專利名稱：制備不飽和脂族羥基酸及其酯的方法、在藥物和/或化妝品組合物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及化學(xué)方法領(lǐng)域以及通過該化學(xué)方法得到的產(chǎn)物的應(yīng)用。
更具體而言，本發(fā)明涉及制備以下通式(Id)之不飽和羥基脂肪酸及其酯的方法 其中n＝1-4，m＝2-16，R1＝OH、Cl、Br、OR3，其中R3代表具有1-16個碳原子的直鏈或支鏈烷基、烯基、炔基、或者甘油的酯，它們?nèi)芜x被一個或者多個碳、氮、硫或鹵原子取代，所述鹵原子例如是氟、氯、溴和碘，R2代表H、SiR′1R′2R′3，其中R′1、R′2、R′3相同或不同，并代表具有1-16個碳原子的直鏈或支鏈烷基、烯基、炔基、或者甘油的酯，它們?nèi)芜x被一個或者多個碳、氮、硫或鹵原子取代，所述鹵原子例如是氟、氯、溴和碘，或者R2代表C-Ar3，其中Ar代表任選被一個或多個碳、氮、硫或鹵原子取代的芳基，所述鹵原子例如是氟、氯、溴和碘，或者R2代表以下式的四氫吡喃基
本發(fā)明還涉及所述產(chǎn)物在藥物和/或化妝品組合物中作為抗膠原酶活性劑、解脂活性劑或抗痤瘡劑的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
通式(Id)的化合物是已知的并且在文獻中已描述了其生物性質(zhì)、特別是其化妝和藥物性質(zhì)。此外，構(gòu)成蜜蜂之蜂皇漿脂質(zhì)的主要成分是羥基-10-癸烯-2(反式)油酸(或DHA)，相應(yīng)于其中R1＝OH、R2＝H、n＝1且m＝3的通式(Id)化合物。
現(xiàn)有技術(shù)中的許多文獻報道了制備不飽和羥基脂肪酸及其酯的方法(Lee等人，1993，J.Org.Chem.，vol.58，p.2918-2919；Hurd和Saunders，1952，J.Am.Chem.Soc.，vol.74，p.5324-528；Krishnamurthy等人，1989，Indian J.Chem.Sect.A，vol.28，p.288-291；Plettner等人，1995，J.Chem.Ecol.，vol.21，p.1017-1030)。目前現(xiàn)有技術(shù)中已知的方法具有一個氧化步驟，在此期間使用金屬鹽，例如鉻或錳的鹽。然而，金屬鹽的使用具有許多不便之處。一方面，在通過所述方法得到的產(chǎn)物的水平上，該產(chǎn)物被金屬鹽污染并由此在化妝品或藥物中的應(yīng)用受限于該污染。另一方面，金屬鹽的使用也給實施該合成的工業(yè)環(huán)境帶來污染。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明的目的是解決上述問題，并提出一種新且具有創(chuàng)造性的合成方法，該方法能夠運用到工業(yè)中。
另外，根據(jù)本發(fā)明的方法的特征在于，能夠得到比現(xiàn)有技術(shù)中已知的方法更快的合成法，并具有更高的收率。實際上，根據(jù)本發(fā)明的方法在初始的步驟中避免了色譜純制，而色譜純制不是純制用的工業(yè)方法。
合成的總路線如下所示 其中R1、R2、m和n與通式(Id)中的定義相同。
該合成法的第一步是溴化，該反應(yīng)的起始化合物是式(II)的二醇。多種溴化的方法在本領(lǐng)域中是已知的，而且本領(lǐng)域技術(shù)人員可用于該步驟中。該溴化反應(yīng)需要使用溶劑，該溶劑特別是甲苯、苯、二甲基甲酰胺、四氫呋喃、環(huán)己烷、庚烷、石油醚等。該溴化步驟中使用的反應(yīng)物可以是含水或不含水的HBr、Ph3P-Br2、四溴化碳-三苯基膦、氫溴酸。例如，可以如Geresh等人，Tetrahedron Asymmery，1998，vol.9，p.89-96所述，溴化反應(yīng)的實驗條件是使用含水的HBr。
第二步是在環(huán)狀或非環(huán)狀、無水或含水的叔胺N-氧化物以及DMSO存在下氧化形成式(IV)的醛。在反應(yīng)結(jié)束時，通過簡單的過濾除去叔胺的相應(yīng)氫溴酸鹽(bromydrate)。有利的方式是，第二步中使用的環(huán)狀或非環(huán)狀、無水或含水的叔胺N-氧化物選自于N-甲基嗎啉氧化物、三甲胺氧化物或三乙胺氧化物或者它們的混合物?，F(xiàn)有技術(shù)中還有用于合成通式IV的醛的其他方法。在此情況下，本發(fā)明方法的步驟2解決了現(xiàn)有技術(shù)中已知方法的缺陷。例如，可以提及在錳鹽存在下氧化相應(yīng)的環(huán)烯的反應(yīng)(Lee等人，1993，J.Org.Chem.，vol.10，p.2918-2919)。因此，本發(fā)明方法的步驟2避免了金屬鹽的存在。Guindon等人于1984年的文章(J.Org.Chem.，vol.49，p.3912-3920)描述了由1，1-二甲氧基-8-甲氧基甲氧基-辛烷起始來合成8-羥基-辛醛。另外，合成8-羥基-辛醛的產(chǎn)率相對較低(36％)，而本發(fā)明步驟2的收率則得到很大的提高。現(xiàn)有技術(shù)中合成通式IV醛的其他已知方法是具有4個步驟以上的長合成法。
本發(fā)明方法的步驟3是一個Witting-Horner反應(yīng)。該方法對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是已知的(Modern Synthetic Reaction，第二版，Herbet O.House，Wittig Horner reaction，p.682-709)，而且現(xiàn)有技術(shù)中描述的所有實驗條件都可用于本發(fā)明中。例如，Witting-Horner反應(yīng)可在三乙基磷酰乙酸酯和碳酸鉀存在下來實施。
本發(fā)明方法的步驟4是一個皂化步驟。在本發(fā)明的方法中沒有使用任何特殊的實驗條件。本領(lǐng)域技術(shù)人員可直接找到足以適用于該步驟的實驗條件。
本發(fā)明方法的步驟5是一個特異性保護在步驟4中得到的通式Ib化合物的醇官能團的步驟。該反應(yīng)是在酸催化劑存在下在烯醇醚中實施的。有利的方式是，該反應(yīng)是在APTS(對甲苯磺酸)存在下在二氫吡喃中實施的。步驟5之后得到的通式Ic化合物通過簡單的水洗以及在硫酸鹽上干燥來純制。本發(fā)明方法的步驟2和步驟5在現(xiàn)有技術(shù)沒有描述。它們可以解決現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)問題，同時增加了產(chǎn)率以及合成式I化合物的方法的快速性。
通過本發(fā)明方法的步驟5得到的式(Id)產(chǎn)物可進行最終的脫保護，以得到通式(Ie)的化合物。該脫保護的反應(yīng)是在包含酸催化劑的甲醇溶液中實現(xiàn)的。所有的酸催化劑都可用于本發(fā)明中。有利的方式是，所用的酸催化劑是ATPS。
通過本發(fā)明方法的步驟5得到的式(Id)產(chǎn)物可用于甘油的酯化反應(yīng)中。根據(jù)甘油的相對用量，可得到單酯(2個可能的異構(gòu)體在1和2位上)、二酯(2個可能的異構(gòu)體二酯1，1和1，2)以及三酯。在甘油的酯化步驟后，所得的化合物可在與上述式(Id)化合物的脫保護條件相同的實驗條件下進行最終的脫保護。
通過本發(fā)明方法得到的產(chǎn)物例如可如上所述用于化妝品和/或藥物領(lǐng)域中。另外，申請人所做的工作表明通過本發(fā)明的方法得到的產(chǎn)物在最終的脫保護后具有抗膠原酶活性。
膠原是人體和皮膚中最豐富并且是最重要的蛋白質(zhì)。具體而言，該硬蛋白占皮膚蛋白的75％，并在皮膚中確保堅固性。成纖維細胞由氨基酸(羥基脯氨酸、賴氨酸、脯氨酸)制造溶原膠分子，該溶原膠分子在維生素C存在時轉(zhuǎn)化為膠原分子。為形成纖維網(wǎng)，膠原在不同的分子之間產(chǎn)生連接。
膠原的更新隨著年齡而變化。使皮膚和內(nèi)膜柔軟并具有抵抗力的可溶性膠原在作為膠原酶的蛋白水解酶的作用下越來越快地分解，在皮膚水平上導(dǎo)致蛋白纖維結(jié)構(gòu)的老化。另外，導(dǎo)致彈性丟失的不溶性膠原由于難以逆轉(zhuǎn)的多重連接而發(fā)生硬化，并且與葡萄糖分子聚合(糖化(glycation)現(xiàn)象)。該連接使膠原更加耐受膠原酶的攻擊，使得膠原纖維的硬度越來越大。該硬化現(xiàn)象是皮膚組織老化的特征，應(yīng)盡可能早地治療，這是因為其通過游離基增加了對成纖維細胞的破壞以及皮膚蛋白的變性。
膠原酶是一種在正常生理條件下很少表達的酶。其在衰老、特別是在女性絕經(jīng)時的超表達導(dǎo)致絕大部分的皮膚纖維蛋白變性。
但是，在老化的情況下，膠原纖維的破壞有可能突然增加。事實上，在被細菌感染時，細菌的膠原酶有可能破壞被感染宿主的膠原纖維。
另外，腫瘤的侵入導(dǎo)致基底膜的分解、細胞外基質(zhì)的分解以及其中存在膠原的組成結(jié)構(gòu)的分解。因此，在腫瘤的侵入能力和人腫瘤中是否存在膠原酶活性之間發(fā)現(xiàn)存在非常明顯的關(guān)系。在腫瘤細胞以及腫瘤周圍的成纖維細胞中都發(fā)現(xiàn)有膠原酶。正常的表皮細胞分泌非常少量的膠原酶，而該蛋白在侵入或者轉(zhuǎn)移的腫瘤細胞中被超表達。
另一種變性疾病是膠原類纖維蛋白的變性，并通常稱為“膠原病”。
因此，本發(fā)明涉及通過本發(fā)明的方法制得的產(chǎn)物作為抗膠原酶活性劑的應(yīng)用。申請人的工作特別是為羥基-10-癸烯-2(反)油酸(DHA)和羥基-10-癸烯-2(反)油酸的甘油酯(在1位處的甘油單酯)的抗膠原酶活性提供了證據(jù)。本發(fā)明還涉及羥基-10-癸烯-2(反)油酸(DHA)或羥基-10-癸烯-2(反)油酸的甘油酯在藥物和/或化妝品組合物中作為抗膠原酶活性劑的應(yīng)用。
本發(fā)明涉及羥基-10-癸烯-2(反)油酸(DHA)和/或羥基-10-癸烯-2(反)油酸的甘油酯在制備用于預(yù)防或抵抗膠原分解的藥物中的應(yīng)用。該藥物特別是用于預(yù)防或抵抗細菌感染時細菌膠原酶對膠原的分解作用。
本發(fā)明還涉及羥基-10-癸烯-2(反)油酸(DHA)和/或羥基-10-癸烯-2(反)油酸的甘油酯在制備用于皮膚和韌帶再生的藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明還涉及羥基-10-癸烯-2(反)油酸(DHA)和/或羥基-10-癸烯-2(反)油酸的甘油酯在制備用于預(yù)防或抵抗腫瘤侵入的藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明還涉及羥基-10-癸烯-2(反)油酸(DHA)和/或羥基-10-癸烯-2(反)油酸的甘油酯在制備用于預(yù)防或者抵抗包括膠原類纖維蛋白變性并且稱為“膠原病”的變性疾病的藥物中的應(yīng)用。
通過本發(fā)明的方法制得的產(chǎn)物可如前所述用于化妝品和/或藥物領(lǐng)域中。申請人的工作證實了在最后的脫保護步驟后根據(jù)本發(fā)明的方法得到的產(chǎn)物、特別是羥基-10-癸烯-2(反)油酸(DHA)具有脂解活性。因此，在最后的脫保護步驟后根據(jù)本發(fā)明的方法得到的產(chǎn)物、特別是DHA可特別地用于減肥治療以及需要脂解活性的所有已知治療中。
根據(jù)本發(fā)明的方法得到的產(chǎn)物可如上所述例如用于化妝品和/或藥物領(lǐng)域中。申請人的工作證實在最后的脫保護步驟后根據(jù)本發(fā)明的方法得到的產(chǎn)物、特別是羥基-10-癸烯-2(反)油酸(DHA)具有抗痤瘡活性。
痤瘡的治療需要克服兩個主要的問題，其中一個是過度的皮脂溢性，另一個是導(dǎo)致皮膚感染的細菌的增殖。申請人的工作證實在最后的脫保護步驟后根據(jù)本發(fā)明的方法得到的產(chǎn)物、特別是DHA同時具有皮脂調(diào)節(jié)活性和抗菌活性。
實際上，DHA能夠抑制皮膚中的5α-還原酶，其是負責(zé)產(chǎn)生二氫睪酮的酶。與未經(jīng)治療的對照組相比，用0.1％的DHA治療以及用0.5％的DHA治療分別將5α-還原酶活性降低約70％和約90％。該抑制作用可大大降低皮脂的量。
另外，用Propionibacterium acnes、Staphylococcus aureus和Malasseziafurfur進行測試，在治療14或28天后，0.5％的DHA產(chǎn)生約95-100％的殺菌作用。
本發(fā)明的其他優(yōu)點和特征通過以下實施例將變得更為明顯。這些實施例一方面涉及本發(fā)明的合成方法，另一方面涉及通過本發(fā)明的方法得到的產(chǎn)物的抗膠原酶以及脂解性質(zhì)。
具體實施例方式
實施例1合成Ia(n＝1，m＝6，R1＝OEt)和Ie(甘油三酯)1、步驟1溴化反應(yīng) 將438g(3mol)的1，8-辛二醇混合至3L的甲苯中形成溶液。隨后添加375ml(3.3mol)48％的含水HBr。加熱反應(yīng)物以通過共沸蒸餾除去所存在的水以及在反應(yīng)中形成的水。接觸13.5小時后，重新冷卻反應(yīng)物，然后再添加飽和碳酸氫鈉溶液。分離有機相并用飽和氯化鈉溶液洗滌。在硫酸鎂上干燥后，濃縮反應(yīng)液，得到672g的粗產(chǎn)物。
在96℃、P＜1mbar的條件下減壓蒸餾，由此純制8-溴辛醇，m＝575g(92％)。
表征-CCMRf＝0.8(庚烷/異丙基醚8/2)-1H NMR(200MHz，CDCl3)3.65(t，2H，J＝6.4Hz)，3.43(t，2H，J＝6.8Hz)，1.87(m，2H)，1.36-1.69(m，10H)
2、步驟2氧化為醛 在N2下將708g(5.87，3當(dāng)量)的無水N-甲基嗎啉N-氧化物溶解在3L的DMSO中。在30分鐘的時間內(nèi)添加溶解在1L的DMSO中的410g(1.96mol)8-溴辛醇。反應(yīng)液變?yōu)槌吻?。N-甲基嗎啉的銨溴化物沉淀。在室溫下攪拌65小時后，過濾出所述鹽，而反應(yīng)液用4L的氯化鈉飽和溶液處理。用4×1L乙酸乙酯萃取并干燥后，得到320g的粗產(chǎn)物，其由74％的醛(R＝83％)和26％的1，8-辛二醇組成。
表征-CCMRf＝0.6(庚烷/乙酸乙酯8/2)-1H NMR(400MHz，CDCl3)9.74(t，1H，J＝1.7Hz)，3.61(t，2H，J＝6.6Hz)，2.41(dt，2H，J＝1.7和7.3Hz)，1.51-1.65(m，4H)，1.24-1.37(m，6H)3、步驟3Witting-Horner反應(yīng)
將前述粗產(chǎn)物(320g)放置溶解在3L的水中。添加800ml(4.2mol，2.1當(dāng)量)的三乙基磷酰乙酸酯，然后添加830g(6mol)的碳酸鉀。攪拌20小時后，終止反應(yīng)。反應(yīng)液用4×1L異丙基醚萃取。在硫酸鎂上干燥后，蒸發(fā)有機溶劑，得到650g的粗產(chǎn)物。
該產(chǎn)物在E＝120℃、P＜1mbar的條件下蒸餾純制。
在此情況下，回收得到280g的無色液體，通過MRN(R＝80％，由醛起始，或者66％，由溴化衍生物起始)或者用庚烷/乙酸乙酯8/2進行洗脫，證實是相同的，在此情況下得到119.6g的產(chǎn)物(28％，由溴化衍生物起始)。
表征-CCMRf＝0.8(庚烷/乙酸乙酯8/2)-1H NMR(400MHz，CDCl3)6.91(m，1H)，5.78-5.82(dt，1H，J＝1.4和15.6Hz)，4.17(q，2H，J＝7.1Hz)，3.63(t，2H，J＝6.6Hz)，2.18(dq，2H，J＝1.2和7.3Hz)，1.22-1.65(m，11H)4、步驟4皂化反應(yīng) 將119.6g(0.56mol)的羥基酯溶解在600ml的乙醇中，然后添加400ml的4.6N氫氧化鉀溶液。反應(yīng)溶液攪拌8小時。用異丙基醚萃取反應(yīng)液。含水相酸化至pH＝1，并用乙酸乙酯萃取。干燥并蒸發(fā)后，得到99.6g的粗固體物質(zhì)。在異丙基醚/石油醚中重結(jié)晶，得到白色固體的產(chǎn)物(86g，83％)。
表征-CCMRf＝0.2(庚烷/乙酸乙酯7/3)-熔點61.3℃-1H NMR(400MHz，CDCl3)7.06(dt，1H，J＝15.6和7Hz)，5.81(dt，1H，J＝1.5和15.6Hz)，3.64(t，2H，J＝6.6Hz)，2.22(dq，2H，J＝1.2和7.3Hz)，1.52-1.58(m，2H)，1.45-1.48(m，2H)，1.33-1.3765(m，6H)5、步驟5保護反應(yīng) 86g(0.46mol)羥基酸放置并溶解在45ml(0.48mol)3，4-二氫-2H-吡喃在500ml的THF中的溶液內(nèi)。添加1ml的濃鹽酸，并攪拌反應(yīng)溶液24小時。
濃縮THF，粗產(chǎn)物溶解在乙酸乙酯中，然后用氯化鈉溶液洗滌至中性pH。在硫酸鎂上干燥后，得到132g的粗產(chǎn)物(＞100％)。
表征-CCMRf＝0.4(庚烷/乙酸乙酯7/3)-1H NMR(400MHz，CDCl3)7.06(dt，1H，J＝15.6和7Hz)，5.81(dd，1H，J＝1.6和15.6Hz)，4.58(t，1H，J＝2.8Hz)，3.82-3.91(m，1H)，3.71-3.73(m，1H)，3.51-3.52(m，1H)，3.36-3.39(m，1H)，2.20(m，2H)，1.33-1.89(m，16H)
6、步驟6甘油的酯化反應(yīng) 將8.4g(0.091mol)的甘油放置并溶解在500ml的二氯甲烷中。在通過共沸蒸餾除去痕量的水后，將上述粗產(chǎn)物(0.46mol)溶解在500ml的二氯甲烷中，然后添加在反應(yīng)溶液中。添加56.8g(0.46mol)的二甲基氨基吡啶和97g(0.46mol)的二環(huán)己基碳二亞胺。反應(yīng)溶液攪拌78小時。過濾所形成的沉淀。
反應(yīng)溶液濃縮并溶解在異丙基醚中。過濾并濃縮后，得到156g的粗產(chǎn)物，然后通過色譜用庚烷/乙酸乙酯7/3作為洗脫液進行純制。
得到99g的流出物，其包含2/3的產(chǎn)物和1/3的乙酰化物(acyluree)。
表征-CCMRf＝0.7(庚烷/乙酸乙酯7/3)-1H NMR(400MHz，CDCl3)6.96(m，3H)，5.80(dd，3H，J＝1.6和15.6Hz)，5.29-5.31(m，1H)，4.54-4.57(m，3H)，4.20-4.39(m，4H)，3.81-3.89(m，3H)，3.68-3.72(m，3H)，3.41-3.49(m，3H)，3.34-3.39(m，3H)，2.25-2.18(m，6H)，1.33-1.99(m，48H)
7、步驟7最終的脫保護 將99g(0.136mol)的上述混合物溶解在1L包含9.9g APTS的甲醇中。反應(yīng)溶液攪拌14小時。終止反應(yīng)。反應(yīng)溶液濃縮。所得的油放入水中，然后用飽和碳酸氫鈉溶液調(diào)節(jié)至pH＝6。含水相用二氯甲烷萃取。有機相在干燥并蒸發(fā)后，得到77g黃色油。
該產(chǎn)物在硅膠上用二氯甲烷/丙酮9/1至1/1以及二氯甲烷/甲醇95/5作為洗脫液進行色譜純制。
得到27g油狀產(chǎn)物，其結(jié)晶為黃白色無定形固體，純度為85-90％。
表征-CCMRf＝0.2(二氯甲烷/丙酮9/1)-1H NMR(400MHz，CDCl3)6.94-7.01(m，3H)，5.78-5.84(m，3H)，5.29-5.31(m，1H)，4.20-4.34(m，4H)，3.60-3.65(m，6H)，2.16-2.22(m，6H)，1.33-1.99(m，30H)實施例2合成以下式的化合物
1、步驟18-溴辛醇的保護 將21g(0.1mol)的8-溴辛醇溶解在200ml的二氯甲烷中。在0℃下添加16g(0.104mol)的叔丁基二甲基甲硅烷基氯，隨后添加7.5g(0.11mol)的咪唑。立刻形成沉淀。攪拌3小時后，過濾反應(yīng)溶液，然后濃縮，并蒸餾粗產(chǎn)物。
在99-104℃和P＜1mbar的條件下分離出25.8g的產(chǎn)物(82％)。
表征1H NMR(400MHz，CDCl3)3.59(t，2H，J＝6.6Hz)，3.39(t，2H，J＝6.9Hz)，1.82-1.89(m，2H)，1.30-1.50(m，10H)，0.88(t，9H，J＝2.7Hz)，0.04(s，6H)2、步驟2氧化為醛 20g(61mol)的甲硅烷基衍生物放置并溶解在200ml的DMSO中。添加21.7g(0.18mol)的N-甲基嗎啉N-氧化物。反應(yīng)溶液攪拌72小時。形成沉淀。反應(yīng)溶液用飽和氯化鈉溶液稀釋，然后用異丙基醚萃取。干燥并蒸發(fā)后，得到15.3g的粗產(chǎn)物。
在81℃和P＜1mbar的條件下蒸餾，由此純制產(chǎn)物(9g，57％)。
表征1H NMR(400MHz，CDCl3)9.76(t，1H，J＝1.9Hz)，3.59(t，2H，J＝6.6Hz)，2.42(dt，2H，J＝1.8和7.2Hz)，1.49-1.68(m，4H)，1.30-1.32(m，6H)，0.88(t，9H，J＝2.7Hz)，0.04(t，6H，J＝2.9Hz)3、步驟3Witting反應(yīng) 將835g(21mmol)的NaH溶解在5ml的THF中并冷卻至T＜℃。滴加4.2ml(22mmol)的三乙基磷酰乙酸酯。在室溫下攪拌3小時后，在冷卻下添加5g(19mmol)的醛，然后攪拌17小時。用水進行水解后，用乙酸乙酯萃取，干燥并蒸發(fā)，得到6.7g的粗產(chǎn)物。
在硅膠上(用庚烷/乙酸乙酯8/2洗脫)進行純制，得到3.7g的產(chǎn)物(60％)。
表征-CCMRf＝0.6(庚烷/乙酸乙酯8/2)-1H NMR(400MHz，CDCl3)6.95(dt，1H，J＝8.6和15.6Hz)，5.79(dt，1H，J＝1.4和15.6Hz)，4.17(q，2H，J＝7.1Hz)，3.58(dt，2H，J＝6.6和9.8Hz)，2.15-2.21(m，2H)，1.46-1.51(m，4H)，1.24-1.42(m，9H)，0.88(t，9H，J＝2.7Hz)，0.04(t，6H，J＝2.9Hz)4、步驟4皂化 將2g(6mmol)的酯溶解在10ml乙醇中，然后添加5ml的3.8N氫氧化鈉溶液。4小時后終止反應(yīng)。反應(yīng)溶液酸化至pH＝1，并用乙酸乙酯萃取。無需進一步的純制就可得到產(chǎn)物(1.5g，83％)。
表征-CCMRf＝0.2(庚烷/乙酸乙酯7/3)-1H NMR(400MHz，CDCl3)7.07(dt，1H，J＝8.6和15.6Hz)，5.81(dt，1H，J＝1.4和15.6Hz)，3.59(dt，2H，J＝6.6和9.8Hz)，2.21-2.27(m，2H)，1.46-1.51(m，4H)，1.24-1.42(m，6H)，0.89(t，9H，J＝2.7Hz)，0.04(t，6H，J＝2.9Hz)實施例3在人皮膚的冷凍切片上評估根據(jù)本發(fā)明的方法得到的產(chǎn)物的抗膠原酶活性1、操作模型該研究是用活性成分的濃度為1％和2％的不同溶液來完成的，同時與單獨使用賦形劑、緩沖液對照和膠原酶進行比較。所用的活性成分是DHA(羥基-10-癸烯-2(反)油酸，ML40)和羥基-10-癸烯-2(反)油酸甘油酯(GM)。表1總結(jié)了所測試的不同溶液。
表1

在組織學(xué)玻片上放置5μm的冷凍切片(每個玻片上放置4個切片)，該切片來自于一位54歲婦女的乳房。
所述切片上覆蓋待測試的溶液，并在37℃下于潮濕的空間內(nèi)溫育2小時。通過重復(fù)沖洗除去所述溶液，然后用picrosirius對切片進行染色。顯微鏡檢查是用2.5的鏡頭完成的，并用Kodak Gold 100 ASA膠片進行照相。
2、結(jié)果表2總結(jié)了膠原結(jié)構(gòu)隨測試溶液而發(fā)生改變的結(jié)果。0表示膠原結(jié)構(gòu)沒有發(fā)生改變，而1或2分別表示膠原的結(jié)構(gòu)平均或者凈發(fā)生非常強的改變。
表2

另外，應(yīng)用Tris緩沖液對照和賦形劑都沒有使膠原的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。
因此，1％和2％的產(chǎn)物DHA完全抑制了膠原酶的活性，而2％的產(chǎn)物ML40和GM輕微地抑制膠原酶的活性。
實施例4在保持存活的人皮膚外植組織上評估根據(jù)本發(fā)明的方法得到的GM的抗膠原酶活性1、操作模型該研究是在100U/ml膠原酶存在下用5％的GM產(chǎn)物與賦形劑(hydrocerine)、陽性對照和對照進行比較來完成的。
Hydrocerine是用于待施用的產(chǎn)物制劑的賦形劑。該研究做兩次。在第一次的研究中，觀察到膠原酶在第2天時的作用非常有限，而且仍是不顯著的。在第二次的研究中，延長了施用時間，并在第2天和第4天對外植組織進行提取。
a、外植組織的制備如下表3所示，制備人皮膚的外植組織并分為16組，每組3個外植組織。
表3

b、施用5％的GM產(chǎn)物按照每個外植組織20mg的比例在第0天和第2天施用產(chǎn)物，在后24組的培養(yǎng)液中摻入膠原酶。
c、組織學(xué)每組的3個外植組織在第2天進行提取，在第4天固定在普通的Bouin上，然后進行組織學(xué)檢查。
組織學(xué)研究包括在石蠟中的浸入切片用紅色sirius F3B染色通過分析圖象對膠原進行比色測量與照片的關(guān)系2、結(jié)果在所檢查的組中，第2天進行的提取沒有對膠原酶表現(xiàn)出任何顯著的活性。為此原因，存活、接觸和施用都延長至第4天。從兩個方面評價膠原酶的作用膠原網(wǎng)的著色強度和皮膚結(jié)構(gòu)的厚度。通過本研究，活性成分的滲透作用與其對膠原酶的抑制活性是相關(guān)的。所得結(jié)果如下—對于沒有膠原酶的對照，皮膚具有正常的結(jié)構(gòu)，而且膠原束在所有的腔室中都是規(guī)律的，—對于含有膠原酶的對照，膠原束被非常強烈地分解，而且皮膚的厚度減到一半，—對于使用賦形劑和膠原酶的外植組織，膠原束被強烈分解，其變化小于用含有膠原酶的對照的細胞，而且皮膚的厚度減小差不多一半，—對于使用5％GM產(chǎn)物和膠原酶的外植組織，膠原束被略微分解，而且皮膚的厚度略微減小，—對于使用陽性對照(菲咯啉)和膠原酶的外植組織，皮膚結(jié)構(gòu)與沒有使用膠原酶的對照是相同的。
實施例5在活體外的脂肪組織的外植組織上評估根據(jù)本發(fā)明的方法得到的DHA的抗脂解活性1、操作模型DHA以0.25和0.5％的最終濃度摻入到培養(yǎng)液中。接觸8天后，通過培養(yǎng)液中析出的脂質(zhì)量來評估活性。
a、外植組織的制備制備12個脂肪組織的外植組織，然后放入BEM培養(yǎng)基(BIO-EC′s外植組織培養(yǎng)基)中。將外植組織分為4個組，每組3個外植組織對照組陽性對照組(0.1％的咖啡因)兩個產(chǎn)物組(0.25和0.5％的DHA)b、產(chǎn)物的施用在第0天，將外植組織放入2ml的培養(yǎng)基中，在該培養(yǎng)基中摻入了待測試的產(chǎn)物。
該處理在第2、4和6天時進行更新。
c、提取在第2、4、6和8天時，提取培養(yǎng)基。對于每個外植組織，在第2、4、6和8天時提取的培養(yǎng)基都放入一個相同的試管中，并在-20℃下保存以檢測脂質(zhì)的量。
在第8天時，提取脂肪組織的外植組織并固定在普通的Bouin中以進行組織學(xué)研究。
d、組織學(xué)已固定的脂肪組織的外植組織被脫水，浸漬在石蠟中，成塊狀，切片，然后用trichrome de Masson染色。
e、脂質(zhì)的量在提取培養(yǎng)基后，分離并用CCM測量脂質(zhì)的量。
2、結(jié)果通過組織學(xué)研究檢查脂肪細胞的存活率和形態(tài)。
脂解活性通過分析甘油單酯、甘油二酯、甘油三酯以及游離脂肪酸的比例來評估。
a、組織學(xué)維持存活8天后，對照和經(jīng)過處理的外植組織既沒有肉眼可見的改變，也沒有細胞壞死。
b、脂質(zhì)的量所得結(jié)果總結(jié)在以下表4中。這些結(jié)果是用8天的處理時間內(nèi)在培養(yǎng)基中各類游離脂質(zhì)的質(zhì)量(μg)來表示。
表4

以下表5表示通過對在8天的處理期間培養(yǎng)基中的游離脂肪酸的量的結(jié)果進行Student檢驗而得到的統(tǒng)計分析。
表5

該研究中的基本參數(shù)是量的變化量以及在處理后培養(yǎng)基中游離脂肪酸的百分比。
對于未經(jīng)處理的對照，觀察到陽性對照(0.1％的咖啡因)增加約29倍(2780％)。
0.25％和0.50％的DHA分別導(dǎo)致1075％和1087％的顯著增加。所用濃度的增加沒有產(chǎn)生更高的效力。這好像說明最大效力的劑量應(yīng)在0.25％的數(shù)量級上。
在以上描述的操作條件下并根據(jù)Student檢驗，以0.25％和0.5％劑量施用的DHA與咖啡因處理的細胞相比具有顯著的脂解活性。
權(quán)利要求
1.制備以下通式(Id)之脂族不飽和羥基酸及其酯的方法 其中n＝1-4，m＝2-16，R1＝OH、Cl、Br、OR3，其中R3代表具有1-16個碳原子的直鏈或支鏈烷基、烯基、炔基、或者甘油的酯，它們?nèi)芜x被一個或者多個碳、氮、硫或鹵原子取代，所述鹵原子是氟、氯、溴或碘，R2代表H、SiR′1R′2R′3，其中R′1、R′2、R′3相同或不同，并代表具有1-16個碳原子的直鏈或支鏈烷基、烯基、炔基、或者甘油的酯，它們?nèi)芜x被一個或者多個碳、氮、硫或鹵原子取代，所述鹵原子是氟、氯、溴或碘，或者R2代表C-Ar3，其中Ar代表任選被一個或多個碳、氮、硫或鹵原子取代的芳基，所述鹵原子是氟、氯、溴或碘，或者R2代表以下式的四氫吡喃基 該方法的特征在于是根據(jù)以下反應(yīng)路線來合成 其中R1、R2、m和n與通式(Id)中的定義相同。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，第一步是溴化反應(yīng)，起始化合物是式(II)的二醇。
3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，第一步需要使用溶劑。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述溶劑選自于以下組中甲苯、苯、二甲基甲酰胺、四氫呋喃、環(huán)己烷、庚烷和石油醚。
5.如任一前述權(quán)利要求所述的方法，其特征在于，第一步中所用的反應(yīng)物選自于含水或不含水的HBr、Ph3P-Br2、四溴化碳-三苯基膦、氫溴酸。
6.如任一前述權(quán)利要求所述的方法，其特征在于，第二步是在環(huán)狀或非環(huán)狀、無水或含水的叔胺N-氧化物以及DMSO存在下氧化形成式(IV)的醛。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述環(huán)狀或非環(huán)狀、無水或含水的叔胺N-氧化物選自于N-甲基嗎啉氧化物、三甲胺氧化物或三乙胺氧化物或者它們的混合物。
8.如任一前述權(quán)利要求所述的方法，其特征在于，第三步是Witting-Homer反應(yīng)，而第四步是皂化反應(yīng)。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述Witting-Homer反應(yīng)是在三乙基磷酰乙酸酯和碳酸鉀存在下實施的。
10.如任一前述權(quán)利要求所述的方法，其特征在于，第五步是一個特異性保護在第四步中得到的通式(Ib)化合物的醇官能團的步驟。
11.如任一前述權(quán)利要求所述的方法，其特征在于，第五步是在酸催化劑存在下于烯醇醚中進行的。
12.如任一前述權(quán)利要求所述的方法，其特征在于，第五步是在APTS(對甲苯磺酸)存在下于二氫吡喃中進行的。
13.如任一前述權(quán)利要求所述的方法，其特征在于，第五步中得到的通式(Id)產(chǎn)物進行最終的脫保護以得到通式(Ie)的化合物。
14.如權(quán)利要求1-12之一所述的方法，其特征在于，第五步中得到的通式(Id)產(chǎn)物在進行最終的脫保護之前用于甘油的酯化反應(yīng)中。
15.如權(quán)利要求13或14所述的方法，其特征在于，所述的脫保護是在包含酸催化劑的甲醇溶液中進行的。
16.如權(quán)利要求15所述的方法，其特征在于，所用的酸催化劑是ATPS。
17.根據(jù)任一前述權(quán)利要求的方法得到的產(chǎn)物在藥物和/或化妝品制劑中作為抗膠原酶活性劑的應(yīng)用。
18.如權(quán)利要求17所述的應(yīng)用，其特征在于，所述產(chǎn)物是羥基-10-癸烯-2(反)油酸(DHA)或羥基-10-癸烯-2(反)油酸的甘油酯。
19.如權(quán)利要求18所述的應(yīng)用，其特征在于，所述藥物制劑是用于預(yù)防或者抵抗膠原的分解。
20.如權(quán)利要求19所述的應(yīng)用，其特征在于，所述藥物制劑是用于預(yù)防或者抵抗細菌感染期間細菌膠原酶對膠原的分解。
21.如權(quán)利要求18所述的應(yīng)用，其特征在于，所述藥物制劑是用于皮膚和韌帶的再生。
22.如權(quán)利要求18所述的應(yīng)用，其特征在于，所述藥物制劑是用于預(yù)防或者抵抗腫瘤的侵入。
23.如權(quán)利要求18所述的應(yīng)用，其特征在于，所述藥物制劑是用于預(yù)防或者抵抗包括膠原類纖維蛋白變性并且稱為“膠原病”的變性疾病。
24.根據(jù)權(quán)利要求1-16之一所述的方法制得的產(chǎn)物在藥物和/或化妝品制劑中作為脂解活性劑的應(yīng)用。
25.根據(jù)權(quán)利要求1-16之一所述的方法制得的產(chǎn)物在藥物和/或化妝品制劑中作為抗痤瘡活性劑的應(yīng)用。
26.如權(quán)利要求24或25所述的應(yīng)用，其特征在于，所述產(chǎn)物是羥基-10-癸烯-2(反)油酸(DHA)。
全文摘要
本發(fā)明涉及制備通式(Id)的不飽和羥基脂肪酸及其酯的方法，以及該化合物在藥物和/或化妝品制劑中作為抗膠原酶活性劑、脂解活性劑和/或抗痤瘡活性劑的應(yīng)用。
文檔編號A61P11/00GK1555351SQ02817943
公開日2004年12月15日 申請日期2002年9月11日 優(yōu)先權(quán)日2001年9月12日
發(fā)明者皮埃爾·波捷, 弗朗索瓦絲·皮科, 讓－路易·布拉耶爾, 住げ祭 , 瓦絲 皮科, 皮埃爾 波捷 申請人:皮埃爾·波捷, 皮埃爾 波捷