專利名稱：作為hedgehog途徑調(diào)節(jié)劑的化合物和組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供了調(diào)節(jié)hedgehog信號傳導(dǎo)途徑的活性的方法。特別是，本發(fā)明提供了抑制異常生長狀態(tài)的方法，所述的異常生長狀態(tài)是由表型例如Ptc失功能、hedgehog獲功能、smoothened獲功能或Gli獲功能引起的，該方法包括將細胞與足夠量的式I化合物接觸。
背景技術(shù)：
在胚胎發(fā)育期間，hedgehog信號傳導(dǎo)途徑對許多過程都是必須的，例如細胞增殖、分化和組織圖式形成的控制。hedgehog信號傳導(dǎo)途徑的異常活性(例如由于活化作用增加)可能具有病理結(jié)果。因此，成人組織中hedgehog途徑的活化作用可以導(dǎo)致特殊類型的癌癥，包括但不限于腦、肌肉和皮膚癌、胰腺癌和小細胞肺癌。hedgehog信號傳導(dǎo)途徑活化作用的增加引起了許多疾病的病理學(xué)和/或癥狀學(xué)。因此，調(diào)節(jié)hedgehog信號傳導(dǎo)途徑活性的分子在此類疾病的治療中用作治療藥物。
發(fā)明概述本發(fā)明應(yīng)用抑制hedgehog信號傳導(dǎo)途徑活化作用的方法和化合物來例如抑制異常生長狀態(tài)，所述的異常生長狀態(tài)是由表型例如Ptc失功能、hedgehog獲功能、smoothened獲功能或Gli獲功能引起的，該方法包括將細胞與足夠量的激動正常的Ptc活性、拮抗正常的hedgehog活性或拮抗smoothened活性的式I化合物接觸以例如逆轉(zhuǎn)或控制異常生長狀態(tài)。
定義“烷基”作為基團以及作為其它基團(例如鹵代烷基和烷氧基)的結(jié)構(gòu)元素可以是直鏈的或支鏈的。C1-4-烷氧基包括甲氧基、乙氧基等。鹵代烷基包括三氟甲基、五氟乙基等。
“芳基”指的是包含六至十個環(huán)碳原子的單環(huán)或稠合二環(huán)芳環(huán)。例如芳基可以是苯基或萘基，優(yōu)選苯基?！皝喎蓟敝傅氖茄苌苑蓟亩r基團。
“雜芳基”被定義為其中一個或多個環(huán)原子為雜原子的上述芳基。例如雜芳基包括吡啶基、吲哚基、吲唑基、喹喔啉基、喹啉基、苯并呋喃基、苯并吡喃基、苯并噻喃基、苯并[1，3]間二氧雜環(huán)戊烯、咪唑基、苯并咪唑基、嘧啶基、呋喃基、唑基、異唑基、三唑基、四唑基、吡唑基、噻吩基等。
“環(huán)烷基”指的是包含指定數(shù)目的環(huán)原子的飽和的或部分不飽和的、單環(huán)、稠合二環(huán)或橋連多環(huán)。例如C3-10環(huán)烷基包括環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基、環(huán)己基等。
“雜環(huán)烷基”表示本申請書中所定義的環(huán)烷基，條件是指定的一個或多個環(huán)碳被選自-O-、-N＝、-NR-、-C(O)-、-S-、-S(O)-或-S(O)2-的基團所代替，其中R是氫、C1-4烷基或氮保護基。例如在本申請書中用于描述本發(fā)明化合物的C3-8雜環(huán)烷基包括嗎啉代、吡咯烷基、吡咯烷基-2-酮、哌嗪基、哌啶基、吡啶基酮、1，4-二氧雜-8-氮雜-螺[4.5]癸-8-基等。
“鹵素”優(yōu)選代表氯或氟，但也可以是溴或碘。
“Hedgehog獲功能”指的是Ptc基因、hedgehog基因或smoothened基因的異常修飾或突變，或者此類基因表達水平的降低(或喪失)，從而引起表型，該表型類似于將細胞與hedgehog蛋白接觸，例如hedgehog途徑的異?；罨饔?。所述的獲功能可以包括Ptc基因產(chǎn)物調(diào)節(jié)Gli(例如Gli1、Gli2和Gli3)基因表達水平的能力喪失。本文所用的術(shù)語“hedgehog獲功能”指的是任何類似的細胞表型(例如顯示出過度增殖)，該表型是由于hedgehog信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中任何地方的改變而發(fā)生的，其包含但不限于hedgehog自身的修飾和突變。例如，由于hedgehog信號傳導(dǎo)途徑的活化作用而產(chǎn)生異常高增殖速率的腫瘤細胞具有“hedgehog獲功能”表型，即使hedgehog在該細胞中沒有突變。
“Patched失功能”指的是Ptc基因的異常修飾或突變，或者此類基因表達水平的降低，從而引起表型，該表型類似于將細胞與hedgehog蛋白接觸，例如hedgehog途徑的異?；罨饔?。所述的失功能可以包括Ptc基因產(chǎn)物調(diào)節(jié)Gli(例如Gli1、Gli2和Gli3)基因表達水平的能力喪失。
“Gli獲功能”指的是Gli基因的異常修飾或突變，或者此類基因表達水平的升高，從而引起表型，該表型類似于將細胞與hedgehog蛋白接觸，例如hedgehog途徑的異?；罨饔谩?br> “Smoothened獲功能”指的是Smo基因的異常修飾或突變，或者此類基因表達水平的升高，從而引起表型，該表型類似于細胞與hedgehog蛋白接觸，例如hedgehog途徑的異?；罨饔?。
“治療”指的是減輕或緩解疾病和/或其伴隨癥狀的方法。
優(yōu)選實施方案的描述本發(fā)明涉及以下發(fā)現(xiàn)式I化合物可以調(diào)節(jié)被hedgehog、patched(Ptc)、gli和/或smoothened調(diào)節(jié)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。
一個實施方案提供了調(diào)節(jié)細胞中的hedgehog途徑的方法，該方法包括將細胞與式I化合物及其N-氧化衍生物、前藥衍生物、保護衍生物、單一異構(gòu)體和異構(gòu)體混合物以及這些化合物的可藥用鹽和溶劑化物(例如水合物)接觸 其中
n選自0、1、2和3；Y選自NR4和S(O)0-2；其中R4選自氫、C1-4烷基、C1-4烷氧基、鹵代C1-4烷基和鹵代C1-4烷氧基；L選自-Z-NR5-、-Z-NR5C(O)-和-C(O)NR5N＝CH-；其中R5選自氫和C1-4烷基；其中Z為C5-10雜芳基；R1選自氫、C1-4烷基、C1-4烷氧基、鹵代C1-4烷基、鹵代C1-4烷氧基和-NHC(O)R5；其中R5選自氫和C1-4烷基；或R1和R4與它們所連接的原子一起形成被1至3個獨立地選擇的R6基團任選取代的咪唑并[1，2-a]吡啶；其中R6選自C1-4烷基、C1-4烷氧基、鹵代C1-4烷基和鹵代C1-4烷氧基；R2選自氫、C1-4烷基、C1-4烷氧基、鹵代C1-4烷基和鹵代C1-4烷氧基；R3選自氫、羥基、鹵素、氰基、硝基、C1-4烷基、C1-4烷氧基、鹵代C1-4烷基、鹵代C1-4烷氧基、-NR5C(O)R5和-NR5R5-；其中R5獨立選自氫和C1-4烷基。
第二方面，本發(fā)明提供了藥物組合物，該藥物組合物包含式I化合物或其N-氧化衍生物、單一異構(gòu)體和異構(gòu)體混合物或其可藥用鹽與一種或多種適合的賦形劑混合。
在另一個實施方案中，關(guān)于式I化合物，其是選自式Ia、Ib、Ic和Id的化合物 其中m選自0、1和2。
在另一個實施方案中，式I化合物選自N-[2-(4-乙氧基-苯基氨基)-4’-甲基-[4，5’]聯(lián)噻唑-2’-基]-丙酰胺；N-[2-(4-甲氧基-苯基氨基)-4’-甲基-[4，5’]聯(lián)噻唑-2’-基]-丙酰胺；2，7-二甲基-咪唑并[1，2-a]吡啶-3-甲酸(4-甲氧基-亞芐基)-酰肼；2，7-二甲基-咪唑并[1，2-a]吡啶-3-甲酸(4-甲基-亞芐基)-酰肼；2，7-二甲基-咪唑并[1，2-a]吡啶-3-甲酸(3-羥基-4-甲氧基-亞芐基)-酰肼；[4-(2，7-二甲基-咪唑并[ 1，2-a]吡啶-3-基)-噻唑-2-基]-(4-乙氧基-苯基)-胺；4-[4-(2，7-二甲基-咪唑并[1，2-a]吡啶-3-基)-噻唑-2-基氨基]-苯酚；[4-(2，7-二甲基-咪唑并[1，2-a]吡啶-3-基)-噻唑-2-基]-(2，4-二甲基-苯基)-胺；(4-氯-苯基)-[4-(2，7-二甲基-咪唑并[1，2-a]吡啶-3-基)-噻唑-2-基]-胺；(2，4-二溴-苯基)-[4-(2-甲基-咪唑并[1，2-a]吡啶-3-基)-噻唑-2-基]-胺；(2，4-二甲基-苯基)-[4-(2-甲基-咪唑并[1，2-a]吡啶-3-基)-噻唑-2-基]-胺；N-{4-[4-(2，7-二甲基-咪唑并[1，2-a]吡啶-3-基)-噻唑-2-基氨基]-苯基}-乙酰胺；4-[4-(2-甲基-咪唑并[1，2-a]吡啶-3-基)-噻唑-2-基氨基]-苯酚；N-{4-[4-(2-甲基-咪唑并[1，2-a]吡啶-3-基)-噻唑-2-基氨基]-苯基}-乙酰胺；(4-氯-苯基)-[4-(2-甲基-咪唑并[1，2-a]吡啶-3-基)-噻唑-2-基]-胺和N-[4-(2-甲基-咪唑并[1，2-a]吡啶-3-基)-噻唑-2-基]-苯甲酰胺。
因此，特別考慮的是干擾hedgehog、Ptc或smoothened信號轉(zhuǎn)導(dǎo)活性方面的式I化合物也將能夠抑制正常細胞和/或具有patched失功能表型、hedgehog獲功能表型、smoothened獲功能表型或Gli獲功能表型的細胞的增殖(或其它生物結(jié)果)。因此，考慮的是，在某些實施方案中，這些化合物可用于抑制正常細胞(例如沒有活化hedgehog途徑的基因突變的細胞)的hedgehog活性。在優(yōu)選的實施方案中，所述的化合物優(yōu)選特別在靶細胞中能夠抑制hedgehog蛋白的至少某些生物活性。
因此，本發(fā)明中的方法包括式I化合物(例如通過抑制smoothened或信號途徑的下游組分的活化作用來激動hedgehog信號傳導(dǎo)的Ptc抑制)在多種細胞、組織和器官(包括正常的細胞、組織和器官以及那些具有Ptc失功能表型、hedgehog獲功能表型、smoothened獲功能表型或Gli獲功能表型的細胞、組織和器官)的修復(fù)和/或功能表現(xiàn)的調(diào)節(jié)中的用途。例如，目標(biāo)方法具有治療和化妝品學(xué)的應(yīng)用調(diào)節(jié)神經(jīng)組織、骨和軟骨的形成和修復(fù)，調(diào)節(jié)精子發(fā)生，調(diào)節(jié)平滑肌，調(diào)節(jié)肺、肝和來源于原腸的其它器官，調(diào)節(jié)造血功能，調(diào)節(jié)皮膚和頭發(fā)生長等。另外，目標(biāo)方法可應(yīng)用于培養(yǎng)(體外)的細胞或整個動物(體內(nèi))的細胞中。
在另一個實施方案中，目標(biāo)方法可以是治療具有Ptc失功能表型、hedgehog獲功能表型、smoothened獲功能表型或Gli獲功能表型的上皮細胞。例如，目標(biāo)方法可用于治療或預(yù)防基底細胞癌或其它的hedgehog途徑相關(guān)障礙。
在某些實施方案中，式I化合物可以通過與smoothened或其下游蛋白結(jié)合來抑制hedgehog途徑的活化作用。在某些實施方案中，目標(biāo)拮抗劑可以通過與patched結(jié)合來抑制hedgehog途徑的活化作用。
在另一個優(yōu)選的實施方案中，目標(biāo)方法可以用作惡性成神經(jīng)管細胞瘤和其它原發(fā)性CNS惡性神經(jīng)外胚層瘤的治療方案的一部分。
另一方面，本發(fā)明提供了藥物制劑，該藥物制劑包括作為活性成分的hedgehog信號傳導(dǎo)調(diào)節(jié)劑(例如式I化合物)、Ptc激動劑、smoothened拮抗劑或下游hedgehog途徑蛋白拮抗劑(例如本文中描述的)，其以抑制體內(nèi)增殖或Ptc失功能、hedgehog獲功能、smoothened獲功能或Gli獲功能的其它生物結(jié)果的足夠的量配制。
應(yīng)用式I化合物、patched激動劑、smoothened拮抗劑或下游hedgehog途徑蛋白拮抗劑的目標(biāo)治療對于人類和動物個體都是有效的?？蓱?yīng)用本發(fā)明的動物個體擴展到作為寵物或商業(yè)目的飼養(yǎng)的家畜或牲畜。實例為狗、貓、牛、馬、綿羊、豬和山羊。
藥理學(xué)和應(yīng)用本發(fā)明應(yīng)用抑制hedgehog信號傳導(dǎo)途徑活化作用的方法和化合物來例如抑制異常生長狀態(tài)，所述的異常生長狀態(tài)是由表型例如Ptc失功能、hedgehog獲功能、smoothened獲功能或Gli獲功能引起的，該方法包括將細胞與足夠量的激動正常的Ptc活性、拮抗正常的hedgehog活性、拮抗smoothened活性或拮抗Gli活性的式I化合物接觸以例如逆轉(zhuǎn)或控制異常生長狀態(tài)。
在脊椎動物發(fā)育的過程中，信號分子的hedgehog家族成員介導(dǎo)許多重要的近程和遠程圖式形成過程。圖式形成是使胚胎細胞形成分化組織的有序空間排列的活性。高等生物的機體復(fù)雜性是在胚胎發(fā)生的過程中通過細胞內(nèi)譜系和細胞外信號傳導(dǎo)之間的相互作用產(chǎn)生的。誘導(dǎo)的相互作用對于來自最早建立的機體發(fā)育布局的脊椎動物發(fā)育中的胚胎圖式形成、器官系統(tǒng)的圖式形成、組織分化過程中多種細胞類型的產(chǎn)生是必須的。發(fā)育的細胞相互作用的效果是不同的通過誘導(dǎo)細胞(其不同于響應(yīng)細胞的未誘導(dǎo)和誘導(dǎo)狀態(tài))使響應(yīng)的細胞由細胞分化的一種途徑轉(zhuǎn)向另一種途徑(誘導(dǎo)作用)。有時細胞誘導(dǎo)它們的鄰近細胞像它們本身一樣分化(自體誘導(dǎo))；在其它的情況中，細胞抑制它的鄰近細胞分像它們本身一樣分化。早期發(fā)育中的細胞相互作用可以是連續(xù)的，因此兩種細胞類型之間的最初誘導(dǎo)引起多樣性的漸進擴增。另外，誘導(dǎo)的相互作用不僅在胚胎細胞中發(fā)生，而且也在成人細胞中發(fā)生，并且可以用于建立和保持形態(tài)發(fā)生的圖式以及誘導(dǎo)分化。
hedgehog基因的脊椎動物家族包括存在于哺乳動物中被稱為Desert(Dhh)hedgehog、Sonic(Shh)hedgehog和Indian(Ihh)hedgehog的三個成員，它們都編碼分泌性蛋白。這些多種Hedgehog蛋白包括信號肽、高度保守的N-末端區(qū)域和更分散的C-末端區(qū)域。生物化學(xué)研究已經(jīng)表明Hh前體蛋白的自我蛋白酶解是通過內(nèi)部的硫代酸酯中間體進行的，該硫代酸酯中間體隨后在親核取代中被裂開。親核體可能是親脂性小分子，該小分子共價結(jié)合到N-肽的C-末端，將其束縛到細胞表面。生物學(xué)含義很深奧。由于束縛，在生成Hedgehog的細胞表面產(chǎn)生了N-末端Hedgehog肽的局部高濃度。這個N-末端肽對于近程和遠程Hedgehog信號傳導(dǎo)活性均是必須和充足的。
失活的Hedgehog信號傳導(dǎo)途徑是跨膜蛋白受體Patched(Ptc)抑制Smoothened(Smo)(七跨膜蛋白)的活性的地方。通過與胞質(zhì)蛋白(包括融合蛋白和融合蛋白的阻抑蛋白(Sufu))相互作用來阻止轉(zhuǎn)錄因子Gli(Hh信號傳導(dǎo)的下游組分)進入細胞核。因此，hedgehog靶基因的轉(zhuǎn)錄活化作用被阻抑。通過將三種哺乳動物配體(Dhh、Shh或Ihh)中任何一個與Ptc結(jié)合來開始途徑的活化作用。配體結(jié)合引起Smo阻抑的逆轉(zhuǎn)，從而活化級聯(lián)，該級聯(lián)引起活化形式的轉(zhuǎn)錄因子Gli向細胞核的易位。核Gli活化目靶基因表達，包括Ptc和Gli本身。
Hedgehog信號傳導(dǎo)水平的增加對于開始癌形成是足夠的，并且對于腫瘤生存是必需的。這些癌包括但不限于前列腺癌(“前列腺再生、瘤形成和轉(zhuǎn)移中的Hedgehog信號傳導(dǎo)(Hedgehog signalling in prostate regeneration，neoplasia and metastasis)”，Karhadkar SS，Bova GS，Abdallah N，Dhara S，Gardner D，Maitra A，Isaacs JT，Berman DM，Beachy PA.，Nature.2004Oct 7；431(7009)707-12；“通過干擾SONIC HEDGEHOG-GLI1信號傳導(dǎo)而抑制前列腺癌增生(Inhibition of prostate cancer proliferation byinterference with SONIC HEDGEHOG-GLI1 signaling)”，Sanchez P，Hernandez AM，Stecca B，Kahler AJ，DeGueme AM，Barrett A，Beyna M，Datta MW，Datta S，Ruiz i Altaba A.，Proc Natl Acad Sci U S A.2004 Aug24；101(34)12561-6)、乳腺癌(“Hedgehog信號傳導(dǎo)途徑是患有乳腺癌的患者的新治療靶點(Hedgehog signaling pathway is a new therapeutictarget for patients with breast cancer)”，Kubo M，Nakamura M，Tasaki A，Yamanaka N，Nakashima H，Nomura M，Kuroki S，Katano M.，CancerRes.2004 Sep 1；64(17)6071-4)、成神經(jīng)管細胞瘤(“通過hedgehog途徑的阻斷而抑制成神經(jīng)管細胞瘤的生長(Medulloblastoma growth inhibition byhedgehog pathway blockade)”，Berman DM，Karhadkar SS，Hallahan AR，Pritchard JI，Eberhart CG，Watkins DN，Chen JK，Cooper MK，Taipale J，Olson JM，Beachy PA.，Science.2002 Aug30；297(5586)1559-61)、基底細胞癌(“作用于基底細胞癌樣損害的hedgehog信號傳導(dǎo)途徑的小分子抑制劑的鑒別(Identification of a small molecule inhibitor of the hedgehogsignalung pathwayeffects on basal cell carcinoma-like lesions)”，WilliamsJA，Guicherit OM，Zaharian BI，Xu Y，Chai L，Wichterle H，Kon C，Gatchalian C，Porter JA，Rubin LL，Wang FY.，Proc Natl Acad Sci U S A.2003 Apr 15；100(8)4616-21；“散發(fā)性基底細胞癌中活化Smoothened突變(Activating Smoothened mutations in sporadic basal-cell carcinoma)”，Xie J，Murone M，Luoh SM，Ryan A，Gu Q，Zhang C，Bonifas JM，LamCW，Hynes M，Goddard A，Rosenthal A，Epstein EH Jr，de Sauvage FJ.，Nature.1998 Jan 1；391(6662)90-2)、胰腺癌(“Hedgehog是胰腺癌腫瘤發(fā)生的早期和晚期介體(Hedgehog is an early and late mediator of pancreaticcancer tu morigenesis)”，Thayer SP，di Magliano MP，Heiser PW，NielsenCM，Roberts DJ，Lauwers GY，Qi YP，Gysin S，F(xiàn)ernandez-del Castillo C，Yajnik V，Antoniu B，McMahon M，Warshaw AL，Hebrok M.，Nature.2003 Oct 23；425(6960)851-6；“消化道腫瘤生長中Hedgehog配體的刺激作用的普遍需要(Widespread requirement for Hedgehog ligandstimulation in growth of digestive tract tumours)”，Berman DM，Karhadkar SS，Maitra A，Montes De Oca R，Gerstenblith MR，Briggs K，Parker AR，Shimada Y，Eshleman JR，Watkins DN，Beachy PA.，Nature.2003 Oct 23；425(6960)846-51)以及小細胞肺癌(“氣道上皮祖細胞和小細胞肺癌中的Hedgehog信號傳導(dǎo)(Hedgehog signalling within airway epithelialprogenitors and in small-cell lung cancer)”，Watkins DN，Berman DM，Burkholder SG，Wang B，Beachy PA，Baylin SB.，Nature.2003 Mar20；422(6929)313-7)。
根據(jù)前述，本發(fā)明進一步提供了在需要該治療的個體中預(yù)防或治療上述任何疾病或障礙的方法，該方法包括給所述個體施用治療有效量(見下文的“施用和藥物組合物”)的式I化合物或其可藥用鹽。對于上述任何用途，需要的劑量將取決于施用方式、待治療的特殊病癥以及預(yù)期的效果而變化。
施用和藥物組合物通常，本發(fā)明化合物以治療有效量通過本領(lǐng)域熟知的任何常規(guī)的和可接受的方式單獨施用或與一種或多種治療劑組合施用。治療有效量可以取決于疾病的嚴重程度、個體的年齡和相對健康狀況、所用化合物的潛能以及其它因素而廣泛地變化。通常，在日劑量約0.03mg/kg至2.5mg/kg(體重)顯示可以系統(tǒng)得到滿意的結(jié)果。在較大的哺乳動物(例如人)中指定的日劑量范圍為約0.5mg至約100mg，其最佳例如以一天至多四次的分劑量或緩釋形式施用。口服施用的適合的單位劑型包含約1mg至50mg活性成份。
本發(fā)明化合物可以作為藥物組合物以任何常規(guī)方式施用，特別是腸道施用(例如口服，例如以片劑或膠囊劑形式)或非腸道施用(例如以可注射溶液劑或混懸液形式)、局部施用(例如以洗劑、凝膠劑、軟膏劑或乳劑形式)或以鼻劑或栓劑的形式。通過常規(guī)的混合、制?；虬路椒ㄖ苽浒坞x形式或可藥用鹽形式的本發(fā)明化合物以及至少一種可藥用載體或稀釋劑的藥物組合物。例如，口服組合物可以是片劑或明膠膠囊劑，該片劑或明膠膠囊劑包含活性成份以及a)稀釋劑，例如乳糖、葡萄糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇、纖維素和/或甘氨酸；b)潤滑劑，例如二氧化硅、滑石粉、硬脂酸、硬脂酸鎂或鈣鹽和/或聚乙二醇；對于片劑其中也包含c)粘合劑，例如硅酸鎂鋁、淀粉糊、明膠、黃蓍膠、甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉和/或聚乙烯吡咯烷酮；如果需要，其中還包括d)崩解劑，例如淀粉、瓊脂、海藻酸或海藻酸鈉鹽或者泡騰混合物；和/或e)吸附劑、著色劑、矯味劑和甜味劑?？勺⑸涞慕M合物可以是等滲水溶液劑或混懸劑，并且栓劑可以從脂肪乳劑或混懸劑制備。組合物可以是滅菌的和/或包含添加劑，例如防腐劑、穩(wěn)定劑、潤濕劑或乳化劑、溶液促進劑、調(diào)節(jié)滲透壓的鹽和/或緩沖劑。另外，也可以包含其它在治療上有價值的物質(zhì)。經(jīng)皮應(yīng)用的適合制劑包括有效量的本發(fā)明化合物和載體。載體可以包括有助于通過宿主皮膚的可吸收的藥理學(xué)上可接受的溶劑。例如，經(jīng)皮裝置是以繃帶的形式，該形式包括背襯層、包含化合物(任選包含載體)的儲庫、任選速率控制屏障(以在延長的時間周期內(nèi)以可控的和預(yù)先確定的速率將化合物傳遞至宿主的皮膚)以及確保裝置至皮膚的方法。也可以應(yīng)用基質(zhì)經(jīng)皮制劑。局部應(yīng)用(例如皮膚和眼)的適合的制劑優(yōu)選本領(lǐng)域眾所周知的水溶液劑、軟膏劑、乳劑或凝膠劑。這些可以包含增溶劑、穩(wěn)定劑、張力增強劑、緩沖劑和防腐劑。
本發(fā)明化合物可以以治療有效量與一種或多種治療劑組合(藥物組合)施用。例如，與免疫調(diào)節(jié)劑或抗炎物質(zhì)或其它抗腫瘤治療劑一起可以產(chǎn)生協(xié)同作用。當(dāng)本發(fā)明化合物與其它治療劑聯(lián)合施用時，聯(lián)合施用的化合物的劑量將取決于所應(yīng)用的聯(lián)合藥物的類型、應(yīng)用的特殊藥物、治療的病癥等而變化。
本發(fā)明也提供了藥物組合，例如藥盒，該藥盒包括a)第一個藥物，其為本文公開的游離形式或可藥用鹽形式的本發(fā)明化合物，以及b)至少一種聯(lián)合藥物。藥盒可以包括其施用說明書。
本文所用的術(shù)語“聯(lián)合施用”或“組合施用”等指的是將選擇的治療劑施用于單一患者，并且旨在包括治療方案，在該治療方案中不需要通過相同的施用途徑或在相同的時間施用藥物。
本文所用的術(shù)語“藥物組合”指的是將一種以上的活性成份混合或組合而產(chǎn)生的產(chǎn)物，并且包括活性成份的固定組合和非固定組合。術(shù)語“固定組合”指的是將活性成份(例如式I化合物)和聯(lián)合藥物以單一實體或劑量的形式同時施用于患者。術(shù)語“非固定組合”指的是將活性成份(例如式I化合物)和聯(lián)合藥物作為不同的實體同時、共同或依次施用于患者而沒有特殊的時間限制，其中所述的施用在患者體內(nèi)提供了2種化合物的治療有效水平。后一種也應(yīng)用于雞尾酒療法中，例如施用3種或多種活性成份。
制備本發(fā)明化合物的方法本發(fā)明也包括制備本發(fā)明化合物的方法。在所述的反應(yīng)中，需要保護反應(yīng)官能團，例如羥基、氨基、亞氨基、硫代或羧基(這些基團是終產(chǎn)物所需要的)，以避免它們參與不希望的反應(yīng)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)操作可以應(yīng)用常規(guī)的保護基，例如參見T.W.Greene and P.G.M.Wuts in“Protective Groups inOrganic Chemistry”，John Wiley and Sons，1991。
其中L為-ZNR5-(例如Z是噻唑)的式I化合物可以通過以下反應(yīng)流程圖I中的方法制備反應(yīng)流程圖I 其中，n、Y、R1、R2、R3和R5如發(fā)明概述中式I的定義。式I化合物可以通過在適合的溶劑(例如乙醇等)的存在下，在約50℃至約100℃的溫度范圍內(nèi)，將式2化合物與式3化合物反應(yīng)而制備。反應(yīng)完成需要進行約20小時。這些反應(yīng)條件也可以用于合成其中L為-ZNR5C(O)-的本發(fā)明化合物。
其中L為-C(O)NR5N＝CH-的式I化合物可以通過以下反應(yīng)流程圖II中的方法制備反應(yīng)流程圖II 其中，n、Y、R1、R2、R3和R5如發(fā)明概述中式I的定義。首先，式6化合物可以通過在適合的溶劑(例如二氯甲烷等)的存在下，在約10℃至約40℃的溫度范圍內(nèi)，將式4化合物與式5化合物反應(yīng)而制備。其次，式I化合物可以通過在適合的溶劑(例如THF等)、適合的強堿(例如氫化鋰等)的存在下，將式6化合物與式7化合物反應(yīng)而制備。該反應(yīng)在約0℃至約10℃的溫度范圍內(nèi)進行并且反應(yīng)完成需要進行約5小時。
合成式I化合物的詳細實例見下文的實施例。
制備本發(fā)明化合物的另外的方法通過將游離堿形式的化合物與可藥用的無機或有機酸反應(yīng)而將本發(fā)明化合物制備成可藥用酸加成鹽。另外，本發(fā)明化合物的可藥用堿加成鹽可以通過將游離酸形式的化合物與可藥用無機或有機堿反應(yīng)而制備。
另外，本發(fā)明化合物的鹽形式可以應(yīng)用原料或中間體的鹽制備。
游離酸或游離堿形式的本發(fā)明化合物可以分別從相應(yīng)的堿加成鹽或酸加成鹽形式制備。例如通過用適合的堿(例如氫氧化銨溶液、氫氧化鈉等)處理，可以將酸加成鹽形式的本發(fā)明化合物轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的游離堿。通過用適合的酸(例如鹽酸等)處理，可以將堿加成鹽形式的本發(fā)明化合物轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的游離酸。
在0℃至80℃下，在適合的惰性有機溶劑(例如乙腈、乙醇、含水二烷等)中，通過用還原劑(例如硫、二氧化硫、三苯膦、硼氫化鋰、硼氫化鈉、三氯化磷、三溴化磷等)處理，可以從本發(fā)明化合物的N-氧化物制備非氧化形式的本發(fā)明化合物。
本發(fā)明化合物的前藥衍生物可以通過本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的方法制備(例如，詳見Saulnier等人，(1994)，Bioorganic andMedicinal-Chemistry Letters，Vol 4，p.1985)。例如，適合的前藥可以通過將非衍生的本發(fā)明化合物與適合的氨甲酰化試劑(例如1，1-acyloxyalkylcarbanochloridate、碳酸對-硝基苯基酯等)反應(yīng)而制備。
本發(fā)明化合物的保護衍生物可以通過本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的方法制備?？蓱?yīng)用于保護基的引入和脫去的技術(shù)的詳細描述可參見T.W.Greene，“Protecting Groups in Organic Chemistry”，3rdedition，JohnWiley and Sons，Inc.，1999。
在本發(fā)明的制備過程中，本發(fā)明化合物可以方便地制備或形成溶劑化物(例如水合物)。本發(fā)明化合物的水合物可以通過應(yīng)用有機溶劑(例如二氧芑、四氫呋喃或甲醇)從水/有機溶劑混合物中重結(jié)晶而方便地制備。
本發(fā)明化合物可以通過以下方法制備成其單獨的立體異構(gòu)體將化合物的外消旋體混合物與旋光拆分試劑反應(yīng)以形成一對非對映異構(gòu)體化合物，將非對映異構(gòu)體分離并且回收旋光純的對映異構(gòu)體。而對映異構(gòu)體的拆分可以應(yīng)用本發(fā)明化合物的共價非對映異構(gòu)體衍生物進行，優(yōu)選可以離解的絡(luò)合物(例如結(jié)晶的非對映異構(gòu)體鹽)。非對映異構(gòu)體具有獨特的物理學(xué)特性(例如熔點、沸點、溶解性和反應(yīng)性等)并且可以通過利用這些不同容易地分離?？梢酝ㄟ^色譜，或優(yōu)選通過基于溶解性不同的分離/拆分技術(shù)將非對映異構(gòu)體分離。然后，通過不會引起外消旋化的任何實用的方法，應(yīng)用拆分試劑，回收旋光純的對映異構(gòu)體?？蓱?yīng)用的將化合物的立體異構(gòu)體從它們的外消旋體混合物中拆分出來的技術(shù)的詳細描述可參見JeanJacques，Andre Collet，Samuel H.Wilen，“Enantiomers，Racemates andResolutions”，John Wiley And Sons，Inc.，1981。
簡而言之，式I化合物可以通過以下方法制備，該方法涉及(a)反應(yīng)流程圖I和II的方法；以及(b)任選將本發(fā)明化合物轉(zhuǎn)化為可藥用鹽；(c)任選將本發(fā)明化合物的鹽形式轉(zhuǎn)化為非鹽形式；(d)任選將本發(fā)明化合物的非氧化形式轉(zhuǎn)化為可藥用N-氧化物；(e)任選將本發(fā)明化合物的N-氧化物形式轉(zhuǎn)化為其非氧化形式；(f)任選將本發(fā)明化合物的單一異構(gòu)體從異構(gòu)體混合物中拆分出來；(g)任選將非衍生化的本發(fā)明化合物轉(zhuǎn)化為可藥用前藥衍生物；以及(h)任選將本發(fā)明化合物的前藥衍生物轉(zhuǎn)化為其非衍生化形式。
在原料的制備沒有特殊地描述的范圍內(nèi)，化合物為已知的或可以通過與本領(lǐng)域公知的方法類似的方法或下文的實例中公開的方法制備。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員之一將意識到上述轉(zhuǎn)化僅是制備本發(fā)明化合物的方法的代表，并且也可以類似地應(yīng)用其它眾所周知的方法。
實施例通過以下說明本發(fā)明的式I化合物的制備的實施例，進一步列舉了本發(fā)明，但不對本發(fā)明構(gòu)成限制。
實施例1(4-乙氧基-苯基)-[4-(2-甲基-咪唑并[1，2-a]吡啶-3-基)-噻唑-2-基]-胺
向2-甲基-咪唑并[1，2-a]吡啶(1.0g，7.0mmol)在CS2(10mL)中的混合物中加入AlCl3(2.9g)和氯乙酰氯(1.1mL)。將混合物回流4小時并且在室溫下攪拌過夜。向混合物中加入碎冰和水并且用NaHCO3將反應(yīng)中和?；旌衔镉肅H2Cl2(5×50mL)萃取并且將有機層合并并在真空下干燥。通過用CH2Cl2/乙醚重結(jié)晶將產(chǎn)生的固體純化以得到為棕色固體的氯酮(0.95g，65％)。將208mg氯酮溶于15mL乙醇中。將400mg對-乙氧基苯基硫脲加入至混合物中。將反應(yīng)混合物回流3小時并且通過快速柱色譜(CH2Cl2/MeOH＝20/1)純化終產(chǎn)物，得到(4-乙氧基-苯基)-[4-(2-甲基-咪唑并[1，2-a]吡啶-3-基)-噻唑-2-基]-胺1H NMR(500MHz，CD3OD)δ9.04(d，J＝7.0Hz)，7.58-7.54(m，3H)，7.40-7.37(m，1H)，7.01-6.95(m，3H)，6.90(s，1H)，4.09(q，J＝7.0Hz，2H)，2.64(s，3H)，1.45(t，J＝7.0Hz，3H)。
應(yīng)用適合的原料，通過重復(fù)以上實例中描述的方法，獲得以下式I化合物，其鑒定如表1所示。
表1
試驗本發(fā)明的化合物以評價它們抑制hedgehog信號傳導(dǎo)途徑的能力。
Hh途徑抑制的Gli-Luc報道基因試驗在37℃，5％CO2于空氣氣氛中，在用10％熱滅活的FBS(Gibco/Invitrogen，Carlsbad，CA)、50單位/mL青霉素和50μg/mL鏈霉素(Gibco/Invitrogen，Carlsbad，CA)補充的MEM-α培養(yǎng)基中培養(yǎng)小鼠胚胎中胚層成纖維C3H10T1/2細胞(從American Type Culture Collection，ATCC，Manassas，VA獲得)。按照生產(chǎn)商的方法，用30μLFuGENE6(Roche Diagnostics，Indianapolis，IN)將8μg Gli-報道基因質(zhì)粒和2μg Renilla熒光素酶對照報道基因(Promega，Madison，WI)共轉(zhuǎn)染至于10cm盤中的C3H10T1/2細胞中。12小時后，將細胞進行胰蛋白酶消化并且重新置于含有2％FBS補充的MEM-α培養(yǎng)基的96-孔板中，并且用重組小鼠Shh蛋白(在大腸桿菌中表達的，2μg/mL)和不同濃度的本發(fā)明化合物處理。48小時后，用Dual-GloTM熒光素酶測定系統(tǒng)(Promega，Madison，WI)測定螢火蟲熒光素酶和Renilla熒光素酶的活性。將螢火蟲熒光素酶的活性標(biāo)準(zhǔn)化至Renilla熒光素酶的活性。當(dāng)化合物的作用降低50％的熒光信號時測量EC50。
式I化合物優(yōu)選的EC50低于500nM，更優(yōu)選低于200nM。例如(4-乙氧基-苯基)-[4-(2-甲基-咪唑并[1，2-a]吡啶-3-基)-噻唑-2-基]-胺(實施例1)阻止Shh介導(dǎo)的途徑的活化作用的EC50為30nM。
細胞毒性試驗根據(jù)以下方法，進行細胞毒性試驗以比較本發(fā)明化合物對成神經(jīng)管細胞瘤細胞(Daoy細胞)、基底細胞癌細胞(TE354.T細胞)和對照細胞(人正常成纖維細胞)的作用。
Daoy細胞(成神經(jīng)管細胞瘤細胞系)購自ATCC，并且將其在37℃、5％CO2于空氣氣氛中，在極限必需培養(yǎng)基(Eagle)和10％FBS中培養(yǎng)，該極限必需培養(yǎng)基含有2mM L-谷氨酰胺和Earle’s BSS、并且調(diào)節(jié)至含有1.5g/L碳酸氫鈉、0.1mM非必需氨基酸和1.0mM丙酮酸鈉。
將TE354.T細胞(來源于ATCC)在含有4mM L-谷氨酰胺胎牛血清和10％FBS的Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基中培養(yǎng)。
將正常人皮膚成纖維細胞(Clonetics)在成纖維細胞生長培養(yǎng)基(Clonetics)中培養(yǎng)。
將以上各細胞系分別接種于96-孔板上并且培養(yǎng)至密度為5,000-10,000細胞/孔。將不同濃度的本發(fā)明化合物加入至細胞培養(yǎng)基中。2天后，按照生產(chǎn)商的方法，用Cell Titer-Glo熒光細胞活性檢測系統(tǒng)(Promega)評價細胞活性。通過熒光信號傳導(dǎo)直接測量細胞活性并且當(dāng)信號被抑制50％時測量EC50。
式I化合物優(yōu)選的EC50低于500nM，更優(yōu)選低于200nM。例如，(4-乙氧基-苯基)-[4-(2-甲基-咪唑并[1，2-a]吡啶-3-基)-噻唑-2-基]-胺(實施例1)對抗Daoy細胞增殖的EC50為30nM，而對正常人皮膚成纖維細胞(對照)沒有毒性作用。
可以理解本文中描述的實例和實施方案僅是說明的目的，并且對其眾所周知的多種修飾或改變將給本領(lǐng)域的技術(shù)人員以建議并且包含于本申請的宗旨和范圍以及附加權(quán)利要求的范圍內(nèi)。本文引用的所有出版物、專利、專利申請為了全部目的并入本文作為參考。
權(quán)利要求
1.抑制細胞的hedgehog途徑的方法，該方法包括將細胞與式I化合物及其可藥用鹽、水合物、溶劑化物和異構(gòu)體接觸 其中n選自0、1、2和3；Y選自NR4和S(O)0-2；其中R4選自氫、C1-4烷基、C1-4烷氧基、鹵代C1-4烷基和鹵代C1-4烷氧基；L選自-Z-NR5-、-Z-NR5C(O)-和-C(O)NR5N＝CH-；其中R5選自氫和C1-4烷基；其中Z為C5-10雜芳基；R1選自氫、C1-4烷基、C1-4烷氧基、鹵代C1-4烷基、鹵代C1-4烷氧基和-NHC(O)R5；其中R5選自氫和C1-4烷基；或R1和R4與它們所連接的原子一起形成被1至3個獨立地選擇的R6基團任選取代的咪唑并[1，2-a]吡啶；其中R6選自C1-4烷基、C1-4烷氧基、鹵代C1-4烷基和鹵代C1-4烷氧基；R2選自氫、C1-4烷基、C1-4烷氧基、鹵代C1-4烷基和鹵代C1-4烷氧基；R3選自氫、羥基、鹵素、氰基、硝基、C1-4烷基、C1-4烷氧基、鹵代C1-4烷基、鹵代C1-4烷氧基、-NR5C(O)R5和-NR5R5-；其中R5獨立選自氫和C1-4烷基。
2.權(quán)利要求1的方法，其中化合物選自式Ia、Ib、Ic和Id 其中m選自0、1和2。
3.權(quán)利要求2的方法，其中化合物選自N-[2-(4-乙氧基-苯基氨基)-4’-甲基-[4，5’]聯(lián)噻唑-2’-基]-丙酰胺；N-[2-(4-甲氧基-苯基氨基)-4’-甲基-[4，5’]聯(lián)噻唑-2’-基]-丙酰胺；2，7-二甲基-咪唑并[1，2-a]吡啶-3-甲酸(4-甲氧基-亞芐基)-酰肼；2，7-二甲基-咪唑并[1，2-a]吡啶-3-甲酸(4-甲基-亞芐基)-酰肼；2，7-二甲基-咪唑并[1，2-a]吡啶-3-甲酸(3-羥基-4-甲氧基-亞芐基)-酰肼；[4-(2，7-二甲基-咪唑并[1，2-a]吡啶-3-基)-噻唑-2-基]-(4-乙氧基-苯基)-胺；4-[4-(2，7-二甲基-咪唑并[1，2-a]吡啶-3-基)-噻唑-2-基氨基]-苯酚；[4-(2，7-二甲基-咪唑并[1，2-a]吡啶-3-基)-噻唑-2-基]-(2，4-二甲基-苯基)-胺；(4-氯-苯基)-[4-(2，7-二甲基-咪唑并[1，2-a]吡啶-3-基)-噻唑-2-基]-胺；(2，4-二溴-苯基)-[4-(2-甲基-咪唑并[1，2-a]吡啶-3-基)-噻唑-2-基]-胺；(2，4-二甲基-苯基)-[4-(2-甲基-咪唑并[1，2-a]吡啶-3-基)-噻唑-2-基]-胺；N-{4-[4-(2，7-二甲基-咪唑并[1，2-a]吡啶-3-基)-噻唑-2-基氨基]-苯基}-乙酰胺；4-[4-(2-甲基-咪唑并[1，2-a]吡啶-3-基)-噻唑-2-基氨基]-苯酚；N-{4-[4-(2-甲基-咪唑并[1，2-a]吡啶-3-基)-噻唑-2-基氨基]-苯基}-乙酰胺；(4-氯-苯基)-[4-(2-甲基-咪唑并[1，2-a]吡啶-3-基)-噻唑-2-基]-胺和N-[4-(2-甲基-咪唑并[1，2-a]吡啶-3-基)-噻唑-2-基]-苯甲酰胺。
4.權(quán)利要求1的方法，其中細胞具有Pte失功能表型、hedgehog獲功能表型、smoothened獲功能表型或Gli獲功能表型。
5.權(quán)利要求1的方法，其中細胞在體內(nèi)和體外與hedgehog拮抗劑接觸。
6.權(quán)利要求1的方法，其中化合物作為治療應(yīng)用的部分施用于動物。
7.權(quán)利要求7的方法，其中治療應(yīng)用選自胰腺癌、前列腺癌、成神經(jīng)管細胞瘤、基底細胞癌和小細胞肺癌。
8.抑制不希望的細胞增殖的方法，該方法包括將細胞與式I化合物及其可藥用鹽、水合物、溶劑化物和異構(gòu)體接觸 其中n選自0、1、2和3；Y選自NR4和S(O)0-2；其中R4選自氫、C1-4烷基、C1-4烷氧基、鹵代C1-4烷基和鹵代C1-4烷氧基；L選自-Z-NR5-、-Z-NR5C(O)-和-C(O)NR5N＝CH-；其中R5選自氫和C1-4烷基；其中Z為C5-10雜芳基；R1選自氫、C1-4烷基、C1-4烷氧基、鹵代C1-4烷基、鹵代C1-4烷氧基和-NHC(O)R5；其中R5選自氫和C1-4烷基；或R1和R4與它們所連接的原子一起形成被1至3個獨立地選擇的R6基團任選取代的咪唑并[1，2-a]吡啶；其中R6選自C1-4烷基、C1-4烷氧基、鹵代C1-4烷基和鹵代C1-4烷氧基；R2選自氫、C1-4烷基、C1-4烷氧基、鹵代C1-4烷基和鹵代C1-4烷氧基；R3選自氫、羥基、鹵素、氰基、硝基、C1-4烷基、C1-4烷氧基、鹵代C1-4烷基、鹵代C1-4烷氧基、-NR5C(O)R5和-NR5R5-；其中R5獨立選自氫和C1-4烷基。
9.權(quán)利要求8的方法，其中化合物選自式Ia、Ib、Ic和Id 其中m選自0、1和2。
10.權(quán)利要求9的方法，其中化合物選自N-[2-(4-乙氧基-苯基氨基)-4’-甲基-[4，5’]聯(lián)噻唑-2’-基]-丙酰胺；N-[2-(4-甲氧基-苯基氨基)-4’-甲基-[4，5’]聯(lián)噻唑-2’-基]-丙酰胺；2，7-二甲基-咪唑并[1，2-a]吡啶-3-甲酸(4-甲氧基-亞芐基)-酰肼；2，7-二甲基-咪唑并[1，2-a]吡啶-3-甲酸(4-甲基-亞芐基)-酰肼；2，7-二甲基-咪唑并[1，2-a]吡啶-3-甲酸(3-羥基-4-甲氧基-亞芐基)-酰肼；[4-(2，7-二甲基-咪唑并[1，2-a]吡啶-3-基)-噻唑-2-基]-(4-乙氧基-苯基)-胺；4-[4-(2，7-二甲基-咪唑并[1，2-a]吡啶-3-基)-噻唑-2-基氨基]-苯酚；[4-(2，7-二甲基-咪唑并[1，2-a]吡啶-3-基)-噻唑-2-基]-(2，4-二甲基-苯基)-胺；(4-氯-苯基)-[4-(2，7-二甲基-咪唑并[1，2-a]吡啶-3-基)-噻唑-2-基]-胺；(2，4-二溴-苯基)-[4-(2-甲基-咪唑并[1，2-a]吡啶-3-基)-噻唑-2-基]-胺；(2，4-二甲基-苯基)-[4-(2-甲基-咪唑并[1，2-a]吡啶-3-基)-噻唑-2-基]-胺；N-{4-[4-(2，7-二甲基-咪唑并[1，2-a]吡啶-3-基)-噻唑-2-基氨基]-苯基}-乙酰胺；4-[4-(2-甲基-咪唑并[1，2-a]吡啶-3-基)-噻唑-2-基氨基]-苯酚；N-{4-[4-(2-甲基-咪唑并[1，2-a]吡啶-3-基)-噻唑-2-基氨基]-苯基}-乙酰胺；(4-氯-苯基)-[4-(2-甲基-咪唑并[1，2-a]吡啶-3-基)-噻唑-2-基]-胺和N-[4-(2-甲基-咪唑并[1，2-a]吡啶-3-基)-噻唑-2-基]-苯甲酰胺。
11.權(quán)利要求8的方法，其中細胞選自胰腺癌、前列腺癌、成神經(jīng)管細胞瘤、基底細胞癌和小細胞肺癌。
全文摘要
本發(fā)明提供了調(diào)節(jié)hedgehog信號傳導(dǎo)途徑的活性的方法。特別是，本發(fā)明提供了抑制異常生長狀態(tài)的方法，所述的異常生長狀態(tài)是由表型例如Ptc失功能、hedgehog獲功能、smoothened獲功能或Gli獲功能引起的，該方法包括將細胞與足夠量的式I化合物接觸。
文檔編號A61K31/435GK101083996SQ200580036885
公開日2007年12月5日 申請日期2005年10月28日 優(yōu)先權(quán)日2004年10月28日
發(fā)明者吳旭, 丁勝, P·G·舒爾茨 申請人:Irm責(zé)任有限公司, 斯克里普斯研究所