Instrument co.Inc.，Mack Road，Woburn Massachusetts 01801)完成由全毒液開始的組份精制。在220-230nm處成單色光地進(jìn)行峰值測(cè)定?？梢杂萌鏦aters990二極管矩陣檢測(cè)器(Millipore Corporation，Waters Chromatography Division，34 Maple Street，Milford，Massachusetts 01757)收集的多色紫外數(shù)據(jù)將級(jí)份進(jìn)行進(jìn)一步分析。用已知方法如用ISCO/“FOXY”級(jí)份收集器和ISCO2159峰值檢測(cè)器(ISCO，4700 Superior，Lincoln，Nebraska 68504)收集柱級(jí)份。以適宜大小的容器如潔凈的聚乙烯實(shí)驗(yàn)室容器收集級(jí)份。這些級(jí)份的濃縮是通過凍干洗脫液然后凍干水完成的。然后通過層析分析(用分析柱，和比級(jí)份的最后精制過程所用的洗脫系統(tǒng)更為等效的梯度洗脫系統(tǒng))測(cè)定所得組份級(jí)份的純度。
本發(fā)明的多肽可以根據(jù)已知方法來測(cè)序。測(cè)定一級(jí)結(jié)構(gòu)的方法包括，例如下列步驟。1)為提高底物對(duì)酶進(jìn)攻的敏感性，將二硫鍵的半胱氨酸殘基還原并S-吡啶基化。2)通過一步或多步酶促消化，控制該肽的裂解。3)通過反相高效液相(H PLC)分離和精制肽片斷。4)通過N-末端測(cè)序及離子噴霧質(zhì)譜來描述肽片斷的特征。
例如，可以在溶液中將研究的多肽半胱氨酸殘基進(jìn)行S-吡啶基乙基化，然后進(jìn)行多肽的氨基酸測(cè)序。一種這類S-吡啶基乙基化方法可按下面的描述完成。
將約1至10μg的多肽溶于或稀釋到最多達(dá)50μl的緩沖液中，該緩沖液由1份1M Tris鹽酸緩沖液(pH8.5，含有4mM EDTA)和3份8M鹽酸胍混合而制得。加入2.5μl 10%的2-巰基乙醇水溶液，并將該混合物在氬氣氛下、室溫避光處培養(yǎng)兩小時(shí)。之后，加入2μl 4-乙烯基吡啶(存于-20℃氬氣中的新鮮試劑)并將該混合物于氬氣氛下、室溫避光處繼續(xù)培養(yǎng)2小時(shí)。然后將該混合物脫鹽，優(yōu)選通過一根短的、反相柱層析脫鹽。再根據(jù)已知方法對(duì)回收的烷基化的多肽測(cè)序。
得益于本文公開了關(guān)于由無聲桿捕鳥蛛的毒液中得到的存在于級(jí)份6-6，6-8，7-6.1，7-13.1，7-13.2，7-15.2，7-17.1，7-17.3和7-17.4中的肽，現(xiàn)在可以不通過全毒液分離/精制的方法得到上述肽。本發(fā)明的多肽可以通過克隆上述肽或其部分編碼順序使用重組DNA技術(shù)來生產(chǎn)。例如，按本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員熟知的方法，可以應(yīng)用利用了現(xiàn)在已知的上述多肽的氨基酸序列信息的雜交探針來克隆該完整多肽的編碼順序。結(jié)合重組DNA技術(shù)和體外蛋白質(zhì)合成，也可用于生產(chǎn)本發(fā)明的多肽。這類體外蛋白質(zhì)合成方法包括(但不限于)使用運(yùn)用了本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員熟知的標(biāo)準(zhǔn)Merrifield化學(xué)或其它固相化學(xué)方法的ABI 430A固相肽合成儀(Applied Biosystems，Inc.，850 Lincoln Center Drive，F(xiàn)oster City，California 94404)合成多肽。
本領(lǐng)域熟知，多肽中可以進(jìn)行某些不影響或基本不影響所述多肽功能的氨基酸替換。確切可能的替換因多肽不同而不同。根據(jù)本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員熟知的方法來確定可允許的替換。這樣，本發(fā)明的范圍包括了具有基本相同氨基酸順序和基本相同鈣通道阻斷活性的全部多肽。
本發(fā)明的多肽阻斷許多細(xì)胞中的鈣通道，例如無脊椎動(dòng)物和脊椎動(dòng)物的神經(jīng)及肌肉系統(tǒng)的細(xì)胞。
以下的方法證實(shí)了本發(fā)明的多肽阻斷鈣通道的能力。由8日齡大白鼠的小腦制備小腦粒細(xì)胞(Wilkin等.，Brain Res，115，181-199，1976)。用多-L-賴氨酸覆蓋Aclar小塊(1cm2)(Proplastics Inc.，5033 Industrial Ave.，Wall，NJ 07719)并置于含有1ml Eagles Basal介質(zhì)的12孔培養(yǎng)盤中。分離細(xì)胞，并將含有6.25×106個(gè)細(xì)胞的等分試樣加到含有Aclar小塊的每個(gè)孔中。鋪板后24小時(shí)加入胞嘧啶-β-D-阿拉伯呋喃糖苷(終濃度10μM)。該細(xì)胞用于在培養(yǎng)第6、7和8天的fura2分析。將細(xì)胞(附著于Aclar小塊上)轉(zhuǎn)移到含有1ml的2μM fura2/AM(于HEPES緩沖液中，該緩沖液含0.01%牛血清白蛋白、0.01%右旋糖，pH7.4，不含鎂)(Molecular Probes Inc.，Eugene，OR 97402)的12孔盤中。該細(xì)胞于37℃培養(yǎng)40分鐘;取出含fura2/AM的緩沖液并重新加入1ml不含fura2/AM的相同緩沖液。往一小石英杯中加入2.0ml預(yù)先溫?zé)?37℃)的緩沖液。將Aclar上的細(xì)胞加到該杯中并將該杯插入一個(gè)安有磁力攪拌器的保溫裝置中(37℃)，并用熒光分光光度計(jì)(Biomedical Instrument Group，University of Pennsylvania)檢測(cè)其熒光。使熒光信號(hào)穩(wěn)定約2分鐘。然后，將5-20μl合適濃度的受試化合物的磷酸緩沖鹽水標(biāo)準(zhǔn)溶液(PBS，pH7.4)加到該杯中。在完成每批測(cè)定中，使用Nemeth等建立的方法(J.Biol.Chem.，262，5188(1987)進(jìn)行熒光信號(hào)校正和fara2/AM滲漏校正。由加入伊屋諾霉素(35μM)測(cè)到了最大的熒光值(Fmax)，而隨后加入與鈣螯合的EGTA(12mM)測(cè)到了最小的熒光值(Fmin)。使用前述方法，加入本發(fā)明多肽，熒光降低，顯示出發(fā)生了本發(fā)明多肽對(duì)鈣通道的阻斷作用。使用該試驗(yàn)，本發(fā)明的多肽阻斷了鈣通道，在200nm下表現(xiàn)出低IC50值。為比較說明，兩種已知的商用鈣通道阻斷劑，硝苯吡啶和異搏定分別具有33nm和4800nm的IC50值。
本發(fā)明的多肽本身用作細(xì)胞中的鈣通道阻斷劑。因此，這些多肽也可用于控制無脊椎有害動(dòng)物的病害及治療哺乳動(dòng)物的由細(xì)胞中鈣通道功能介導(dǎo)的疾病和癥狀，例如絞痛、高血壓、心肌病、室上性心律失常、食管馳緩不能、早產(chǎn)和雷諾病。并且，這些肽用于細(xì)胞(包括(但不限于)神經(jīng)、肌肉和心血管系統(tǒng)的細(xì)胞)的生理學(xué)研究。
本發(fā)明多肽的可藥用鹽也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。此類鹽通過本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員熟知的方法生成。例如，多肽的酸式鹽可通過常規(guī)方法來制備。
當(dāng)給哺乳動(dòng)物施用本發(fā)明的多肽時(shí)，依一般藥用慣例，本發(fā)明多肽可以單獨(dú)使用或與可藥用載體或稀釋劑結(jié)合使用。該多肽可口服或經(jīng)非胃腸道給藥，但多肽優(yōu)選非胃腸道給藥途徑。非胃腸道給藥包括靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下和局部給藥。
用于口服的本發(fā)明多肽，例如可以以片劑或膠囊劑形式、或作為水溶液劑或懸濁劑形成服用該化合物。用于口服的片劑情形時(shí)，通常用的載體包括乳糖和玉米淀粉，也常加入潤(rùn)滑劑，如硬脂酸鎂。用于口服的膠囊形式中，有利的稀釋劑是乳糖和干玉米淀粉。當(dāng)需口服水懸濁劑時(shí)，將活性成份與乳化劑和懸浮劑混合。如果需要，也可加入某些甜味劑和/或調(diào)味劑。
用于肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下和靜脈內(nèi)，通常要制備該活性成份的無菌溶液劑，并且該溶液劑的pH應(yīng)當(dāng)適當(dāng)調(diào)節(jié)并緩沖。靜脈內(nèi)使用時(shí)，應(yīng)控制溶質(zhì)的總濃度，以使得該制劑等滲。
當(dāng)本發(fā)明的多肽或其鹽用于人類對(duì)象時(shí)，一般應(yīng)由處方醫(yī)師來確定每日劑量。并且，該劑量隨患者個(gè)體的年齡、體重和反應(yīng)，以及患者癥狀的嚴(yán)重程度和所施用的具體化合物的效能不同而不同。
當(dāng)本發(fā)明的多肽或其鹽用于控制無脊椎有害動(dòng)物時(shí)，將上述多肽直接施用于上述無脊椎動(dòng)物或?qū)⑸鲜龆嚯氖┯玫缴鲜鰺o脊椎有害動(dòng)物環(huán)境中。例如，可將本發(fā)明的化合物以溶液形式噴灑于上述無脊椎動(dòng)物。控制上述無脊椎動(dòng)物所需的化合物劑量隨無脊椎動(dòng)物及環(huán)境條件不同而不同，并決定于人們所用的化合物。
當(dāng)本發(fā)明的多肽或其鹽用于細(xì)胞的生理研究時(shí)，按照本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法給細(xì)胞施用上述多肽。例如，可在合適的生理緩沖液中給細(xì)胞施用上述多肽。此類研究所用的本發(fā)明多肽的適宜濃度為200μM。但是，在此類研究中上述肽的濃度可以大于或大大低于200μM。本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員可按熟知的方法來確定所施用多肽的量。
實(shí)施例第Ⅰ步，無聲桿捕鳥蛛的天然毒液的分級(jí)分離將無聲桿捕鳥蛛的天然毒液(約40μl)上樣至反相HPLC柱(Vydac
，C-18，300
，22×250mm)并使用雙相線性梯度系統(tǒng)洗脫(從95%A和5%B至80%A和20%B洗脫30分鐘，然后從80%A和20%B至30%A和70%B洗脫25分鐘(A＝0.1%三氟乙酸(TFA)，B＝乙腈))，在波長(zhǎng)為220nm處檢測(cè)，流速為15ml/分。按如下規(guī)定收集了級(jí)份。
表1級(jí)份6 35.9至37.3分鐘級(jí)份7 37.3至39.5分鐘級(jí)份8 39.5至40.1分鐘級(jí)份9 40.1至40.9分鐘級(jí)份10 40.9至41.8分鐘通過凍干濃縮了分段合并的上面每組級(jí)份。如下述進(jìn)行進(jìn)一步分級(jí)分離。
第Ⅱ步，第Ⅰ步級(jí)份的細(xì)分級(jí)分離A)級(jí)份6的細(xì)分級(jí)分離將由約60μl天然毒液經(jīng)上述第Ⅰ步得到的級(jí)份6樣品上樣至反相HPLC柱(Baker WP C-18，4.6×250mm)，用85%A和15%B至65%A和35%B的線性梯度洗脫系統(tǒng)洗脫45分鐘(A＝0.1%TFA，B＝乙腈)，在220nm處檢測(cè)，流速為1.0ml/分。按下述規(guī)定收集了級(jí)份。
表2級(jí)份6-6 24.0至24.8分鐘級(jí)份6-7 25.0至25.4分鐘級(jí)份6-8 25.6至26.5分鐘級(jí)份6-9 27.0至28.7分鐘級(jí)份6-13 33.5至34.4分鐘級(jí)份6-14 34.4至35.4分鐘經(jīng)凍干濃縮了分段合并的上面各組級(jí)份。
B)級(jí)份7的細(xì)分級(jí)分離將從約60μl天然毒液經(jīng)上述第Ⅰ步處理得到的級(jí)份7樣品上樣于強(qiáng)陽離子交換柱(磺乙基天冬酰胺(The Nest Group，45 Valley Rd.，Southborough，MA 01772)，5μ，4.6×200mm)，使用從100%A和0%B至0%A和100%B的線性梯度系統(tǒng)洗脫45分鐘(A＝5mM H3PO4/20%乙腈，B＝5mM H3PO4，1.0M NaCl/20%乙腈)，于230mm處檢測(cè)，流速為1.0ml/分。按下述規(guī)定收集了級(jí)份。
表3級(jí)份7-6 21.9至22.3分鐘級(jí)份7-9 24.8至25.5分鐘級(jí)份7-11 26.1至26.7分鐘級(jí)份7-12 27.1至27.6分鐘級(jí)份7-13 27.6至28.9分鐘級(jí)份7-14 29.7至30.8分鐘級(jí)份7-15 31.0至32.3分鐘級(jí)份7-16 32.5至33.1分鐘級(jí)份7-17 34.2至36.0分鐘經(jīng)凍干濃縮了分段收集的上述各組級(jí)份。
C)級(jí)份8的分級(jí)分離將從約100μl天然毒液經(jīng)上述第Ⅰ步分離得到的級(jí)份8樣品物質(zhì)上樣至反相H PLC柱(Vydac
，C-18，300
，10×250mm)，以線性梯度洗脫系統(tǒng)進(jìn)行洗脫從80%A和20%B至71%A和29%B洗脫35分鐘，然后用71%A和29%B洗脫10分鐘(A＝0.1%TFA，B＝乙腈)，在220nm處檢測(cè)，流速為6.0ml/分。按下規(guī)定收集了級(jí)份。
表4級(jí)份8-5 19.2至21.2分鐘級(jí)份8-6 21.3至22.5分鐘級(jí)份8-7 25.9至26.5分鐘級(jí)份8-8 27.4至28.3分鐘經(jīng)凍干濃縮了分級(jí)合并的上述各組級(jí)份。
第Ⅲ步，第Ⅱ步級(jí)份的細(xì)分級(jí)分離。
A)級(jí)份7-6的細(xì)分級(jí)分離將由約70μl天然毒液經(jīng)上述第Ⅱ-B步處理得到的級(jí)份7-6樣品上樣至反相HPLC柱(Vydac
，C-18，300
，10×250mm)，并用線性梯度系統(tǒng)展開用90%A和10%B洗脫10分鐘，然后用90%A和10%B至60%A和40%B洗脫40分鐘(A＝0.1% TFA，B＝乙腈)，在220nm處檢測(cè)，流速為3.5ml/分。如下規(guī)定收集了級(jí)份。
表5級(jí)份7-6.1 32.2至34.3分鐘級(jí)份7-6.2 35.5至36.2分鐘經(jīng)凍干濃縮分段收集的上每組級(jí)份。
B)級(jí)分7-9的細(xì)分級(jí)分離將從約300μl天然毒液經(jīng)上述第Ⅱ-B步驟得到的級(jí)份7-9樣品上樣至反相HPLC柱(Vydac
，C-18，300
，10×250mm)，用線性梯度系統(tǒng)進(jìn)行洗脫用90%A和10%B洗脫10分鐘，然后用90%A和10%B至65%A和35%B洗脫40分鐘(A＝0.1% TFA，B＝乙腈)，在220nm處檢測(cè)，流速為3.5ml/分。收集洗脫時(shí)間從33至35分鐘的洗脫級(jí)份，并合為級(jí)份7-9.1。
C)級(jí)份7-11的細(xì)分級(jí)分離將由約600μl天然毒液經(jīng)上述第Ⅱ-B步得到的級(jí)份7-11樣品上樣至反相HPLC柱(Vydac
，C-18，300
，10×250mm)，用線性梯度系統(tǒng)進(jìn)行洗脫(90%A和10%B洗脫10分鐘，然后用90%A和10%B至65%A和35%B洗脫60分鐘(A＝0.1% TFA，B＝乙腈)，在220nm處檢測(cè)，流速為3.5ml/分。收集洗脫時(shí)間從34.2至35.5分鐘的洗脫級(jí)份，合并為級(jí)份7-11.1。
D)級(jí)份7-12的細(xì)分級(jí)分離將由約600μl天然毒液經(jīng)上述第Ⅱ-B步得到的級(jí)份7-12樣品上樣至反相HPLC柱(Vydac
，C-18，300
，10×250mm)，先用90%A和10%B洗脫10分鐘，然后用從90%A和10%B至65%A加35%B的線性梯度洗脫系統(tǒng)展開60分鐘(A＝0.1% TFA，B＝乙腈)，在220nm處檢測(cè)，流速為3.5ml/分。如下規(guī)定收集了級(jí)份。
表6級(jí)份7-12.1 28.0至29.1分鐘級(jí)份7-12.2 38.4至39.6分鐘E)級(jí)份7-13的細(xì)分級(jí)分離將從約200μl天然毒液經(jīng)上述第Ⅱ-B步得到的級(jí)份7-13樣品上樣至反相HPLC柱(Vydac
，C-18，300
，10×250mm)，先用90%A加10%B洗脫10分鐘，然后用從90%A加10%B至60%A加40%B的線性梯度系統(tǒng)洗脫40分鐘(A＝0.1% TFA，B＝乙腈)，在220nm處檢測(cè)，流速為3.5ml/分。按下述規(guī)定收集了級(jí)份。
表7級(jí)份7-13.1 33.0至34.5分鐘級(jí)份7-13.2 35.1至36.5分鐘經(jīng)凍干濃縮了分段合并的上述每組級(jí)份。
F)級(jí)份7-15的細(xì)分級(jí)分離將從約200μl天然毒液經(jīng)上述第Ⅱ-B步得到的級(jí)份7-15樣品上樣至反相HPLC柱(Vydac
，C-18，300
，10×250mm)，先用90%A加10%B洗脫10分鐘，然后用從90%A加10%B至60%A加40%B的線性梯度洗脫系統(tǒng)展開40分鐘(A＝0.1% TFA，B＝乙腈)，在220nm處檢測(cè)，流速為3.5ml/分。按下述規(guī)定收集了級(jí)份。
表8級(jí)份7-15.1 33.1至33.6分鐘級(jí)份7-15.2 34.5至36.2分鐘級(jí)份7-15.3 37.7至39.1分鐘經(jīng)凍干濃縮了分段合并的上述各組級(jí)份。
G)級(jí)份7-16的細(xì)分級(jí)分離將從約600μl天然毒液經(jīng)上述第Ⅱ-B步得到的級(jí)份7-16樣品上樣至反相HPLC柱(Vydac
，C-18，300
，10×250mm)，先用90%A加10%B洗脫10分鐘，然后用從90%A加10%B至65%A加35%B的線性梯度洗脫系統(tǒng)展開60分鐘(A＝0.1% TFA，B＝乙腈)，在220nm處檢測(cè)，流速為3.5ml/分。收集了脫脫時(shí)間為31.8至33.0分鐘的級(jí)份，合并為級(jí)份7-16.1。
H)級(jí)份7-17的細(xì)分級(jí)分離將由約25μl天然毒液經(jīng)上述第Ⅱ-B步得到的級(jí)份7-17樣品上樣至反相HPLC柱(Vydac
，C-18，300
，10×250mm)，先用90%A加10%B洗脫10分鐘，然后用從90%A加10%B至60%A加40%B的線性梯度系統(tǒng)洗脫40分鐘(A＝0.1% TFA，B＝乙腈)，在220nm處檢測(cè)，流速為3.5ml/分。按下述規(guī)定收集了級(jí)份。
表9級(jí)份7-17.1 15.6至18.4分鐘級(jí)份7-17.2 18.5至19.4分鐘級(jí)份7-17.3 27.1至28.6分鐘級(jí)份7-17.4 28.6至30.1分鐘級(jí)份7-17.5 30.1至31.9分鐘級(jí)份7-17.6 31.9至33.5分鐘經(jīng)凍干濃縮了分段收集的上述各組級(jí)份。
實(shí)施例1 無聲桿捕鳥蛛的肽6-6用下面的方法測(cè)定并證實(shí)了上述第Ⅱ-A步驟中制備的肽6-6的結(jié)構(gòu)。用Waters Pico-Tag系統(tǒng)對(duì)1-10nmols樣品(分三份)進(jìn)行苯氨基硫甲酰基(PTC)氨基酸分析。在脈沖液相順序分析儀(ABI)上，對(duì)天然肽和還原/吡啶基乙基化肽都進(jìn)行了N-末端測(cè)序分析。由SCIEX API Ⅲ離子噴霧質(zhì)譜儀獲得質(zhì)譜分析。
取得的數(shù)據(jù)共同證實(shí)了肽6-6的結(jié)構(gòu)如下所示。
SEQ ID No∶1，39個(gè)殘基，6個(gè)半胱氨酸，3個(gè)二硫鍵。
計(jì)算質(zhì)量＝4382.3。
觀測(cè)質(zhì)量＝4382.16±0.54(離子噴霧質(zhì)譜)。
實(shí)施例2 無聲桿捕鳥蛛的肽6-8用下面的方法測(cè)定并證實(shí)了上述第Ⅱ-A步驟中制備的肽6-8的結(jié)構(gòu)。用W aters Pico-Tag系統(tǒng)對(duì)1～10nmols樣品(分三份)進(jìn)行PTC氨基酸分析。在脈沖液相順序分析儀(ABI)上對(duì)天然肽和還原/吡啶基乙基化肽都進(jìn)行了N-末端測(cè)序分析。由SCIEX API Ⅲ離子噴霧質(zhì)譜儀獲得質(zhì)譜分析。
取得的數(shù)據(jù)共同證實(shí)了肽6-8結(jié)構(gòu)如下所示。
SEQ ID No∶2，39個(gè)殘基，6個(gè)半胱氨基，3個(gè)二硫鍵。
計(jì)算質(zhì)量＝4369.2。
觀測(cè)質(zhì)量＝4368.26±0.27(離子噴霧質(zhì)譜)。
實(shí)施例3 無聲桿捕鳥蛛的肽7-6.1用下列方法測(cè)定并證實(shí)了上述第Ⅲ-A步驟中制備的肽7.6-1的結(jié)構(gòu)。用Waters Pico-Tag系統(tǒng)對(duì)1～10nmols樣品(分三份)進(jìn)行PTC氨基酸分析。在脈沖液相順序分析儀(ABI)上對(duì)天然肽和還原/吡啶基乙基化肽都進(jìn)行N-末端測(cè)序分析。由SCIEX API Ⅲ離子噴霧質(zhì)譜儀獲得質(zhì)譜分析。
取得的數(shù)據(jù)共同證實(shí)了肽7-6.1的結(jié)構(gòu)如下所示。
SEQ ID No∶3，33個(gè)殘基，6個(gè)半胱氨酸，3個(gè)二硫鍵。
計(jì)算質(zhì)量＝3786.2。
觀測(cè)質(zhì)量＝3784.54(離子噴霧質(zhì)譜)。
實(shí)施例4 無聲桿捕鳥蛛的肽7-13.1用下列方法測(cè)定并證實(shí)了上述第Ⅲ-E步驟中制備的肽7-13.1的結(jié)構(gòu)。用Waters Pico-Tag系統(tǒng)對(duì)1～10nmols樣品(分三份)進(jìn)行PTC氨基酸分析。在脈沖液相順序分析儀(ABI)上對(duì)天然肽和還原/吡啶基乙基化肽都進(jìn)行N-末端測(cè)序分析。由SCIEX API Ⅲ離子噴霧質(zhì)譜儀獲得質(zhì)譜分析。
取得的數(shù)據(jù)共同證實(shí)了肽6-8的結(jié)構(gòu)如下所示。
SEQ ID No∶4，34個(gè)殘基，6個(gè)半胱氨酸，3個(gè)二硫鍵。
計(jì)算質(zhì)量＝3814.32。
觀測(cè)質(zhì)量＝3813.67±0.27(離子噴霧質(zhì)譜)。
實(shí)施例5 無聲桿捕鳥蛛的肽7-13.2用下面的方法測(cè)定并證實(shí)了上述第Ⅲ-E步驟中制備的肽7-13.2的結(jié)構(gòu)。用Waters Pico-Tag系統(tǒng)對(duì)1～10nmols樣品(分三份)進(jìn)行PTC氨基酸分析。在脈沖液相順序分析儀(ABI)上對(duì)天然肽和還原/吡啶基乙基化肽都進(jìn)行了N-末端測(cè)序分析。由SCIEX API Ⅲ離子噴霧質(zhì)譜儀獲得質(zhì)譜分析。
取得的數(shù)據(jù)共同證實(shí)了肽7-13.2的結(jié)構(gòu)如下所示。
SEQ ID No∶5，42個(gè)殘基，6個(gè)半胱氨酸，3個(gè)二硫鍵。
計(jì)算質(zhì)量＝4844.45。
觀測(cè)質(zhì)量＝4844.66(離子噴霧質(zhì)譜)。
實(shí)施例6 無聲桿捕鳥蛛的肽7-15.2用下面方法測(cè)定并證實(shí)了上述第Ⅲ-F步驟中制備的肽7-15.2的結(jié)構(gòu)。用Waters Pico-Tag系統(tǒng)對(duì)1～10nmols樣品(分三份)進(jìn)行PTC氨基酸分析。在脈沖液相順序分析儀(ABI)上對(duì)天然肽和還原/吡啶基乙基化肽都進(jìn)行N-末端測(cè)序分析。由SCIEX API Ⅲ離子噴霧質(zhì)譜儀獲得質(zhì)譜分析。
取得的數(shù)據(jù)共同證實(shí)了肽7-15.2的結(jié)構(gòu)如下所示。
SEQ ID No∶6，39個(gè)殘基，6個(gè)半胱氨酸，3個(gè)二硫鍵。
計(jì)算質(zhì)量＝4342.19。
觀測(cè)質(zhì)量＝4341.84±0.33(離子噴霧質(zhì)譜)。
實(shí)施例7 無聲桿捕鳥蛛的肽7-17.1用下面的方法測(cè)定并證實(shí)了上述第Ⅲ-H步驟中制備的肽7-17.1的結(jié)構(gòu)。用Waters Pico-Tag系統(tǒng)對(duì)1～10nmols樣品(分三份)進(jìn)行PTC氨基酸分析。在脈沖液相順序分析儀(ABI)上對(duì)天然肽和還原/吡啶基乙基化肽都進(jìn)行N-末端測(cè)序分析。由SCIEX API Ⅲ離子噴霧質(zhì)譜儀獲得質(zhì)譜分析。
取得的數(shù)據(jù)共同證實(shí)了肽7-17.1的結(jié)構(gòu)如下所示。
SEQ ID No∶7，39個(gè)殘基，6個(gè)半胱氨酸，3個(gè)二硫鍵。
計(jì)算質(zhì)量＝4383.28。
觀測(cè)質(zhì)量＝4382.33±0.52(離子噴霧質(zhì)譜)。
實(shí)施例8 無聲桿捕鳥蛛的肽7-17.3用下面方法測(cè)定并證實(shí)了上述第Ⅲ-H步驟中制備的肽7-17.3的結(jié)構(gòu)。用Waters Pico-Tag系統(tǒng)對(duì)1～10nmols樣品(分三份)進(jìn)行PTC氨基酸分析。在脈沖液相順序分析儀(ABI)上對(duì)天然肽和還原/吡啶基乙基化肽都進(jìn)行N-末端測(cè)序分析。由SCIEX API Ⅲ離子噴霧質(zhì)譜儀獲得質(zhì)譜分析。
取得的數(shù)據(jù)共同證實(shí)了肽7-17.3的結(jié)構(gòu)如下所示。
SEQ ID No∶8。
觀測(cè)質(zhì)量＝4368.23±0.47(離子噴霧質(zhì)譜)。
實(shí)施例9 無聲桿捕鳥蛛的肽7-17.4用下面方法測(cè)定并證實(shí)了上述第Ⅲ-H步驟中制備的肽7-17.4的結(jié)構(gòu)。用Waters Pico-Tag系統(tǒng)對(duì)1～10nmols樣品(分三份)進(jìn)行PTC氨基酸分析。在脈沖液相順序分析儀(ABI)上對(duì)天然肽和還原/吡啶基乙基化肽都進(jìn)行N-末端測(cè)序分析。由SCIEX API Ⅲ離子噴霧質(zhì)譜儀獲得質(zhì)譜分析。
取得的數(shù)據(jù)共同證實(shí)了肽7-17.4的結(jié)構(gòu)如下所示。
SEQ ID No∶9，39個(gè)殘基，6個(gè)半胱氨酸，3個(gè)二硫鍵。
計(jì)算質(zhì)量＝4383.23。
觀測(cè)質(zhì)量＝4382.19±0.38(離子噴霧質(zhì)譜)。
序列表(1)一般資料(ⅰ)申請(qǐng)人(A)名稱Pfizer Inc(B)街道235 East 42nd Street(C)城市New York(D)州New York
(E)國(guó)家U.S.A.
(F)郵政編碼(ZIP)10017(G)電話(203)441-4905(H)電傳(203)441-5221(A)名稱NPS Pharmaceuticals，Inc.
(B)街道420 Chipeta Way(C)城市Salt Lake City(D)州Utah(E)國(guó)家U.S.A.
(F)郵政編碼(ZIP)84108(G)電話(801)583-4939(H)電傳(801)583-4961(ⅱ)發(fā)明名稱從無聲桿捕鳥蛛中得到的阻斷鈣通道的多肽(ⅲ)序列數(shù)9(ⅳ)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)介質(zhì)類型軟磁盤(B)計(jì)算機(jī)IBM PC兼容機(jī)(C)操作系統(tǒng)PC-DOC/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release ＃1.0，Version ＃1.25(EPO)(ⅵ)優(yōu)選申請(qǐng)資料(A)申請(qǐng)?zhí)朥S 07/973，323(B)申請(qǐng)日03-11-1992(2)SEQ ID No∶1的信息
(ⅰ)順序特征(A)長(zhǎng)度39個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈單(D)拓?fù)鋵W(xué)線型(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假說(Hypothetical)無(ⅳ)反有意義(鏈)(Anti-Sense)無(ⅵ)最初來源(A)生物體無聲桿捕鳥蛛(B)組織類型毒液(xi)順序描述SEQ ID No∶1
(2)SEQ ID No∶2的信息(ⅰ)順序特征(A)長(zhǎng)度39個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈單(D)拓?fù)鋵W(xué)線型(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假說無
(ⅳ)反有意義(鏈)無(ⅵ)最初來源(A)生物體無聲桿捕鳥蛛(B)組織類型毒液(xi)順序描述SEQ ID No∶2
(2)SEQ ID No∶3的信息(ⅰ)順序特征(A)長(zhǎng)度33個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈單(D)拓?fù)鋵W(xué)線型(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假說無(ⅳ)反有意義(鏈)無(ⅵ)最初來源(A)生物體無聲桿捕鳥蛛(B)組織類型毒液(xi)順序描述SEQ ID No∶3
(2)SEQ ID No∶4的信息(ⅰ)順序特征(A)長(zhǎng)度34個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈單(D)拓?fù)鋵W(xué)線型(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假說無(ⅳ)反有意義(鏈)無(ⅵ)最初來源(A)生物體無聲桿捕鳥蛛(B)組織類型毒液(xi)順序描述SEQ ID No∶4
(2)SEQ ID No∶5的信息(ⅰ)順序特征(A)長(zhǎng)度42個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈單
(D)拓?fù)鋵W(xué)線型(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假說無(ⅳ)反有意義(鏈)無(ⅵ)最初來源(A)生物體無聲桿捕鳥蛛(B)組織類型毒液(xi)順序描述SEQ ID No∶5
(2)SEQ ID No∶6的信息(ⅰ)順序特征(A)長(zhǎng)度39個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈單(D)拓?fù)鋵W(xué)線型(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假說無(ⅳ)反有意義(鏈)無(ⅵ)最初來源(A)生物體無聲桿捕鳥蛛(B)組織類型毒液
(xi)順序描述SEQ ID No∶6
(2)SEQ ID No∶7的信息(ⅰ)順序特征(A)長(zhǎng)度39個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈單(D)拓?fù)鋵W(xué)線型(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假說無(ⅳ)反有意義(鏈)無(ⅵ)最初來源(A)生物體無聲桿捕鳥蛛(B)組織類型毒液(xi)順序描述SEQ ID No∶7
(2)SEQ ID No∶8的信息(ⅰ)順序特征
(A)長(zhǎng)度35個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈單(D)拓?fù)鋵W(xué)線型(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假說無(ⅳ)反有意義(鏈)無(ⅵ)最初來源(A)生物體無聲桿捕鳥蛛(B)組織類型毒液(xi)順序描述SEQ ID No∶8
(2)SEQ ID No∶9的信息(ⅰ)順序特征(A)長(zhǎng)度39個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈單(D)拓?fù)鋵W(xué)線型(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假說無(ⅳ)反有意義(鏈)無
(ⅵ)最初來源(A)生物體無聲桿捕鳥蛛(B)組織類型毒液(xi)順序描述SEQ ID No∶9
權(quán)利要求
1.一種基本上純的、含有氨基酸順序?yàn)镾EQ ID No1、SEQ ID No2、SEQ ID No3、SEQ ID No4、SEQ ID No5、SEQ ID No6、SEQ ID No7、SEQ ID No8、SEQ ID No9的多肽或一種具有與上述多肽基本相同的氨基酸順序和基本相同的鈣通道阻斷活性的多肽或其可藥用鹽。
2.一種根據(jù)權(quán)利要求1的基本上純的多肽或其可藥用鹽，該多肽含有氨基酸順序?yàn)镾EQ ID No∶1、SEQ ID No∶2、SEQ ID No∶3、SEQ ID No∶4、SEQ ID No∶5、SEQ ID No∶6、SEQ ID No∶7、SEQ ID No∶8、SEQ ID No∶9。
3.一種阻斷細(xì)胞中鈣通道的方法，該方法包括給上述細(xì)胞施用鈣通道阻斷量的依據(jù)權(quán)利要求1的多肽。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中所述細(xì)胞位于哺乳動(dòng)物的神經(jīng)系統(tǒng)。
全文摘要
從無聲桿捕鳥蛛蜘蛛的毒液分離的多肽阻斷各種生物物體細(xì)胞的鈣通道，并且本身用于阻斷上述細(xì)胞中鈣通道和治療鈣通道介導(dǎo)的疾病和癥狀，并用于控制無脊椎有害動(dòng)物。
文檔編號(hào)A61P43/00GK1090289SQ93119818
公開日1994年8月3日 申請(qǐng)日期1993年11月2日 優(yōu)先權(quán)日1992年11月3日
發(fā)明者R·A·?？寺? N·A·薩科曼諾, D·M·內(nèi)森, D·菲利普斯 申請(qǐng)人:美國(guó)輝瑞有限公司, Nps藥物有限公司