專(zhuān)利名稱(chēng)：H9亞型禽流感病毒Vero細(xì)胞適應(yīng)株及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種能夠在VeiX)細(xì)胞中穩(wěn)定增殖的細(xì)胞株及其應(yīng)用，特別涉及一種 H9亞型禽流感病毒Veix)細(xì)胞適應(yīng)株及其應(yīng)用。屬于疫苗制備領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
禽流行性感冒(簡(jiǎn)稱(chēng)禽流感，Al)是由A型流感病毒引起的禽類(lèi)的感染和/或疾病綜合癥。引起Al的病原稱(chēng)為禽流感病毒。根據(jù)世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)的疾病分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)，高致病性禽流感屬A類(lèi)疾病，我國(guó)也將其列為一類(lèi)傳染病，其傳播速度快、發(fā)病率和死亡率高；而中等到低等毒力的AIV可引起亞臨床癥狀，出現(xiàn)產(chǎn)蛋下降、呼吸系統(tǒng)或全身性感染等多種程度不同的各種癥狀。雞群感染該病毒，嚴(yán)重影響雞的生產(chǎn)性能。肉仔雞增重減慢，死亡數(shù)量增加，易繼發(fā)患其它細(xì)菌性疾病。H9N2亞型AIV是一種低等毒力的病毒，可引起臨床或亞臨床癥狀。目前，在全世界從各種家禽和野生禽中分離到上千株H9N2亞型AIV，90年代以來(lái)，在世界許多國(guó)家發(fā)生；自 1998年，國(guó)內(nèi)許多雞群發(fā)生H9N2亞型禽流感的報(bào)道，H9N2亞型AIV在我國(guó)廣泛存在，并且多呈低致病性感染，然而由于其分布廣泛并且有逐漸蔓延之勢(shì)，因此給養(yǎng)禽業(yè)造成的威脅是巨大的。預(yù)防該病最行之有效的辦法就是疫苗的接種，目前，市售的禽流感疫苗絕大多數(shù)為雞胚組織苗，相對(duì)于細(xì)胞苗而言，其具有成本高、產(chǎn)品質(zhì)量批間差大、且容易生產(chǎn)雞源性潛在疾病的感染等缺點(diǎn)。近幾年，隨著禽流感的頻繁暴發(fā)以及跨種屬傳播，需要一種可在流感大流行時(shí)能夠替代雞胚快速、大量生產(chǎn)流感病毒的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的問(wèn)題，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種能夠在Veix)細(xì)胞中穩(wěn)定增殖的H9亞型禽流感病毒Veix)細(xì)胞適應(yīng)株。本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是通過(guò)以下技術(shù)手段實(shí)現(xiàn)的2011年初，本發(fā)明人從黑龍江省雙城市郊某養(yǎng)殖場(chǎng)分離得到一株禽流感病毒(H9 亞型)病毒株，其具有經(jīng)胰酶處理后能在細(xì)胞上增殖的特性，基于此，本研究針對(duì)組織苗的不足，HY株的特性，將其馴化為一株能夠在Vero細(xì)胞上良好增殖的VERO細(xì)胞適應(yīng)株，并將其命名為H9亞型禽流感病毒VERO細(xì)胞適應(yīng)株AIV HY株，其具有經(jīng)胰酶處理后能在細(xì)胞上增殖的特性，可用于在Vero傳代細(xì)胞中增殖進(jìn)而制備禽流感病毒滅活疫苗。所述的H9亞型禽流感病毒VERO細(xì)胞適應(yīng)株AIV HY株，分類(lèi)命名為禽流感病毒 (H9亞型)，保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址在北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院中科院微生物研究所，其菌種保藏編號(hào)為=CGMCC 5409，保藏日期為2011年 10月28日。本發(fā)明的H9亞型禽流感病毒VERO細(xì)胞適應(yīng)株AIV HY株是通過(guò)以下方法制備得到的
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I病毒的分離病料來(lái)自黑龍江省雙城市郊某養(yǎng)殖場(chǎng)，采集瀕死雞氣管拭子和泄殖腔拭子，用 2000單位青、鏈霉素溶液中處理后，接種雞胚，收集48h 78h雞胚尿囊液。對(duì)收獲的雞胚液進(jìn)行血凝試驗(yàn)，HA血凝價(jià)為91og2。2病毒分離株血凝抑制(HI)試驗(yàn)分別用H5、H7和H9亞型Al標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清及ND、EDS-76病毒標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清與HA 為陽(yáng)性的雞胚尿囊液進(jìn)行HI試驗(yàn)。結(jié)果表明，與H5、H7、ND和EDS-76病毒標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清反應(yīng)為陰性，與H9亞型Al標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清反應(yīng)為陽(yáng)性。3在Vero細(xì)胞的傳代與收獲3. I將收獲的組織毒，用滅菌生理鹽水稀釋后，接種80%長(zhǎng)成單層后的Veix)細(xì)胞， 37°C培養(yǎng)3天，放入_20°C中凍融3次，收獲病毒液。3. 2重復(fù)上述試驗(yàn)10次，直至病毒在Veix)細(xì)胞增值良好。本發(fā)明的H9亞型禽流感病毒VERO細(xì)胞適應(yīng)株AIV HY株可用于制備H9亞型禽流感病毒病毒液，其病毒增殖速度和產(chǎn)量上都優(yōu)于目前雞胚培養(yǎng)的禽流感病毒，以及未馴化的H9亞型禽流感病毒病毒株。將本發(fā)明的H9亞型禽流感病毒VERO細(xì)胞適應(yīng)株AIV HY株用于制備H9亞型禽流感滅活疫苗，具有廣泛的應(yīng)用前景。本發(fā)明一種疫苗組合物，其特征在于含有本發(fā)明所述的H9亞型禽流感病毒Veix) 細(xì)胞適應(yīng)株。所述的疫苗組合物，其特征在于還可進(jìn)一步包含藥學(xué)上接受的載體或佐劑。通過(guò)比較實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，利用本發(fā)明的VERO細(xì)胞適應(yīng)株AIV HY株生產(chǎn)疫苗新方法與利用雞胚生產(chǎn)的老方法的比較，具有以下優(yōu)點(diǎn)I、維持液中加入的胰蛋白酶是經(jīng)過(guò)殼聚糖包被后，起到緩慢釋放的作用；2、細(xì)胞苗在增殖速度和產(chǎn)量上都優(yōu)于目前雞胚培養(yǎng)的禽流感疫苗；3、降低生產(chǎn)成本；4、細(xì)胞苗的免疫效力不低于利用雞胚生產(chǎn)的流感滅活苗。
具體實(shí)施例方式下面通過(guò)實(shí)驗(yàn)并結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明，應(yīng)該理解的是，這些實(shí)施例僅用于例證的目的，決不限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。試劑和材料毒株H9亞型禽流感病毒VERO細(xì)胞適應(yīng)株AIV HY株，保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，其菌種保藏編號(hào)為CGMCC 5409。H9亞型禽流感病毒HY株(未馴化)由哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司保存，提供。材料10 11日齡SPF雞胚為哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司SPF雞場(chǎng)種蛋在本研發(fā)中心孵化、vero細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)獸藥監(jiān)察所、0. 22 um濾器購(gòu)自PALL公司。試劑優(yōu)質(zhì)白油購(gòu)自美國(guó)索尼泊爾公司、司本-80、吐溫-80購(gòu)自新加坡禾大公司、硬脂酸鋁購(gòu)自沈陽(yáng)東興試劑廠、脫乙酰度為85%的殼聚糖購(gòu)自Sigma公司、胰酶購(gòu)自 GIBICO公司、三聚磷酸鈉購(gòu)自天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所。H5和H9亞型Al標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清購(gòu)買(mǎi)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所；H7亞型Al標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清及ND、EDS-76病毒標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清購(gòu)買(mǎi)中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。實(shí)施例I H9亞型禽流感病毒VERO細(xì)胞適應(yīng)株AIV HY株的獲得I原始病毒株的分離病料來(lái)自黑龍江省雙城市郊某養(yǎng)殖場(chǎng)，采集瀕死雞氣管拭子和泄殖腔拭子，用 2000單位青、鏈霉素溶液中處理后，接種雞胚，收集48h 78h雞胚尿囊液。對(duì)收獲的雞胚液進(jìn)行血凝試驗(yàn)，HA血凝價(jià)為91og2。2病毒分離株血凝抑制(HI)試驗(yàn)分別用H5、H7和H9亞型Al標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清及ND、EDS-76病毒標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清與HA 為陽(yáng)性的雞胚尿囊液進(jìn)行HI試驗(yàn)。結(jié)果表明，與H5、H7、ND和EDS-76病毒標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清反應(yīng)為陰性，與H9亞型Al標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清反應(yīng)為陽(yáng)性。3在Vero細(xì)胞的傳代與收獲3. I將收獲的組織毒，用滅菌生理鹽水稀釋后，接種80%長(zhǎng)成單層后的Veix)細(xì)胞， 37°C培養(yǎng)3天，放入_20°C中凍融3次，收獲病毒液。3. 2重復(fù)上述試驗(yàn)10次，直至病毒在Veix)細(xì)胞增殖良好。獲得一株能夠在Vero細(xì)胞增殖良好的病毒株，命名為H9亞型禽流感病毒VERO細(xì)胞適應(yīng)株AIV HY株，保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，其菌種保藏編號(hào)為 CGMCC 5409。實(shí)施例2利用H9亞型禽流感病毒VERO細(xì)胞適應(yīng)株AIV HY株生產(chǎn)流感病毒滅活疫苗 I、殼聚糖納米粒包埋法固定化胰酶的制備(I)稱(chēng)取脫乙酰度為85%的殼聚糖，用I %的乙酸溶解，制成濃度為0. 5 2mg/mL 的殼聚糖溶液，過(guò)0. 22 ii m濾器。稱(chēng)取胰酶，用去離子水溶解，制成濃度為500 u g/mL的胰酶溶液，過(guò)0. 22iim濾器。稱(chēng)取三聚磷酸鈉,用去離子水溶解,制成濃度為1.0 2. Omg/mL 的三聚磷酸鈉溶液，過(guò)0. 22 ii m濾器。(2)取5mL殼聚糖溶液，滴加2. 5 7. 5mL 500 u g/mL的胰酶溶液，磁力攪拌3min， 獲得溶液A ；(3)溶液A在室溫、無(wú)菌條件下以900 1300r/min磁力攪拌30s,然后逐滴加入 2. 5mL的三聚磷酸鈉溶液，繼續(xù)磁力攪拌10 30min，獲得溶液B ；(4)將溶液B于4°C、12000r/min離心2min，取沉淀并用等體積的PBS (pH7. 4)洗三次，然后加入等體積的PBS (pH7. 4)懸浮，真空冷凍干燥24h，獲得包埋胰酶的殼聚糖納米粒。2、H9N2亞型VERO細(xì)胞適應(yīng)株AIV HY株細(xì)胞病毒液的制備(I)接種取H9N2亞型VERO細(xì)胞適應(yīng)株AIV HY株作為生產(chǎn)用種毒，用滅菌生理鹽水作適當(dāng)稀釋(10_5 10_7)，待細(xì)胞80%長(zhǎng)成單層后，棄掉細(xì)胞培養(yǎng)液，按培養(yǎng)液體積的 1/10接毒，37度吸附I小時(shí)，在維持液中加入經(jīng)殼聚糖包被的胰蛋白酶，終濃度為6 u g/ml, 37度培養(yǎng)3天，收獲病毒液。(2)病毒液收獲收獲病毒液，放入-20度冰柜中反復(fù)凍融3次，測(cè)定每個(gè)容器中病毒的HA效價(jià)，HA效價(jià)低于I : 128者棄去。同時(shí)作無(wú)菌檢驗(yàn)應(yīng)無(wú)菌生長(zhǎng)。收獲的病毒液滅活前在2 8 °C保存，應(yīng)不超過(guò)5日。
(3)病毒液滅活將病毒液注入滅活灌，開(kāi)啟滅活罐的攪拌器，準(zhǔn)確量取10 %的甲醛溶液，在不斷攪拌時(shí)加入至含抗原液的滅活灌中，使其充分?jǐn)嚢杈鶆?。甲醛溶液終濃度為0. 1%。將滅活罐升溫至37°C (以罐內(nèi)溫度達(dá)到37°C開(kāi)始計(jì)時(shí))，維持滅活時(shí)間16小時(shí)， 期間不停緩慢攪拌。滅活結(jié)束后，取樣10ml，用于做滅活檢驗(yàn)和無(wú)菌檢驗(yàn)。滅活后的病毒液在2_8°C保存不超過(guò)15天。(4)半成品檢驗(yàn)無(wú)菌檢驗(yàn)取已經(jīng)滅活的病毒胚液，按《中國(guó)獸藥典》附錄15頁(yè)，對(duì)滅活的AIV病毒液進(jìn)行檢驗(yàn)，應(yīng)無(wú)菌生長(zhǎng)。滅活檢驗(yàn)取經(jīng)甲醒滅活的AIV (H9)病毒胚液,分別接種10 11日齡SPF雞胚尿囊腔內(nèi)，每種病毒液接種6枚雞胚，每胚0. 2mL，置36 37°C孵育，每日照胚2次，非特異死亡應(yīng)不超過(guò)I個(gè)。培養(yǎng)96小時(shí)，全部取出。分別測(cè)每個(gè)雞胚液的HA效價(jià)，HA效價(jià)均應(yīng)小于21og2，收獲的雞胚液再傳一代，HA效價(jià)均應(yīng)小于21og2，認(rèn)為AIV (H9)滅活完全。(5)病毒含量測(cè)定將滅活前取出的濃縮病毒胚液10倍系列稀釋?zhuān)O'lO'lO'lO、個(gè)稀釋度分別接種10 11日齡SPF雞胚5個(gè)，每胚尿囊腔內(nèi)接種0. lmL，24小時(shí)前死亡雞胚棄去不記， 每日照蛋2次，觀察5日，無(wú)論死胚、活胚均應(yīng)測(cè)定血凝價(jià)，血凝價(jià)> I 16(微量法)者判為感染。按Reed-Muench法計(jì)算EID5tl，每0. ImL病毒含量彡IO7 ciEID5tl，方可用于制苗。3、油乳劑滅活疫苗的制備油相制備取優(yōu)質(zhì)白油94份(以毫升為單位)，加司本-806份(以毫升為單位)， 混合后加熱，另加硬脂酸鋁2份(以克為單位)，一邊加一邊攪拌，直至透明為止，高壓滅菌，冷卻后備用。水相制備將滅活的病毒細(xì)胞液，取4份吐溫-80，加入到混合后的抗原液96份中，使吐溫-80充分溶解。配苗及乳化取2份油相加入乳化灌內(nèi)，開(kāi)動(dòng)電機(jī)慢速攪拌，同時(shí)徐徐加入上述I 份水相，加完后繼續(xù)攬祥，冋時(shí)加入I %硫柳萊溶液，使其最終濃度為0. 01%;然后通過(guò)均質(zhì)機(jī)乳化。制成禽流感(H9亞型)滅活疫苗。乳化后，取樣3 5mL，以3000r/min離心15分鐘，若有分層現(xiàn)象，應(yīng)重復(fù)乳化I次。4、分裝將乳化好的疫苗定量分裝，加蓋密封和標(biāo)簽，于2 8°C保存，待檢。實(shí)施例3利用細(xì)胞毒和組織毒制備得到的疫苗的比較按照實(shí)施例2的方法生產(chǎn)的，利用本發(fā)明馴化后的H9亞型禽流感病毒VERO細(xì)胞適應(yīng)株AIV HY株(細(xì)胞毒)生產(chǎn)的疫苗與按照實(shí)驗(yàn)例I的方法生產(chǎn)的，利用未馴化的H9 亞型禽流感病毒病毒株(組織毒)生產(chǎn)的疫苗進(jìn)行比較，為了驗(yàn)證細(xì)胞毒的特性，分別制備了 10批次組織毒和細(xì)胞毒，并測(cè)定了相關(guān)技術(shù)指標(biāo)，現(xiàn)將其中一些指標(biāo)的比較結(jié)果總結(jié)如下，如表1-5所述表I兩種種毒紅細(xì)胞凝集價(jià)比較
權(quán)利要求
1.一種H9亞型禽流感病毒VeiX)細(xì)胞適應(yīng)株，其特征在于所述的VeiX)細(xì)胞適應(yīng)株為 H9亞型禽流感病毒Vero細(xì)胞適應(yīng)株AIV HY株，分類(lèi)命名為禽流感病毒(H9亞型)，保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，其菌種保藏編號(hào)為=CGMCC 5409。
2.權(quán)利要求I所述的Vero細(xì)胞適應(yīng)株在生產(chǎn)H9亞型禽流感病毒中的應(yīng)用。
3.權(quán)利要求I所述的VeiO細(xì)胞適應(yīng)株在制備預(yù)防H9亞型禽流感疫苗中的應(yīng)用。
4.一種疫苗組合物，其特征在于含有權(quán)利要求I所述的H9亞型禽流感病毒Vero細(xì)胞適應(yīng)株。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種H9亞型禽流感病毒Vero細(xì)胞適應(yīng)株及其在制備預(yù)防H9亞型禽流感疫苗中的應(yīng)用。本發(fā)明得到的適應(yīng)株應(yīng)用于Vero細(xì)胞其病毒增殖速度和產(chǎn)量上都優(yōu)于目前雞胚培養(yǎng)的禽流感病毒，以及未馴化的H9亞型禽流感病毒病毒株。本發(fā)明的H9亞型禽流感病毒Vero細(xì)胞適應(yīng)株能夠替代雞胚快速、大量生產(chǎn)流感病毒，具有廣泛的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)A61K39/145GK102586194SQ20111039329
公開(kāi)日2012年7月18日 申請(qǐng)日期2011年12月1日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月1日
發(fā)明者丁國(guó)杰, 吳金, 姜力, 孫德君, 張明艷, 張楊 申請(qǐng)人:哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司