專利名稱：一種具有提高智力、改善腦能量代謝、促進腦發(fā)育和增強多巴胺能神經(jīng)功能作用的組合物 ...的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種中藥組合物，具體來說是一種具有提高智力、改善腦能量代謝、促進腦發(fā)育和增強多巴胺能神經(jīng)功能作用的組合物，本發(fā)明還涉及該組合物的制備方法和用途。
背景技術：
精神發(fā)育遲滯(智力低下，MR)所包括的范圍很廣。MR性腦型癱瘓時除運動功能障礙外，大多數(shù)患者伴有智力低下，促智治療是治療腦癱的重要環(huán)節(jié)。腦型癱瘓是出生前，出生時或出生后腦操作造成的永久性腦損害。運動能障礙的原因是上位神經(jīng)元(大腦皮層、基底神經(jīng)節(jié)、小腦等)對下位神經(jīng)元失去調節(jié)能力所致。所以治療腦癱應從提高上位神經(jīng)元特別是大腦皮層的功能入手。長期以來，一般認為神經(jīng)細胞受損害后沒有再生能力，國內外醫(yī)學家將腦癱列為不治之癥。
中醫(yī)治療精神發(fā)育遲滯的腦型癱瘓的療效已經(jīng)逐漸得到醫(yī)學上的認可?，F(xiàn)有技術中存在許多這類藥物。但是藥物效果仍然不能令人滿意。本發(fā)明人經(jīng)過多種藥理和臨床研究發(fā)現(xiàn)一種治療該疾病非常有效的組方。該組方是以安神開竅為主，再輔以滋陰補陽藥、活血化瘀藥和平肝潛陽藥組方，從而完成了本發(fā)明。

發(fā)明內容
本發(fā)明一個目的是提供一種具有提高智力、改善腦能量代謝、促進腦發(fā)育和增強多巴胺能神經(jīng)功能作用的藥物組合物。
本發(fā)明的另外一個目的是提供該藥物組合物的制備方法。
本發(fā)明又一個目的是提供了該藥物組合物的用途。
本發(fā)明的藥物組合物是由有效成分和/或藥學上可接受的載體組成，其中制備有效成分的原料是選擇了安神藥和開竅藥為主，安神藥為首烏藤、遠志和五味子，開竅藥用麝香和石菖蒲。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，優(yōu)選還包括滋陰藥龜版、鱉甲、黃精。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，優(yōu)選還包括活血藥如當歸、紅花、丹參和川芎。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，優(yōu)選還包括平肝潛陽藥如地龍和牛黃。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，優(yōu)選和包括補陽藥核桃仁。
本發(fā)明最優(yōu)選包括這些原料作為有效成分首烏藤、當歸、枸杞、龜甲、黃精、丹參、五味子、紅花、川芎、遠志、核桃仁、地龍、石菖蒲、牛黃和麝香。
制備本發(fā)明有效成分的原料用量優(yōu)選為首烏藤15-20％、當歸9-13％、枸杞8-13％、龜甲8-13％、黃精8-13％、丹參5-10％、五味子4-9％、紅花4-9％、川芎4-9％、遠志4-9％、核桃仁1-5％、地龍1-5％、石菖蒲1-3％、牛黃0.1-0.5％和麝香0.1-0.5％。
制備本發(fā)明有效成分的原料用量優(yōu)選為首烏藤16％、當歸12％、枸杞10％、龜甲10％、黃精10％、丹參8％、五味子6％、紅花6％、川芎6％、遠志6％、核桃仁4％、地龍4％、石菖蒲1.4％、牛黃0.3％和麝香0.3％。
此外還可以加入益智仁。加入益智仁的用量為4-9％，優(yōu)選益智仁的用量為5％。
本發(fā)明組合物中的有效成分的制備方法可以是將上述原料研成粉末，混合均勻制成的，優(yōu)選采用等量遞增法混合。
本發(fā)明組合物中有效成分的制備方法還可以是將其中具有揮發(fā)油的原料當歸和川芎首先提取揮發(fā)油，然后再將藥渣與首烏藤、當歸、枸杞、龜版、鱉甲、黃精、丹參、五味子、紅花、川芎、遠志、核桃仁、地龍、石菖蒲一起水提醇沉制得提取液，濃縮得到浸膏，再將麝香和牛黃單獨研細，將揮發(fā)油、麝香和牛黃藥粉和浸膏混合均勻制成。
本發(fā)明所述的藥物組合物是將上述有效成分與藥學上可接受的輔料一起制成各種藥物劑型如片劑、膠囊、口服液、顆粒劑等口服劑型。
本發(fā)明組合物可以將上述有效成分與食品學上可接受的成分一起制成各種保健品。
對本發(fā)明組合物進行了促智作用及對腦發(fā)育影響的研究發(fā)現(xiàn)，小鼠和大鼠所用劑量為每天1.2和4g/kg，相當于人的臨床用量為0.1、0.2和0.4g/kg體重，經(jīng)胃給藥，每天一次，共10-18天。初步研究結果表明，該藥有以下藥理作用一.促進學習和記憶1.促進記憶獲得，對小鼠記憶獲得障礙有明顯的改善作用。
2.促進記憶再現(xiàn)，改善小鼠記憶再現(xiàn)障礙。
3.促進記憶鞏固，改善小鼠記憶鞏固障礙。
4.提高小鼠空間辨別能力，使小鼠在迷宮中學習成績明顯提高。促進未成年大鼠條件反射的形成，使未成年大鼠穿梭箱反應條件反射主動回避陽性率明顯提高、條件反射形成速度加快。同時腦內RNA含量增加。
二.改善腦能量代謝1.延長小鼠斷頭后張口喘氣時間及常壓缺氧時小鼠存活時間。
2.使大鼠急性不完全性腦缺血時腦組織含水量減少，腦組織蛋白含量增加幅度(反映血漿蛋白外滲)減輕，缺血時腦水腫減輕，說明其有抗腦缺血作用。
3.使缺血大鼠腦組織過氧化脂質代謝產(chǎn)物丙二醛生成減少，說明其有抑制自由基生成、減輕細胞損傷的作用。使缺血時大鼠腦ATP消耗減少、乳酸生成減少，說明有改善腦能量代謝的作用。
三.對軀體及腦發(fā)育的影響1.促進發(fā)育期大鼠體重增長。
2.提高未成年大鼠腦內RNA含量。促進氫可型腎虛大鼠腦蛋白質合成，表明有促進腦發(fā)育的作用。
本發(fā)明組合物還能使氫可型腎虛小鼠肝、脾、胸腺細胞增生、肝、胸腺蛋白合成增多，正常大鼠血紅蛋白含量增加，并促進動物體重增加，這些生長激素樣作用，可能和增強多巴胺能神經(jīng)功能，促進生長激素釋放有關。
四.使左旋多巴胺誘發(fā)的小鼠刻板抬頭運動增強，表明有增強多巴胺能神經(jīng)功能的作用。本發(fā)明組合物經(jīng)過藥理試驗驗證表明它對小鼠記憶獲得障礙有明顯的改善作用；改善小鼠記憶再現(xiàn)障礙；改善小鼠記憶鞏固障礙；提高小鼠空問辨別能力，使小鼠在迷宮中學習成績明顯提高；促進未成年大鼠條件反射的形成。使未成年大鼠穿梭箱反應條件反射主動回避陽性率明顯提高、條件反射形成速度加快；同時還可以使腦內RNA含量增加。
本發(fā)明組合物還具有改善腦能量代謝的功效，延長小鼠斷頭后張口喘氣時間及常壓缺氧時小鼠存活時間；使大鼠急性不完全性腦缺血時腦組織含水量減少。腦組織蛋白含量增加幅度(反映血漿蛋白外滲)減輕，缺血時腦水腫減輕，說明其有抗腦缺血作用；使缺血大鼠腦組織過氧化脂質代謝產(chǎn)物丙二醛生成減少，說明其有抑制自由基生成、減輕細胞損傷的作用；使缺血時大鼠腦ATP消耗減少、乳酸生成減少，說明有改善腦能量代謝的作用。
本發(fā)明組合物也對軀體及腦發(fā)育有影響，促發(fā)育期期大鼠體重增長；提高未成年大鼠腦內ATP含量。促進氫可型腎虛幼年大鼠腦蛋白質合成，表明有促進腦發(fā)育的作用。本藥尚能使氫可型腎虛小鼠肝、脾、胸腺細胞增生，肝、胸腺蛋白合成增多，正常大鼠血紅蛋白含量增加，并促進動物體重增加，這些生長激素樣作用，可能和增強多巴胺能神經(jīng)功能，促進生長激素釋放有關。
本發(fā)明組合物也使左旋多誘發(fā)的小鼠刻板抬頭運動增強，表明有增強多巴胺能神經(jīng)功能的作用。
經(jīng)臨床觀察證實，本發(fā)明組合物對腦癱引起的弱智、運動障礙等有良好的改善作用。這說明該藥對上位神經(jīng)元特別是大腦皮層的功能有增強作用。
本發(fā)明組合物的大鼠長期毒性試驗結果證實，本藥3g/kg分別給大鼠灌胃120天，和對照比較，不影響大鼠生長發(fā)育，不影響造血功能、肝功能及腎功能。肉眼觀察及病理切片證實給藥組大鼠心、肝、脾、肺、腎、腦、胃、腸、腎上腺、甲狀腺、睪丸和卵巢在外觀形態(tài)及組織學上均無明顯異常變化。此外，本藥尚有大鼠胸腺增重、促進血紅蛋白合成等有益作用。
具體實施例方式
實施例1稱取首烏藤80mg、當歸60mg、枸杞50mg、龜甲50mg、黃精50mg、丹參40mg、五味子30mg、紅花30mg、川芎30mg、遠志30mg、核桃仁20mg、地龍20mg、石菖蒲7mg、牛黃1.5mg和麝香1.5mg；將牛黃和麝香研細，備用；將枸杞子、紅花、五味子、石菖蒲干燥粉碎，備用；將其余藥物干燥粉碎，備用；將上述藥粉混合均勻，制成本發(fā)明組合物的有效成分。
實施例2將實施例1所制備的有效成分藥粉裝入明膠膠囊殼制成膠囊劑型。
實施例3將實施例1所制備的有效成分的藥粉加入糊精作為稀釋劑，用乙醇作為濕潤劑制成軟材，制粒，加入潤滑劑硬脂酸鎂，壓片，制成片劑。
實施例4將實施例1所制備的有效成分的藥粉加入乳糖作稀釋劑，用乙醇作為濕潤劑制成軟材，制粒，干燥，制成顆粒劑。
實施例5稱取首烏藤80mg、當歸60mg、枸杞50mg、龜甲50mg、黃精50mg、丹參40mg、五味子30mg、紅花30mg、川芎30mg、遠志30mg、核桃仁20mg、地龍20mg、石菖蒲7mg、牛黃1.5mg和麝香1.5mg；首先提取當歸和川芎的揮發(fā)油，然后再將藥渣與首烏藤、當歸、枸杞、龜甲、黃精、丹參、五味子、紅花、川芎、遠志、核桃仁、地龍、石菖蒲一起水提醇沉制得提取液，濃縮得到浸膏，再將麝香和牛黃單獨研細，將揮發(fā)油、麝香和牛黃藥粉和浸膏混合均勻制成。
實施例6將實施例5所制備的有效成分藥粉裝入明膠膠囊殼制成膠囊劑型。
實施例7將實施例5所制備的有效成分的藥粉加入糊精作為稀釋劑，用乙醇作為濕潤劑制成軟材，制粒，加入潤滑劑硬脂酸鎂，壓片，制成片劑。
實施例8將實施例5所制備的有效成分的藥粉加入乳糖作稀釋劑，用乙醇作為濕潤劑制成軟材，制粒，干燥，制成顆粒劑。
實施例9稱取首烏藤80mg、當歸60mg、枸杞50mg、龜甲50mg、黃精50mg、丹參40mg、五味子30mg、紅花30mg、川芎30mg、遠志30mg、核桃仁20mg、地龍20mg、石菖蒲7mg、牛黃1.5mg、麝香1.5mg和益智仁25mg；將牛黃和麝香研細，備用；將枸杞子、紅花、五味子、石菖蒲干燥粉碎，備用；將其余藥物干燥粉碎，備用；將上述藥粉混合均勻，制成本發(fā)明組合物的有效成分。
實施例10稱取首烏藤20mg、當歸13mg、枸杞13mg、龜甲13mg、黃精13mg、丹參10mg、五味子9mg、紅花9mg、川芎9mg、遠志9mg、核桃仁5mg、地龍5mg、石菖蒲3mg、牛黃0.5mg和麝香0.5mg；將牛黃和麝香研細，備用；將枸杞子、紅花、五味子、石菖蒲干燥粉碎，備用；將其余藥物干燥粉碎，備用；
將上述藥粉混合均勻，制成本發(fā)明組合物的有效成分。
實施例11稱取首烏藤16mg、當歸9mg、枸杞9mg、龜甲8mg、黃精8mg、丹參6mg、五味子5.8mg、紅花4mg、川芎4mg、遠志5mg、核桃仁3mg、地龍2mg、石菖蒲2mg、牛黃0.1mg和麝香0.1mg；將牛黃和麝香研細，備用；將枸杞子、紅花、五味子、石菖蒲干燥粉碎，備用；將其余藥物干燥粉碎，備用；將上述藥粉混合均勻，制成本發(fā)明組合物的有效成分。
試驗例1材料和方法一、材料本發(fā)明組合物用前用蒸餾水制成混懸液。氫溴酸東莨菪堿注射液為成都一廠產(chǎn)品，批號為900501。腦復康膠囊(乙酰胺比咯烷酮)為蘭州制藥廠產(chǎn)品，批號940601，用前用蒸餾水溶解。氫化可的松注射液，上海信誼藥廠產(chǎn)品，批號941203。氯丙嗪注射液為江蘇無錫制藥廠產(chǎn)品，批號930501。鹽酸左旋多巴為上海舉賢奉藥廠產(chǎn)品，批號940719，每0.25克加1滴吐溫-80后加水制成乳劑。鹽酸氟桂嗪(Flunarizine)為西安楊森制藥有限公司產(chǎn)品，尼莫地平為珠海經(jīng)濟特區(qū)麗珠制藥廠產(chǎn)品，均用蒸餾水溶解。熒光素酶由中科院上海植物生理研究所提供。硫代巴比妥酸(TBA)用0.1mol/L NaOH溶解。
實驗用wistar大鼠購自蘭州醫(yī)學院實驗動物中心。(合格證號普002-01)。昆明種小鼠購自衛(wèi)生部蘭州生物制品研究所動物宣(合格證號普001-01。
11-14克體重(25日齡)為未成年小鼠，189以上體重為成年小鼠。
二、方法1.小鼠學習能力和記憶能力測定(1)(1)跳臺法實驗裝置為一長方形反射箱，大小為72×10×10cm，用黑色塑料板分為6間，底面輔以銅柵，間距為0.5cm，可以通電(40V)。每間左后角置一高和直徑均為4.5cm的絕緣平臺。實驗分訓練和測驗兩個階段。訓練時先將小鼠放人反應箱內適應3分鐘，然后立即通以40V交流電。動物受到電擊后跳回平臺以躲避電擊為正確反應，如再次跳到銅柵上受到電擊，即為錯誤反應。如此訓練5分鐘，記錄每鼠的錯誤反應次數(shù)，此為學習成績。24小時后重作測驗，測驗時將小鼠平穩(wěn)放在跳臺上，記錄第一次跳下平臺的潛伏期和5分鐘內錯誤反應次數(shù)，作為動物的記憶保持能力。
(2)Y型電迷宮法該裝置為一夾角為120°的等臂長輻射式迷路箱，箱底輔以銅柵，實驗時通40V交流電。該裝置分起步區(qū)、電擊區(qū)和安全區(qū)。訓練時將小鼠放入起步區(qū)，適應1分鐘后通電，當小鼠偶然進入安全區(qū)逃避電擊后，令其停留30秒，以鞏固記憶。然后又以起步區(qū)為起點。重復訓練。當小鼠遭遇電擊直接逃避至安全區(qū)為正地反應，進入電擊區(qū)或返回起步區(qū)為錯誤反應。以小鼠9/10次正確反應作為達標，記錄達標電擊次數(shù)，作為學習能力。
(3)避暗法測定箱為相通的明暗兩室。明室大小為15×9×23cm，底部鋪以銅柵(不通電)。暗室大小為13×12×28cm。，底部銅柵通以40V交流電。明、暗室之間隔板上開一直徑為3cm圓洞。明室25cm高處裝一100W鎢絲釘。小鼠有暗惡明、喜鉆洞的習性。將小鼠放入明室。很快鉆入暗室。暗室底部通電，小鼠進入暗室后受到電擊，迫使其逃回明至，并獲得記憶。實驗時將小鼠面部背向洞口放入明室，同時啟動計時器。動物穿過洞口進入暗室受到電擊即停止記時。取出小鼠，記錄每鼠從放入明室至進入暗室遭遇電擊所需的時間，此即潛伏期。24小時后重新測驗，記錄進入暗室的潛伏期和5分鐘內的電擊次數(shù)(錯誤次數(shù))，做為記憶成績。
2、大鼠穿梭箱主動回避反應條件反射形成測定。
穿梭箱為60×30×30cm大小，內均分兩室，室間有6×7CM拱形小門相通。箱底由直徑為2cm的鋼棒鋪成，間距7MM，可通交流電(50HZ、30V)，產(chǎn)生足電震，作為非條件刺激。兩至備裝一燈(15W)，以燈光為條件刺激。實驗時先將大鼠置于箱內適應90秒，然后在大鼠所在室亮燈15秒，若大鼠在燈亮后5秒時不從明室逃向暗室則明室電柵通電刺激10秒。間隔15秒后，從大鼠所在室為起點。重復上述實驗。每天訓練30次，連續(xù)9天。訓練時如大鼠在燈亮后5秒內即逃向暗側。則為主動回避反應陽性。點擊后逃向暗處為主動回避反應陰性。觀察藥物對大鼠主動回避反應陽性率的提高作用。作為大鼠學習和記憶進步的指標。訓練結束后斷頭取腦測腦重、腦內RNA.DNA.蛋白質含量。
3、腦內DNA、RNA和蛋白含量測定取大鼠腦組織加4ml蒸餾水制成勻漿，加入4ml冷20％三氯醋酸(TCA)使勻漿含TCA10％，離心(3000Rpm，5min)得沉淀，用5％TCA4ml洗2次，懸浮在8ml 2％過氯酸中，再水浴煮沸20分鐘，冷卻至室溫后，300OrPm。離心10分鐘，上清液用乙醚洗2次后，取0.5ml用地衣酚法測RNA含量，取1ml用二苯胺法測DNA含量。沉淀加1ml蒸餾水后用乙醚洗2次。用lowry法測蛋白含量。
4、腦缺血模型制備選230±15克體重。Wistar大鼠60只，♀♂各半，分6組，即對照組、假手術對照組、陽性藥對照組和本發(fā)明組合物低、中、高劑量組。對照組及假手術對照組按20ml/kg用生理鹽水灌胃，陽性藥對照組用尼莫地平25mg/kg Ig，本發(fā)明組合物低、中、高劑量組分別…以本發(fā)明組合物1、2和4g/kg。每天1次，共7天。于末次給藥后1小時時用烏拉坦0.8g/kg Ip麻醉。分離并結扎雙側頸總動脈。假手術組分離雙頸總動脈但不結扎，余處理同其它各組。術后8小時斷頭處死，取腦置0-20冰凍。切取左前腦200mg，加冷蒸餾4ml制成勻漿，3000rpm，4℃離心10min，取上清液0.5ml用硫代巴比妥法測丙二醛(MDA)含量。取上清液0.5ml加三氯醋酸4ml離心沉淀蛋白后用對一羥基聯(lián)苯比色法測乳酸含量。切除右前腦200mg，加5％高氯酸2ml制成勻漿，4000rpm、4℃離心10min，取上清用20％kOH20％K2HPO40.6ml中和PH至6.5，3000rpm離心10min，取上清液用熒光素酶一液體閃爍計數(shù)法測ATP含量(12)；沉淀用0.1mol/L NaOH溶解后用lowry法測蛋白含量。取雙顳葉稱濕重后置恒溫烤箱80℃烤至恒重，準確稱腦組織干重，求含水量。
5、抗缺氧試驗取20±2g♂小鼠75只，分5組，分別用生理鹽水20ml/kg、氟桂嗪10mg/kg，本發(fā)明組合物1、2、4g/kg ig，每天一次，共7天，于末次給藥后1小時放入145ml缺O(jiān)2瓶內，記錄小鼠呼吸停止時間，求出小鼠常壓缺O(jiān)2時的存活時間。另取20±1.6g♂小鼠60只，同法分組給藥，于末次給后1hip亞硝酸鈉200mg/kg，記錄生存時間。取50只體重為20.6±1.7g♂小鼠同法分組給藥，于末次給藥后1小時ip氯化鉀7.5mg/kg，記錄小鼠存活時間。
6、氫可型腎虛小鼠模型制備選14日齡幼年大鼠分兩組，一組按每天40mg/kg連續(xù)皮下注射氫化可的松3天，另一組皮下注射等體積生理鹽水作為對照。于停氫化可的松次日起分組給藥，共分4組，每窩鼠均分在4個實驗組內。給藥組每天按2或4g/kg用本發(fā)明組合物灌胃，正常對照組及模型組用等體積生理鹽水灌胃，每天1次，共10天，于給藥10天時斷頭處死，取肝、脾、胸腺稱重，用冷蒸餾水制成勻漿，加等體積20％三氯醋酸(TCA)沉淀蛋白，離心(3000rpm，5min)得沉淀，用5％TCA洗2次，懸浮在2％高氯酸中，水浴煮沸20分鐘，冷卻至室溫后，3000rpm離心10min，上清液用乙醚洗2次后，用二苯胺法(13)測DNA含量，沉淀用乙醚洗2次后，用0.1mol/LNaOH溶解，用Lowry法(1-4)測蛋白含量。
試驗例2本發(fā)明組合物對學習和記憶的影響1、對小鼠記憶獲得障礙的改善作用小鼠102只，體重11-14g，雌雄各半，按體重隨機分6組。正常對照組和模型用生理鹽水按20ml/kg體重灌胃，陽性藥對照組用1.5％腦復康按0.3g/kg灌胃，本發(fā)明組合物低、中、高劑量組分別按1、2、4g/kg灌胃。每天1次，共10天。于第10天給藥2小時后進行跳臺訓練。模型組及各給藥組于訓練前20分鐘空腹腔注射東莨菪堿1mg/kg，造成健忘癥模型。對照組小鼠腹腔注射等體積生理鹽水。觀察訓練期間5分鐘內錯誤反應次數(shù)作為學習能力指標；24小時后重作測定，記錄潛伏期和5分鐘內錯誤次數(shù)，作為記憶能力指標。
表1本發(fā)明組合物對小鼠記憶獲得障礙的改善作用組別 藥物劑量 學習能力(5mi記憶能力小鼠數(shù)錯誤次數(shù))(g/kg) 潛伏期(秒) 5min錯誤次數(shù)對照組 - 17 1.36±1.41**187.4±107.3**1.22±1.35**模型組 - 17 4.96±4.0755.2±49.2 3.08±1.83模型+腦復康 0.3 17 3.00±1.74*207.7±106.8**1.13±0.91**模型+本發(fā)明組合物 1 17 3.70±2.64139.7±115.2**1.85±0.99**模型+本發(fā)明組合物 2 17 3.26±1.98*183.8±123.2**0.95±1.02**模型+本發(fā)明組合物 4 17 2.88±1.93*160.8±125.9**1.07±1.03**和模型組比*P＜0.05，**P＜0.01學習能力測定結果如表1，東莨菪堿模型組在學習期間5分鐘內錯誤次數(shù)較對照明顯增多，差別極為顯著(P＜0.01)，表明學習能力低下模型造型成功。本發(fā)明組合物1、2、4g/kg均使錯誤次數(shù)明顯減少，和模型組比差別有顯著意義。本發(fā)明組合物此種提高小鼠學習能力的作用，呈劑量依賴性，以中高劑量效果較好。
記憶能力測定結果見表1。和對照組比較，模型組小鼠潛伏期縮短而錯誤次數(shù)明顯為多，差別級為顯著(P＜0.01)。給本發(fā)明組合物低、中、高劑量組小鼠潛伏期延長而錯誤次數(shù)減少，接近于正常對照組。此作用呈倒“U”字型量效關系。
2、對小鼠記憶再現(xiàn)障礙的改善作用小鼠102只，體重11-14g，雌雄各半，按體重隨機分6組。按表2灌胃給藥，每天1次，共10天。對照組和模型組給以等體積生理鹽水。于末次給藥后2小時進行避暗法訓練，記錄潛伏期。24小時進行測定。測定前三十分鐘，模型組及給藥各組用30％乙醇按0.1ml/10g體重灌胃。記錄由明室進入暗室的潛伏期和5分鐘內錯誤次數(shù)。
表2本發(fā)明組合物對記憶再現(xiàn)障礙的改善作用組別 藥物劑量 小鼠數(shù) 潛伏期(秒)錯誤次數(shù)g/kg訓練測試 (次/5分鐘)對照組 - 17 21.9±14.6 149.0±62.1*2.33±1.18**模型組 - 17 31.7±23.2 91.7±72.95.82±3.97模型+腦復康0.317 26.5±27.6 169.9±82.3*2.62±1.71**模型+本發(fā)明組合物 1 17 34.7±23.9 157.2±118.9 2.24±1.95**模型+本發(fā)明組合物 2 17 27.5±24.6 153.8±69.9*2.06±1.86模型+本發(fā)明組合物 4 17 26.7±25.3 164.8±85.3*2.07±1.59**和模型組比*P＜0.05，**P＜0.01
結果見表2，乙醇使小鼠記憶再現(xiàn)明顯障礙，表現(xiàn)為避暗潛伏期縮短，錯誤次數(shù)增多。本發(fā)明組合物低、中、高劑量組小鼠測試時和模型組比較潛伏期延長、錯誤次數(shù)減少基本接近正常對照組。
3、對成年小鼠記憶鞏固障礙的改善作用選18-22g體重小鼠96只，雌雄各半，按表3分5組。給藥組每天分別用腦復康0.3k/kg、本發(fā)明組合物1、2、4g/kg灌胃，每天一次。對照組和模型組給以等體積生理鹽水。于給藥第10天時用跳臺訓練，記錄5分鐘內的錯誤次數(shù)，作為對正常鼠學習能力的測定。訓練后除對照組外，其余各組小鼠均立即皮下注射120mg/kg亞硝酸鈉，造成腦缺氧性記憶鞏固障礙模型。24小時后重新測定5分鐘內錯誤次數(shù)，以觀察小鼠的記憶能力。
結果，第1次訓練時本發(fā)明組合物4g/kg即使正常成年小鼠錯誤次數(shù)減少，說明本發(fā)明組合物也能提高正常成年小鼠的學習能力。24小時測試時模型組錯誤次數(shù)明顯增多，和對照組比較，差別高度顯著(P＜0.01)，說明亞硝酸鈉已造成腦缺氧性記憶鞏固不良，本發(fā)明組合物中劑量(2g/kg)組使測試時小鼠錯誤次數(shù)顯著減少(P＜0.05)，表明本發(fā)明組合物對缺氧造成的記憶鞏固障礙有改善作用。此作用量效曲線呈明顯的倒“U”字型。即低、高劑量時作用較弱甚至無效。
表3本發(fā)明組合物對亞硝酸鈉造成的成年小鼠腦缺氧性記憶鞏固障礙的改善作用藥物劑量 小鼠數(shù) 錯誤次數(shù)(次/5分鐘)(g/kg) 訓練 測試對照組 -16 2.667±1.670 0.500+0.122**模型組 -16 2.583±1.429 1.538±0.789腦復康 0.3 16 2.000±1.764 0.875±0.834本發(fā)明組合物116 2.100±0.994 1.111±0.333本發(fā)明組合物216 2.400±1.882 0.583±0.368**本發(fā)明組合物416 1.385±1.044*1.769±1.300和模型組比*P＜0.05，**P＜0.01
4、對小鼠空間辨別障礙的改善作用小鼠102只，體重11-14g，雌雄各半，按表3分別給藥，每天一次，共10天。于第10天時進行迷宮訓練，訓練前20分鐘模型組及給藥各組腹腔注射東莨菪堿0.5mg/kg造成空間辨別障礙模型，對照組腹腔注射等體積生理鹽水。記錄達9/10次正確反應的電擊次數(shù)作為學習成績，結果見表4。
表4本發(fā)明組合物對小鼠空間辨別障礙的改善作用組別 藥物劑量 小鼠數(shù) 達標電擊次數(shù)(g/kg)對照組-17 3.36±0.39**模型組-17 8.93±6.64模型+腦復康 0.3 17 3.64±3.26*模型+本發(fā)明組合物 117 6.73±2.56模型+本發(fā)明組合物 217 3.58±3.46**模型+本發(fā)明組合物 417 2.58±1.64**和模型組比*P＜0.05，**P＜0.01結果，模型組給東莨菪堿后達標電擊次數(shù)明顯增多，和對照組比差別高度顯著(P＜0.01)，表明小鼠發(fā)生空間辨別障礙。本發(fā)明組合物1、2、4g/kg使達標電擊次數(shù)明顯減少，表明小鼠學習能力提高。此作用以中、高劑量組最為明顯，有明顯的量效關系。
5、對未成年大鼠穿梭箱主動回避反應性條件反射形成的影響選30日齡大鼠62只，雌雄各半，斷奶適應5天時進行分組。給藥組分別用1、2、4g/kg本發(fā)明組合物或0.3k/kg腦康復灌胃，對地照組用等體積生理鹽水灌胃，每日1次，共18天，于給藥第10天時開始用大鼠穿梭箱進行訓練，記錄每日主動回避反應陽性率作為大鼠學習和記憶的成績。
結果見表5，對照組大鼠主動回避反應條件反射形成陽性率降低，訓練第7天時才達34.6％，本發(fā)明組合物中劑量(2g/kg)組條件反射形成速度較對照組明顯為快，陽性率明顯為高，在訓練開始后第2-6天和對照組比較差別均有顯著性意義，以第3天最為顯著，此結果反復重復、重現(xiàn)性甚好，非常穩(wěn)定。低劑量組本發(fā)明組合物(1g/kg)訓練開始后第24天主動回避反應條件反射形成陽性率較對照組稍高，但差別無顯著性意義，第5-7天時基本接近對照組。本發(fā)明組合物高劑量(4g/kg)組訓練開始后第2-6天主動回避反應條件反射形成陽性率略高于對照組，第4天的陽性率和對照組比較有顯著性差別。此結果之量效曲線呈倒“U”字形，即中劑量效果較好，低、高劑量效果較差。
表5本發(fā)明組合物對大鼠穿梭箱主動回避反應的影響組別劑量 大鼠數(shù) 陽性率(％)g/kgd1d2 d3 d4 d5 d6 d7 d8 d9對照組 -19 12.60 10.5 13.317.225.6 31.634.651.2 70.5±9.9 ±8.5±7.6 ±13.4 ±14.6 ±20.7 ±6.9 ±17.8 ±20.6腦復康 0.3 10 19.8 27.0 36.7**35.2*39.6* 49.052.265.4 75.4±14.0±11.0**±24.2 ±19.8 ±17.7 ±25.2 ±11.1 ±12.3 ±14.6本發(fā)明 111 18.1 19.4 19.122.123.3 32.036.750.4 72.3組合物 ±11.2±18.2 ±11.5 ±17.9 ±19.2 ±15.2 ±16.5 ±12.3 ±18.4本發(fā)明 211 18.7 23.3 29.4**31.7*42.7 52.353.070.2 82.3組合物 ±11.2±20.8*±21.1 ±20.2 ±21.57*±26.2*±29.7 ±18.4*±19.3本發(fā)明 411 16.8 16.1 20.932.736.3 48.047.665.4 75.6組合物 ±9.9 ±11.8 ±17.4 ±22.4*±23.8 ±23.45 ±37.2 ±18.2 ±15.6和對照組比*P＜0.05，**P＜0.016、對未成年大鼠穿梭箱訓練后腦RNA、DNA、蛋白質含量的影響結果見表6，本發(fā)明組合物高劑量組腦重較對照組輕度增加，但差別無顯著性意義。和對照組比，各劑量本發(fā)明組合物組腦中DNA、蛋白含量均無顯著性差別。高劑量本發(fā)明組合物使大鼠腦中RNA顯著升高，此作用有明顯的量效關系。
表6本發(fā)明組合物對大鼠腦RNA、DNA、蛋白含量的影響組別 劑量 大鼠數(shù) 腦重DNA RNA 蛋白質(g/kg) (mg)(mg/g腦) (mg/g腦)(mg/g腦)對照組- 19 1753.8 1.24 8.45126.68±68.9 ±0.28±0.83 ±12.0腦復康0.310 1770.3 1.17 8.54120.9±103.2 ±0.27±0.69 ±12.0本發(fā)明組合物 1 11 1772.7 1.17 8.87124.6±92.1 ±0.28±0.57 ±17.8本發(fā)明組合物 2 11 1755.5 1.21 9.10124.1±104.9 ±0.24±1.00 ±4.5本發(fā)明組合物 4 11 1773.6 1.25 9.62**127.6±83.9 ±0.22±0.66 ±26.5和對照組比較**P＜0.01二、改善腦能量代謝的作用1、對小鼠急性腦缺血的影響小鼠100只，分5組，按表7分組給藥。每天1次，共15天。于末次給藥后斷頭處死，記錄張口喘氣時間，作為腦缺氧指標。觀察藥物對張口喘氣時間的影響。結果(表7)，本發(fā)明組合物1、2、4g/kg劑量依賴性地延長小鼠張口喘氣時間，和對照組比較，中、高劑量組本發(fā)明組合物有顯著性差別。表明本發(fā)明組合物有降低腦耗氧的作用。腦復康無此作用。
表7本發(fā)明組合物對小鼠急性腦缺血時張口喘氣時間的影響組別 劑量(g/kg) 小鼠數(shù) 張口喘氣時間(秒)對照組- 20 19.6±2.16腦復康0.3 20 19.4±1.94本發(fā)明組合物 1 20 20.7±3.36本發(fā)明組合物 2 20 21.9±1.93*本發(fā)明組合物 4 20 23.2±1.90**2、對小鼠常壓缺氧的影響結果見表8。氟桂嗉10mg/kg和本發(fā)明組合物2或4g/kg均能顯著延長常壓缺氧下的存活時間，本發(fā)明組合物1g/kg無此作用。
表8本發(fā)明組合物對小鼠常壓缺氧的影響藥物 劑量 鼠數(shù) 存活時間(g/kg) (min)對照 - 15 10.3±1.51氟桂嗪 0.010 15 12.6±1.51*本發(fā)明組合物 1 15 10.7±1.59本發(fā)明組合物 2 15 12.2±2.37*本發(fā)明組合物 4 15 13.1±1.79**和對照組比*P＜0.05，**P＜0.013、對亞硝酸納缺氧的影響結果(表9)，本發(fā)明組合物1g/kg和氟桂嗪10mg/kg均使亞硝酸納性缺氧小鼠存活時間延長，2g/kg和4g/kg本發(fā)明組合物反而無此作用。
表9本發(fā)明組合物對小鼠亞硝酸鈉性缺氧的影響藥物劑量 小鼠數(shù)存活時間(g/kg)對照- 1223.3±3.94氟桂嗪 0.01 1235.0±4.43**本發(fā)明組合物1 1232.9±5.94**本發(fā)明組合物2 1226.5±6.09本發(fā)明組合物4 1225.8±1.16和對照組比**P＜0.014、駐地氰化鉀性缺氧的影響結果見表10，本發(fā)明組合物各劑量組均未表現(xiàn)出對抗作用，和對照組比較，差別均無顯著性意義。
表10本發(fā)明組合物對氰化鉀性缺氧的影響藥物 劑量 小鼠數(shù) 存活時間(g/kg)對照 - 10 16.1±4.2氟桂嗪0.010 10 15.4±2.6本發(fā)明組合物 1 10 15.5±2.4本發(fā)明組合物 2 10 15.2±4.7本發(fā)明組合物 4 10 15.4±3.25、對大鼠急性不完全性腦缺血的影響本發(fā)明組合物4g/kg使缺血組織含水量減輕，缺血腦組織蛋白含量減少，1、2g/kg本發(fā)明組合物無此作用。
表11本發(fā)明組合物對大鼠急性不完全性腦缺血的影響

和對照級比*P＜0.05，**P＜0.016、對不完全性腦缺血大鼠腦丙二醛(MDA)含量的影響結果見表12，大鼠腦缺血8小時時腦MDA含量明顯升高，5號方2、4g/kg均能使明顯降低。
表12本發(fā)明組合物對不完全性腦缺血大鼠腦MDA含量的影響

和對照組比，**P＜0.01。
7、對不完全性腦缺血大鼠腦能量代謝的影響大鼠腦不完全性缺血8小時時，腦ATP含量明顯減少，乳酸含量明顯增加，本發(fā)明組合物4g/kg使缺血腦組織ATP消耗減少，同時乳酸生成明顯減少。
表13本發(fā)明組合物對不完全性腦缺血大鼠腦能量代謝的影響

和對照比，**P＜0.01三、對動物發(fā)育的影響及整體功能的調節(jié)作用1、對末成年大鼠體重發(fā)育的影響35日齡大鼠60只分5組，按表14分組給藥，每天花板次，共15天。于給藥前，給藥第5天、第10天、第15天稱重，觀察藥物對大鼠體重發(fā)育的影響。給藥前各組動物體重無明顯差別，給藥后本發(fā)明組合物組大鼠體重增長明顯較快，此作用以高劑量組(4g/kg)最為明顯，在給藥第10天時高劑量本發(fā)明組合物組大鼠體重和對照組比較，差別有顯著性意義(P＜0.05>，表明本發(fā)明組合物有促進末成年大鼠軀體發(fā)育的作用。腦復康末表現(xiàn)出此種作用。
表14本發(fā)明組合物對末成年大鼠體重發(fā)育的影響

和對照組比較，*P＜0.052、對氫可型腎幼年大鼠(8)腦DNA、RNA和蛋白含量的影響先14日齡幼年大鼠分兩組，一組按每天40mg/kg連續(xù)皮下注射氫化可的松3天，另一組皮下注射等體積生理鹽水作為對照。于停氫化可的松后次日起分組給藥，共分4組，每窩鼠均分在4個實驗組內。給藥組每天按2或4g/kg用本發(fā)明組合物佼囊潛胃，正常對照組及模型組用等體積生理鹽水潛胃，每天1次，共10天。于給藥第10天時斷頭處死，按前法撮及測定腦內DNA、RNA和蛋白含量。
結果氫可造型3天時幼年大鼠體重明顯下降、倦縮、怕冷、豎毛、肝、胸腺萎縮，表明造型成立。腦中RNA及蛋白含量明顯減少，本發(fā)明組合物使腦RNA含量有嗇的趨勢，但差別無顯著性。本發(fā)明組合物2g/kg和4g/kg均使腦蛋白含量明顯增加(表15)，此作用呈劑量依賴性且高劑量組和腎虛模型組比差別顯著(P＜0.05>，說明本發(fā)明組合物有促進腎虛幼年大鼠腦蛋白合成的作用。給藥組大鼠腦DNA含量輕度增加，但和模型組比較，無顯著性差別(P＜0.05>。
表15本發(fā)明組合物對腎虛幼年大鼠腦DNA、RNA及腦蛋白含量的影響

和腎虛組比較，*P＜0.05，**P0.013、對氫可型腎虛幼年大鼠肝脾、胸腺DNA及蛋白含量的影響結果見表16幼年大鼠皮下注射氫化可的松后，肝、胸腺蛋白含量下降、肝、脾、胸腺重量減輕，DNA含量下降，4g/kg本發(fā)明組合物使肝、胸腺蛋白含量明顯增加，肝、脾、胸腺重量增加，DNA含量增多，結果均有顯著性意義。
表16本發(fā)明組合物對氫可型腎幼年大鼠組織蛋白及DNA含量的影響



和腎虛組，比*P＜0.05，**P＜0.01，N＝10四、對小鼠刻板抬頭運動的影響小鼠18-22G，雌雄各半，分5組。分別潛服本發(fā)明組合物1、2、4G/KG，陰性對照組和陽性對照組潛服等體積生理鹽水，每天1次，共15天。陰性對照組及本發(fā)明組合物組于末次灌胃后1小腹腔注射左旋多巴0。8G/KG。陽性對照組皮下注射25MG/KG氯丙嗪，15分鐘后腹腔注射左旋多巴0。8G/KG，其余各組小鼠皮下注射等體積生理鹽水。給左旋多巴10分鐘后將小鼠置一倒置的鐘形玻璃罩內，觀察30分鐘的刻板抬頭數(shù)。各組小鼠在末次測定24小前同法觀察未給左旋多巴時是否有刻板抬頭運動。
結果見表17，本發(fā)明組合物本身不引起刻板抬頭運動，說明其無擬多巴胺樣作用。但劑量依賴性地增加左旋多巴誘發(fā)的小鼠刻板抬頭次數(shù)，說明該藥有增強多巴胺能神經(jīng)功能的作用。
表17本發(fā)明組合物對左旋多巴誘發(fā)的小鼠刻板抬頭運動的影響

和對照組比，**P＜0.01學習記憶試驗包括被動回避反應試驗，如跳臺法、避暗法；空間辨別實驗如電迷宮法；主動回避反應實驗如大鼠穿梭箱反應性條件反射。本實驗用多種模型及方法進行研究，證實了本發(fā)明組合物確有可靠的促智作用，且對記憶的不同階段如記憶獲得、記憶鞏固和記憶再現(xiàn)功能均有不同程度的提高作用。
藥物的促智作用，在正常動物上不易表現(xiàn)出來，多用記憶損傷模型動物進行實驗。乙酰膽堿是腦內參與學習和記憶的最重要神經(jīng)遞質，用東莨菪堿阻斷中樞M-膽堿受體，阻斷中樞膽堿能神經(jīng)元沖動傳導，造成動物學習能力低下，記憶獲得障礙。在跳臺實驗中，本發(fā)明組合物囊1、2、4g/kg體重(相當于人的臨床劑量為0.1、0.2和0.4g/kg體重)。明顯糾正東莨菪堿造成的小鼠學習能力低下和記憶獲得障礙；在迷宮實驗中，2.4G/KG明顯改善東莨菪堿引起的小鼠空間辨別障礙，證明本發(fā)明組合物有提高中樞有關神經(jīng)元功能、易化傳導、增強學習和記憶能力的作用。
記憶再現(xiàn)障礙模型多用30％乙醇造型。乙醇對記憶再現(xiàn)的干擾作用機理不清，但此模型穩(wěn)定，靈敏度及重復性好，是促智藥藥理研究的重要模型。本實驗中觀察到，1、2、4G/KG本發(fā)明組合物對抗乙醇引起的記憶再現(xiàn)障礙，說明該藥在多個環(huán)節(jié)能提高小鼠的記憶能力。
大鼠穿梭箱反應性條件反射實驗工作量大，在藥物初篩時一般不用。此實驗一般需用成年大鼠，對照組條件反射形成陽性率較低。本實驗用35日齡未成年大鼠開始實驗，對照組條件反射形成速度慢、陽性率低，說明本實驗所用大量功能發(fā)育尚不成熟，這就給觀察到藥物的促智作用提供了良好的條件。用本發(fā)明組合物后，特別是中劑量組(2G/KG)大鼠條件反射形成速度明顯加快，陽性率明顯提高，此作用穩(wěn)定，重現(xiàn)性甚好，連續(xù)5次差別均有顯著性意義，這證明本發(fā)明組合物有加快未成年大鼠腦功能發(fā)育的作用。本發(fā)明組合物的此種作用對精神發(fā)育遲滯小兒或腦癱患者，無疑會產(chǎn)生有益的影響。
本實驗證實，本發(fā)明組合物使小鼠斷頭全張口喘氣時間延長，使常壓缺氧時小鼠存活時間延長，說明其有抗氧作用。大鼠結扎雙側頸總動脈造成不完全性腦缺血后，本發(fā)明組合物使腦缺血大鼠水腫減輕，同時使腦缺血引起的組織蛋白含量增加減少，說明該藥有抗腦缺血，減輕缺血腦組織毛細血管通透性增加引起的血漿蛋白的外滲、減輕腦水腫的作用。不完全性腦缺血時，由于缺氧與通過側支循環(huán)的不完全性供氧并存，生成大量氧自由基及脂質過氧化物，導致腦細胞損傷。本發(fā)明組合物能使缺血腦組織過氧化脂質代謝產(chǎn)物MDA生成減少，提示其有抑制不完全性腦缺血時氧自由基成及脂質過氧化物形成，減輕腦細胞損傷的作用；同時本發(fā)明組合物明顯改善缺血時的腦能量代謝，表現(xiàn)為缺血腦組織乳酸含量減少而ATP消耗減慢，這說明了本發(fā)明組合物有保護腦細胞、減輕腦損傷、降低腦能量消耗，提高能量利用率促進腦功能恢復的作用。
哺育動物組織細胞內的DNA含量恒定，因此組織DNA含量的變化可反映組織細胞數(shù)目的變化。本發(fā)明組合物使腎虛幼年大鼠肝、脾、胸腺DNA含量增加，說明其有刺激細胞增生的作用；使腎虛大鼠肝、胸腺及腦蛋白含量增加，使正常大鼠血紅蛋白含量增加(參考長期毒性試驗資料)，同時促進大鼠體重增長，這些結果作用，本發(fā)明組合物有生長激素樣作用，這些作用對患兒整體機能的提高無疑將會產(chǎn)生有益影響。
通過學習而獲得的經(jīng)驗與行為，是由神經(jīng)元內部的RNA分子的結構承擔貯存下來，也即通過細胞內特殊RNA結構變化的密碼使新的經(jīng)驗長久保存下來，所以RNA屬于記憶分子(8)。本發(fā)明組合物明顯提高大鼠訓練后腦RNA含量，此作用可能和其促智作用有關。此外，RNA含量增多，可指導合成更多的酶蛋白，使腦細胞活化，調節(jié)功能增強。氫可型腎虛幼年大鼠腦蛋白的明顯降低，本發(fā)明組合物促使腦蛋白含量明顯增加，證明本方有補腎、填髓、益腦，促進腦發(fā)育的作用。本發(fā)明組合物對正常大鼠腦蛋白合成無影響，但腎虛幼年大鼠在腦蛋白含量偏低的情況下，又有促進腦蛋白質合成，使腦內蛋白含量趨于正常，這正符合祖國醫(yī)學“虛則補之”的理論。
腦內的多巴胺能神經(jīng)通路主要有1、質一紋狀體通路，此通路中多巴胺能神經(jīng)興奮時外軸肌張力降低，膽堿能神經(jīng)興奮時外肌張力增強，二者處于動態(tài)平衡狀態(tài)，調節(jié)骨胳肌張力，使運動協(xié)調。本發(fā)明組合物增強左旋多巴誘發(fā)的小鼠刻版運動，說明其具有增強多巴胺能神經(jīng)動能的作用。腦癱患者運動障礙型多數(shù)骨胳肌張力過高，臨床上用本發(fā)明組合物治療后肌痙攣減輕，四肢運動更加協(xié)調，，這可能和該藥增強多巴胺能神經(jīng)功能的作用有關。2、結節(jié)一漏斗通路，此通路中多巴胺能神經(jīng)興奮時垂體前葉分泌生長激素增多。本發(fā)明組合物明顯促進未成年大鼠體重增長、促進幼年腎虛大鼠肝、胸腺細胞增生和胸腺、肝、腦蛋白以及血紅蛋白合成，臨床上也觀察到該藥能明顯促進患兒體格發(fā)育，這些都屬于生長激素樣作用。這可能和其增強多巴胺能神經(jīng)功能，促進生長激素釋放有關。
腦型癱瘓是大腦的永久損傷，故現(xiàn)階段醫(yī)學界對該病的治療基本處于束手無策的狀態(tài)，腦癱的基礎研究基本處于停滯狀態(tài)。臨床資料證實，本發(fā)明組合物對腦癱患者腦功能(智力、運動調節(jié))有明顯的改善作用。本實驗證實，該藥有明顯的促智作用，對動物學習和記憶的不同環(huán)節(jié)都有易化作用，這和臨床上該藥對幼兒及成年人均有效的結果一致。此外，該藥促進信使物質RNA合成，促進腦蛋白質合成，這些腦細胞生化機能的改變。必將提高殘存腦細胞的功能，使腦細胞活化，提高大腦的調節(jié)功能。本發(fā)明組合物增強多巴胺能神經(jīng)功能的作用。其促進動物體重增長、促進腦、肝、胸腺等組織蛋白及血紅蛋白合成，這些生長激素樣作用將對患者的整體機能調節(jié)產(chǎn)生有益的影響。
試驗例3本發(fā)明組合物改善記憶作用人體試食試驗報告1.材料與方法1.1樣品本發(fā)明組合物，每粒0.5g。
1.2受試對象自愿參加實驗者76人，為同一年級小學生，隨機分為試食組和對照組。試食組完成全過程者40人，對照組完成全過程者30人。采用自身對照及空白對照設計。
1.3試食方法每天早、晚各三粒(0.5g/粒)，周1-5在學校集中食用(由老師監(jiān)督)，周六、日帶回家食用(監(jiān)護人監(jiān)督)，為期30天。
1.4統(tǒng)計方法配對計量資料比較的t檢驗及兩組均數(shù)檢驗。
2.測試內容采用湖南醫(yī)科大學龔耀先等修訂韋氏記憶量表，各項內容于試驗前及結束后時各測一次，試驗前用甲氏。主要包括《1》長時記憶測驗個人經(jīng)歷、關于時間和空間的定向、數(shù)字順序關系；《2》短時記憶測驗視覺再認、圖片回憶、視覺再生、聯(lián)想學習、觸摸測驗、《3》瞬時記憶測驗理解記憶，順背和倒背數(shù)字2.1圖片回憶(簡稱回憶)這一分測驗的材料，包括兩套圖片對，每套各20圖，供甲、乙兩套應用。方法是先讓測試驗者看20張

圖1分鐘，然后拿走，讓測試者回憶。每一正確回憶記1分，錯誤回憶倒扣分。
2.2視覺再認(簡稱再認)分甲、乙兩套識記圖卡，每套8個內容。有圖、有字、還有符號，讓測試者記半分鐘，然后拿走。讓測試者在另外一有28個內容的卡上找出8個看過的東西來。(再認內容與識記的完全一樣記2分，再認內容與識記的相似記1分，再認內容與識記的同類記0分，再認了無關內容扣1分。最高16分)
2.3視覺再生(簡稱再生)兩套圖片，每套各3張，即A、B、C。其中A、B二卡中各有一圖，C有兩圖。先讓測試者看A、B卡10秒鐘，后拿開，讓測試者在記錄紙上默畫出來。C卡同樣方法。
2.4聯(lián)想學習(簡稱聯(lián)想)分甲、乙兩套，供甲、乙兩套測驗使用。每套測驗各有 10對詞讀給受試者聽；同時呈給受試者看，每次2秒。依次換第二對。10對完了停5秒，再讀每對詞的前一詞，要受試者5秒內說出后一詞。如第一遍答題有錯，則停10秒后再 進行第M遍，方法相同，詞的順序不同；再有錯，則停10秒后進行第三遍。5秒內回答正確記1分。
2.5角覺記憶(簡稱觸覺)一副形板，共9個圖形，橫豎各三個圖形，每三個圖形上蓋以長方形木盒。測試方法分兩個步驟，第一步是蒙住受試者的眼睛用手(第一次用利勢手，第二次用非利勢手，第三次用雙手)摸著將木塊擺在木槽里，移開形板，最后拆除蒙眼物。第二步是要他用鉛筆將剛才換過的圖畫出來，先畫記憶的，然后畫各圖的位置。
2.6理解記憶(簡稱理解)有兩套故事，每套有甲。乙、兩三個故事，甲有14個內容，乙有20個內容，而有30個內容。選用乙、丙兩個故事。主試者將故事講給受試者聽，后即要受試者重復?；貞浢恳粌热萦?.5分。最高分25分。
2.7背誦數(shù)目(簡稱背數(shù))2.7.1順背先說指導語，受試者明白，則從四位數(shù)開始，如第一試正確，便念五位數(shù)，如錯了再念同一位數(shù)的第二試，如第二試回答又錯了，便停止此測驗。念數(shù)速度是每秒一數(shù)。以正確順背最高位數(shù)記分， 最高分11分。
2.7.2倒背先說指導語，受試者明白，則從S位數(shù)開始倒念，其他同順背方法。
3.結果試食組食用本發(fā)明組合物后記憶商數(shù)從91.1升高至107.4，平均升高16.3分，自身前后比較差異有非常顯著性(P＜0.01)對照組記憶商數(shù)平均提高4.47分，差異亦有非常顯著性印(P＜0.01) 提示測驗本身有一定的學習效應，兩組對象可能因熟悉內容及方法，第二次測驗成績有所提高(見表1)，但從二組實驗前和試驗后記憶商數(shù)均數(shù)比較分析，試驗前兩組差異無顯著性，而試驗后兩組MQ差異有顯著性(P＜0.01)試食組記憶商數(shù)高于對照組，提示腦原靈膠囊對改善兒童記憶力有一定作用(見表2)其中之其中短時記憶測驗的各量數(shù)分見表3。
表18兩組對象記憶商數(shù)(MQ)自身配對比較試食組對照組試驗前 試驗后 試驗前 試驗后例數(shù)n40 40 30 30X±SD107.4±10.2391.1±9.81**99.08±7.92 94.61±8.12**注**表示P＜0.01，差異有非常顯著性。
表19兩組對象記憶商數(shù)(MQ)均數(shù)比較試驗前試驗后試食組 91.1±9.81 107.4±10.23**對照組 94.61±8.12 99.08±7.92**P＞0.05 P＜0.01注**表示P＜0.01，差異有非常顯著性。
表20短時記憶測驗各量表分試食組對照組試驗前(X) 試驗后(X) 試驗前(X) 試驗后(X)
圖片回憶6.58 9.10 7.36 7.74視覺再認6.08 7.88 7.47 7.44視覺再生8.78 11.4 10.7 11.1聯(lián)想學習9.10 10.2 10.1 10.2觸覺記憶8.90 10.5 9.31 9.40理解記憶9.6 10.6 10.1 10.2背誦數(shù)目7.93 10.3 9.44 9.92結論受試者連續(xù)食用本發(fā)明組合物30天后，記憶有顯著位差異P＜0.01，試食組與對照組記憶商數(shù)有顯著性差異P＜0.01，記憶商效試食組比對照組增加明顯。因此，本發(fā)明組合物對改善人體記憶力有一定作用。
試驗例4本發(fā)明組合物的長期毒性試驗試劑與動物本發(fā)明組合物。試驗動物為wistar大鼠。
方法與結果選5周齡Wistar大鼠，體重90-130g，雌雄各半，共90只，均衡隨機分3組。1組按20ml/kg用生理鹽水灌胃，作為陰性對照組。另2組分高、低劑量給藥組。按《新藥審批辦法》一毒理研究的技術要求，“如急性毒性試驗難以求出LD50，不能找到三個理想的劑量組，長期毒性試驗可設兩個劑量組，高劑量組應高于藥效學試驗的高劑量和臨床治療量”。在本實驗中，高劑量(9g/kg)高于藥效學試驗的高劑量(4g/kg)，為人臨床口服用量的45倍，低劑量(3g/kg)高與藥效學試驗的最佳劑量(2g/kg)，為臨床人口服用量的15倍。每次按20ml/kg灌胃，每天1次，共120天。試驗期間根據(jù)體重增長每周調整給藥量1次。于給藥60天時各組隨機處死1/3大鼠，于給藥120天時每組處死12只，余鼠在停藥15天時處死，以觀察可能出現(xiàn)的殘留效應及停藥后的恢復情況。三次均按常規(guī)法測血紅細胞計數(shù)、血紅蛋白含量、血小板計數(shù)、半細胞計數(shù)及分類。用羅氏全自動生化分析儀測血清GPT、堿性磷酸酶(ALP)、肌酐(Cr)及尿素氮(BUN)，稱脾重和胸腺重量，計算臟器指數(shù)(毫g/百g體重)，取心、肝、脾、肺、腎、腦、胃、腸、腎上腺、甲狀腺、睪丸或卵巢用10％福爾馬林溶液固定后作病理切片，染色后顯微鏡下觀察組織結構變化。結果如下一、對大鼠體重的影響結果見表21。高劑量組大鼠體重在用藥60天后較對照組輕度增加，但差別不顯著(P＞0.05)。其余各時點低、高劑量的本發(fā)明組合物和對照比較，無明顯差別。
表21本發(fā)明組合物長期給藥對大腦體重的影響


二.對大鼠免疫器官重量的影響結果見表22。和對照組比較，高劑量本發(fā)明組合物在用藥60天、120天時脾、胸腺重量無明顯差別，低劑量本發(fā)明組合物脾重也無明顯變化，低劑量本發(fā)明組合物在用藥60天時和對照組比較，胸腺重量即輕度增加，用藥120天時對照組胸腺指數(shù)下降，而低劑量本發(fā)明組合物組胸腺指數(shù)較對照組明顯為高，差別有顯著性意義(P＜0.05)，但停藥15天時恢復正常。
表23本發(fā)明組合物長期給藥對大鼠免疫器官重量的影響組別 脾指數(shù) 胸腺指數(shù)(毫g/100g體重) (毫g/100g體重)給藥60天對照 286.8±75.3121.0±44.2低劑量 288.8±46.2136.4±25.2高劑量 273.3±52.5120.5±37.6給藥120天對照 298.2±32.2116.8±21.9低劑量 281.0±49.3137.6±21.9*高劑量 269.6±62.2100.7±29.3給藥120天，停藥15天對照 251.6±30.188.6±16.6低劑量 238.3±23.899.4±26.5高劑量 275.8±29.194.1±13.7和對照組比，*P＜0.05三、對大鼠學象的影響結果見表24，和對照比，低、高劑量本發(fā)明組合物組大鼠紅細胞計數(shù)、白細胞計數(shù)及分類，血小板計數(shù)在用藥60天、120天均無明顯差別，用藥60天時各組血紅蛋白含量也無明顯區(qū)別，但用藥120天時，低、高劑量5號方組大鼠血紅蛋白含量較對照組明顯為高，差別有顯著性意義(P分別＜0.05)。
表24本發(fā)明組合物長期給藥對大鼠血象的影響RBC Hb PCWBCWBC 分類(％)組別 (×1012/L) g/L (×109/L)(×109/L) N L 其它給藥60天對照 8.7±1.1 131.1±17.7 676.2±103.4 11.4±0.12 79.2±1.5 19.2±1.7 1.6+0.2低劑量8.6±0.2 130.0±5.4 654.3±97.2 11.2±0.38 81.0±2.1 17.2±2.6 1.8±0.3高劑量8.7±0.4 130.1±7.7 676.8±94.2 10.9±0.14 79.4±1.8 19.3±2.1 1.3±0.4給藥120天對照 7.2±0.6 138.8±7.5 733.2±123.7 14.7±2.7 79.8±7.3 19.7±7.4 0.5±0.7低劑量7.4±0.8 156.3±5.1** 667.3±138.4 14.9±3.6 77.5±5.3 21.7±5.1 0.9±0.8高劑量7.3±0.5 152.7±5.9** 677.0±192.9 15.9±2.5 77.4±7.9 22.5±8.0 0.8±0.9給藥120天，停藥15天對照 7.7±0.6 152.1±5.2 611.4±116.4 17.7±2.2 77.9±2.1 21.4±5.9 0.7±0.7低劑量7.9+±0.4 152.1±5.15 60.0±75.317.6±5.2 78.7±5.7 21.9±3.5 0.9±1.1高劑量7.4±0.8 149.0±11.3 655.0±114.6 16.0±2.9 75.3±7.6 23.9±7.7 0.9±0.9和對照組比，*P＜0.01四、對大鼠肝、腎功能的影響結果見表25。用藥60天、120天時，低、高劑量本發(fā)明組合物組血清GPT、ALP、Cr、BUN和對照組比較均無異常升高，說明本發(fā)明組合物不損害大鼠肝、腎功能。但高劑量組大鼠在用藥120天時血清BUN較對照組顯著為低(P＜0.01)，停藥15天時有所回升，但仍低于對照組，這可能和該藥促進蛋白合成，或抑制其分節(jié)有關。
表25本發(fā)明組合物長期給藥對大鼠肝、腎功能的影響SGPT ALP Cr BUN組別 (U/L) (U/L)(umoL/L)(nmol/L)給藥60天對照 62.0±19.1 240.6±63.8 68.6±24.5 7.25±0.83
低劑量62.6±20.2 243.4±65.370.0±24.9 7.13±1.05高劑量57.5±11.7 226.7±46.571.2±32.3 6.95±0.87給藥120天對照 58.7±8.9193.8±23.576.5±19.9 7.93±0.61低劑量66.5±9.7190.0±24.173.2±17.0 7.84±0.52高劑量59.8±3.1195.0±21.277.0±7.55.33±0.59給藥120天，停藥15天對照 73.3±9.1191.1±14.470.6±6.78.25±0.88低劑量65.6±7.9210.6±25.175.5±5.87.74±0.96高劑量65.3±4.2200.6±4.6 72.7±4.96.38±0.67五、病例解剖學變化肉眼觀察大鼠斷頭處死后立即取出心、肝、脾、肺、腎、腦、胃、腸、腎上腺、甲狀腺、睪丸、或卵巢，肉眼觀察，高、低劑量組動物各臟器均無明顯異常所見。
病理組織學切片觀察結果表明，心、肝、脾、肺、腎、腦、胃、腸、腎上腺、甲狀腺、睪丸、或卵巢，肉眼觀察，高、低劑量組動物各臟器均無明顯病理學改變(詳見病例報告)。
六、對大鼠一般外觀及行為的影響各劑量組大鼠大給藥期間活動、外觀、行為均未出現(xiàn)異常變化。未出現(xiàn)腹瀉等癥狀。
結論1.本藥不影響大鼠活動、外觀及行為2.不影響大鼠生長發(fā)育(體重增長)3.明顯增加大鼠胸腺重量，不影響大鼠脾重4.不影響肝、腎功能。
5.長期給藥促進血紅蛋白合成，對其余造血功能均無不良影響。
6.不會使心、肝、脾、肺、腎、腦、胃、腸、腎上腺、甲狀腺、睪丸、或卵巢發(fā)生器質性病理改變。
綜上所述，本藥高、低劑量長期灌胃給藥(120天)，對鼠無明顯毒性。但有促進血紅蛋白合成、增加胸腺重量、降低血尿素氮等有益影響。
權利要求
1.一種具有提高智力、改善腦能量代謝、促進腦發(fā)育和增強多巴胺能神經(jīng)功能作用的組合物，其特征在于它是由有效成分和/或藥學上或食品上可接受的載體組成，制備其中有效成分的原料包括首烏藤15-20％、當歸10-15％、枸杞8-13％、龜甲8-13％、黃精8-13％、丹參5-10％、五味子4-9％、紅花4-9％、川芎4-9％、遠志4-9％、核桃仁1-5％、地龍1-5％、石菖蒲1-3％、牛黃0.1-0.5％和麝香0.1-0.5％。
2.按照權利要求1所述的組合物，制備其中有效成分的原料包括首烏藤16％、當歸12％、枸杞10％、龜甲10％、黃精10％、丹參8％、五味子6％、紅花6％、川芎6％、遠志6％、核桃仁4％、地龍4％、石菖蒲1.4％、牛黃0.3％和麝香0.3％。
3.按照權利要求1所述的組合物，制備其中有效成分的原料還包括益智仁4-9％。
4.按照權利要求3所述的組合物，制備其中有效成分的原料還包括益智仁5％。
5.按照權利要求1-4所述的組合物，它是口服劑型。
6.按照權利要求5所述的組合物，它是片劑、膠囊、口服液、顆粒劑。
7.一種制備權利要求1-4中任何一項所述的組合物的制備方法，它包括下列步驟將上述原料研成粉末，混合均勻。
8.一種制備權利要求1-4中任何一項所述的組合物的制備方法，它包括下列步驟將其中具有揮發(fā)油的原料當歸和川芎首先提取揮發(fā)油，然后再將藥渣與首烏藤、當歸、枸杞、龜版、鱉甲、黃精、丹參、五味子、紅花、川芎、遠志、核桃仁、地龍、石菖蒲一起水提醇沉制得提取液，濃縮得到浸膏，再將麝香和牛黃單獨研細，將揮發(fā)油、麝香和牛黃藥粉和浸膏混合均勻。
9.權利要求1-6中任何一項所述的藥物組合物在制備具有提高智力、改善腦能量代謝、促進腦發(fā)育或增強多巴胺能神經(jīng)功能的藥物或保健品的用途。
10.權利要求1-6中任何一項所述的藥物組合物在制備治療或預防腦癱、癲癇、腦血管病后遺癥、腦外傷后遺癥等多種腦病、兒童精神發(fā)育遲滯或老年性癡呆的藥物或保健品的用途。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種具有提高智力、改善腦能量代謝、促進腦發(fā)育和增強多巴胺能神經(jīng)功能作用的組合物及其制備方法和用途。該組合物含有首烏藤、石菖蒲等原料組成。它能夠治療或預防兒童精神發(fā)育遲滯、老年性癡呆、腦癱、癲癇、腦血管病后遺癥、腦外傷后遺癥等多種腦病，可用于制備用于因各種腦病而伴發(fā)各種智力低下和肢體功能障礙的患者的藥物或保健品。
文檔編號A61P25/00GK1565573SQ03137470
公開日2005年1月19日 申請日期2003年6月25日 優(yōu)先權日2003年6月25日
發(fā)明者崔瑛 申請人:北京腦康生物科技有限責任公司