專利名稱：：副豬嗜血桿菌三價(jià)滅活疫苗的生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種副豬嗜血桿菌三價(jià)滅活疫苗的生產(chǎn)方法，屬于獸用生物制品領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：豬副嗜血桿菌病，又稱革拉澤氏病(Glasser'sdisease)，是由副豬嗜血桿菌引起的一種以呼吸道癥狀、跛行、胸膜炎、心包炎、腹膜炎、關(guān)節(jié)炎和腦膜炎等為特征的豬呼吸道傳染病。隨著養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展，豬副嗜血桿菌病已成為近年來嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)的新發(fā)細(xì)菌性傳染病，呈世界性分布，并已證實(shí)在我國絕大多數(shù)豬場存在和流行，可影響2周齡到4月齡的豬，但主要在斷奶前后和仔豬階段發(fā)病，常見于5-8周齡的豬，發(fā)病率一般為10-15%，嚴(yán)重時(shí)死亡率可達(dá)50%以上，給我養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的損失。(蔡旭旺，陳煥春，劉正飛，吳斌，金梅林，BlackallPJ.副豬嗜血桿菌的分離培養(yǎng)和血清型鑒定.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)艮，2005，2455-58；OliveiraS&Pijoan(2004)Haemophilusparasuis:newtrendsondiagnosis,epidemiologyandcontrol.VetMicrobiol99:1-12.)傳統(tǒng)的血清分型方法是根據(jù)熱穩(wěn)定性可溶性抗原和瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)(AGPT)，已有15種血清型得到證實(shí)，而且還有一定數(shù)量不能分型的副豬嗜血桿菌(KielsteinP&Rapp-Gabrie1sonVJ.Designationof15serovarsofHaemophilusparasuisonthebasisofimmunodiffusionusingheat-stableantigenextracts.JClinMicrobiol.1992,30:862865)。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)并證實(shí)的副豬嗜血桿菌的毒力因子及其潛在的毒力因子有莢膜、菌毛、外膜蛋白、脂多糖、轉(zhuǎn)鐵蛋白、神經(jīng)氨酸酶等(李靜怡，張建民，徐成剛，郭莉莉，陳濟(jì)鐺，廖明.副豬嗜血桿菌主要毒力因子及致病機(jī)理研究進(jìn)展沖國畜牧獸醫(yī)，2010年第37卷第12期)。副豬嗜血桿菌血清型眾多以及很大比例的不能分型的菌株，具有明顯的地方性特征，菌株毒力及致病性之間具有明顯的差異性，血清型間交叉保護(hù)性極差或缺少，因此研制與當(dāng)?shù)叵嚓P(guān)型的、具有高效交叉保護(hù)力的疫苗是預(yù)防和控制副豬嗜血桿菌病的必然要求(BaumannG,BilkeiG.EffectofvaccinatingsowsandtheirpigletsonthedevelopmentofGlasser'sdiseaseinducedbyavirulentstrainofHaemophilusparasuisserovar5.Vet.Rec.2002,151:18-21)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是采用免疫原性良好的副豬嗜血桿菌4型TOH04株、5型TOH05株和13型TOH13株分別接種于適宜培養(yǎng)基培養(yǎng)，收獲培養(yǎng)物，經(jīng)甲醛溶液滅活，加入礦物油佐劑混合乳化制成。用于預(yù)防由4、5和13型副豬嗜血桿菌引起的豬副嗜血桿菌病。一、生產(chǎn)用毒株1.菌株來源用于制造疫苗的副豬嗜血桿菌(Haemophilusparasuis)菌株為YBH04、YBH05和YBH13株，由青島易邦生物工程有限公司分離、鑒定。國內(nèi)分離株4型TOH04株(2009年從山東省某豬場病死豬的關(guān)節(jié)液中分離)和5型TOH05株(2008年從山東省平度某豬場病死豬的關(guān)節(jié)液中分離)，13型YBH13株(2009年從山東省濟(jì)南某豬場病死豬的心臟中分離)。以上3個(gè)菌株已于2011年11月23日送交北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學(xué)院微生物研究所中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，保藏號YBH04株為CGMCCNo.5479、YBH05為CGMCCNo.5480和YBH13株為CGMCCNo.5501。2.菌株特點(diǎn)(1)形態(tài)及生化特性副豬嗜血桿菌菌株YBH04JBH05和TOH13株菌均為革蘭氏陰性，細(xì)小桿菌，具有多種不同的形態(tài)，從單個(gè)的球桿菌到長的、細(xì)長的、以致絲狀的菌體。無溶血現(xiàn)象、脲酶試驗(yàn)陰性，氧化酶試驗(yàn)陰性，接觸酶試驗(yàn)陽性，硝酸鹽還原試驗(yàn)陽性，吲哚試驗(yàn)陰性并發(fā)酵葡萄糖、蔗糖、果糖、半乳糖、核糖和麥芽糖等碳水化合物。(培養(yǎng)特性副豬嗜血桿菌YBH04JBH05和TOH13株菌生長均需要V因子，不需要X因子，在普通培養(yǎng)基上不生長。接種在胰蛋白胨大豆瓊脂(TrypticSoyAgar,TSA)培養(yǎng)基上培養(yǎng)(其配制方法為取胰蛋白大豆瓊脂40g，加入去離子水，定容至IOOOmL,充分搖勻溶解，121°C高壓蒸汽滅菌15min，加入50ml過濾除菌的牛血清、IOml過濾除菌的0.01%NAD。)；并將培養(yǎng)基置于5%10%CO2條件下37°C培養(yǎng)M48h，可形成直徑為12_的圓形、光滑濕潤、無色透明菌落。(3)血清型應(yīng)用瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)進(jìn)行血清型鑒定，副豬嗜血桿菌YBH04、YBH05和YBHl3株菌分別為HPS4、5和13型。(4)菌株毒力用副豬嗜血桿菌8IOhTSB肉湯培養(yǎng)物腹腔注射910周齡健康易感仔豬，能使攻毒仔豬死亡的各菌株的最小攻毒量分別是YBH04株約為7XIO9CFU/頭，YBH05株約為9XIOi3CFU/頭和YBH13株約為7XIOi3CFU/頭。(免疫原性用副豬嗜血桿菌YBH04JBH05和TOH13株菌制備的不同含菌量的單價(jià)油乳劑滅活疫苗，分別頸部肌肉注射45周齡健康仔豬，2ml/頭，免疫后4周連同對照組一起進(jìn)行攻毒保護(hù)試驗(yàn)。結(jié)果表明，副豬嗜血桿菌YBH04、YBH05和TOH13株菌制備的含菌量為2X109CFU/ml單價(jià)滅活疫苗免疫的仔豬攻毒保護(hù)率均達(dá)4/55/5。二、副豬嗜血桿菌三價(jià)滅活疫苗的生產(chǎn)方法，主要是1.采用發(fā)酵罐分別培養(yǎng)副豬嗜血桿菌4、5和13型菌液。按發(fā)酵罐容積的70%加入生產(chǎn)用的半合成培養(yǎng)基(其配制方法為取胰蛋白大豆肉湯(TrypticSoyBroth,TSB)30g溶于去離子水，定容至IOOOmL,充分搖勻溶解后121°C高壓蒸汽滅菌15min，加入50ml過濾除菌的牛血清、IOml過濾除菌的0.01%NAD)，同時(shí)加入消泡劑(泡敵)進(jìn)行消毒，待其溫度降至3738°C時(shí)，將28°C保存的二級種子液(單型)分別按2%2.5%加入到發(fā)酵罐內(nèi)。調(diào)節(jié)培養(yǎng)溫度3738°C、攪拌轉(zhuǎn)速200r/min、pH7.2、罐壓0.030.05Mpa之間、溶氧量40%，培養(yǎng)時(shí)間910小時(shí)收獲各型菌液，按菌液體積的0.3%加入甲醛溶液，37°C攪拌滅活Mh，取樣進(jìn)行滅活檢驗(yàn)后，置28°C保存。2.根據(jù)活菌計(jì)數(shù)結(jié)果，將滅活的副豬嗜血桿菌4、5、13型菌液均稀釋成彡12X109CFU/ml后等量混合。3.按常規(guī)方法制備成油乳劑滅活疫苗。本發(fā)明的詳細(xì)描述一、疫苗制備1.生產(chǎn)用種子制備(1)一級種子繁殖與鑒定將YBH04JBH05JBH13株凍干菌種劃線接種于TSA瓊脂平板上，在5%10%CO2條件下，37°C培養(yǎng)M48h，挑取典型菌落，接種于TSB肉湯培養(yǎng)基上，置37°C振蕩培養(yǎng)M48h，經(jīng)純粹檢驗(yàn)合格后，作為一級種子。在-20°C下保存，不超過1個(gè)月；-70°C下保存，不超過3個(gè)月。(2)二級種子繁殖取一級種子，劃線接種于TSA瓊脂平板，在含5%10%CO2條件下，37°C培養(yǎng)M48h，挑選典型菌落或菌苔，接種于TSB肉湯培養(yǎng)基上，置37°C振蕩培養(yǎng)M48h，經(jīng)純粹檢驗(yàn)合格后，即為二級種子。在28°C保存，應(yīng)不超過Mh。2.菌液培養(yǎng)采用發(fā)酵罐分別培養(yǎng)副豬嗜血桿菌4、5、13型菌液。按發(fā)酵罐容積的60%70%加入生產(chǎn)用的半合成培養(yǎng)基，同時(shí)加入消泡劑(泡敵)進(jìn)行消毒，待其溫度降至3738°C時(shí)，將28°C保存的二級種子液(單型)按2%2.5%加入到發(fā)酵罐內(nèi)。培養(yǎng)溫度控制在3738°C、攪拌轉(zhuǎn)速100200r/min、ρΗ7·2、罐壓0.030.051、溶氧量40%，培養(yǎng)910h，收獲菌液，按菌液體積的0.3%加入甲醛溶液，37°C攪拌滅活Mh，取樣進(jìn)行滅活檢驗(yàn)后，置28°C保存。3.活菌計(jì)數(shù)取培養(yǎng)9IOh的菌液lml，按(中國獸藥典委員會(huì).中華人民共和國獸藥典二五年版(三部).中國農(nóng)業(yè)出版社，2006，本發(fā)明簡稱《中國獸藥典》)附錄方法進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果將各型活菌含量濃縮成均應(yīng)不低于12X109CFU/ml。4.滅活按菌液體積的0.3%加入甲醛溶液，37°C攪拌滅活Mh，取樣進(jìn)行滅活檢驗(yàn)，滅活后的菌液置28°C保存，應(yīng)不超過7日。5.疫苗制備(1)水相配制取滅菌的吐溫-804份、無菌檢驗(yàn)合格的菌液96份，導(dǎo)入配液罐中，開啟攪拌電機(jī)，勻速攪拌至吐溫-80完全溶解。(2)油相制備取注射用白油94份、司本-806份和硬脂酸鋁1份加入油相制備罐中，開啟攪拌電機(jī)，勻速攪拌，同時(shí)開啟導(dǎo)熱油開關(guān)，125°C加熱30min，冷卻后，導(dǎo)入貯油罐中備用。(3)乳化取油相2份置于乳化罐內(nèi)，開動(dòng)電機(jī)低速攪拌，同時(shí)緩緩加入水相1份，再以4000r/min乳化30min。乳化后，取樣IOml,以3000r/min離心15min，應(yīng)不分層；若有分層現(xiàn)象，應(yīng)重新乳化1次。(4)分裝定量分裝，加蓋密封。二、疫苗的安全試驗(yàn)1.副豬嗜血桿菌疫苗對靶動(dòng)物和非使用日齡動(dòng)物的一次單劑量接種的安全性試驗(yàn)用本發(fā)明人按本法試制的副豬嗜血桿菌三價(jià)滅活疫苗01批分別對45周齡仔豬、產(chǎn)前15天懷孕母豬(均購自山東青島平度市某良種豬場)各5頭進(jìn)行頸部肌肉注射，2ml/頭，另設(shè)生理鹽水免疫對照組。以觀察試驗(yàn)豬接種疫苗后2周內(nèi)，試驗(yàn)豬有無過敏，精神、飲食有無異常，注射部位有無紅腫現(xiàn)象，仔豬增重或母豬產(chǎn)子情況是否正常。結(jié)果仔豬精神良好，產(chǎn)前15天懷孕母豬接種后注射部位均未出現(xiàn)紅腫現(xiàn)象，精神、采食均正常，所產(chǎn)仔豬均正常；對照試驗(yàn)豬均正常。表1對非使用日齡靶動(dòng)物的一次接種安全性試驗(yàn)結(jié)果權(quán)利要求1.一種副豬嗜血桿菌三價(jià)滅活疫苗，其特征是該疫苗含有經(jīng)甲醛溶液滅活的副豬嗜血桿菌4型TOH04株、5型TOH05株和13型TOH13株及常規(guī)的礦物油佐劑，以上3個(gè)菌株已于2011年11月23日送交北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學(xué)院微生物研究所中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，保藏編號分別為CGMCCNo.5479,CGMCCNo.5480和CGMCCNo.5501。2.權(quán)利要求1一種副豬嗜血桿菌三價(jià)滅活疫苗的生產(chǎn)方法，其特征在于(1)菌液培養(yǎng)與滅活采用發(fā)酵罐分別培養(yǎng)4、5、13型副豬嗜血桿菌CGMCCNo.5479、CGMCCNo.5480和CGMCCNo.5501的菌液按發(fā)酵罐容積的70%加入生產(chǎn)用的半合成培養(yǎng)基，同時(shí)加入消泡劑進(jìn)行消毒，待其溫度降至3738°C時(shí)，按培養(yǎng)基總量的2%2.5%將種子液分別加到發(fā)酵罐內(nèi)，培養(yǎng)溫度3738°C、攪拌轉(zhuǎn)速200r/min、pH7.2、罐壓0.030.05Mpa之間、溶氧量40%，培養(yǎng)時(shí)間910小時(shí)收獲菌液，按菌液體積的0.3%加入甲醛溶液，37°C攪拌滅活24h，取樣進(jìn)行滅活檢驗(yàn)后，置28°C保存；(2)水相制備根據(jù)活菌計(jì)數(shù)結(jié)果，將滅活的4、5、13型副豬嗜血桿菌菌液均稀釋成彡12X109CFU/ml后等量混合；(3)疫苗制備按常規(guī)方法制備成礦物油佐劑滅活疫苗。3.按照權(quán)利要求1和2所述的一種副豬嗜血桿菌三價(jià)滅活疫苗及其生產(chǎn)方法，其特征是其中所使用半合成培養(yǎng)基是胰蛋白胨大豆肉湯(TrypticSoyBroth，TSB)培養(yǎng)基30g，加入去離子水，定容至IOOOmL,充分搖勻溶解，調(diào)pH至7.27.4，121°C高壓蒸汽滅菌15min,待冷至55°C左右，按無菌要求加入50mL過濾除菌的牛血清、IOmL過濾除菌的0.02%NAD。全文摘要本發(fā)明涉及副豬嗜血桿菌三價(jià)滅活疫苗的生產(chǎn)方法。本發(fā)明從優(yōu)勢流行菌株中篩選出免疫原性良好的副豬嗜血桿菌4型YBH04株、5型YBH05株和13型YBH13株作為疫苗制備菌株，分別接種于適宜培養(yǎng)基培養(yǎng)，收獲菌液，經(jīng)甲醛溶液滅活后，加入礦物油佐劑混合乳化制成；用于預(yù)防由4、5和13型副豬嗜血桿菌引起的豬副嗜血桿菌??；此疫苗具有安全性好、免疫效力高且免疫期長等優(yōu)點(diǎn)。文檔編號A61K39/102GK102499982SQ20111043188公開日2012年6月20日申請日期2011年12月21日優(yōu)先權(quán)日2011年12月21日發(fā)明者馮陽,劉曉東,周旭斌,李金積,王宗升,王福軍,申洪銀,程增青,郭莉莉,馬爽申請人:青島易邦生物工程有限公司