專利名稱：藤黃酸作為熱休克蛋白90抑制劑的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及藤黃酸，特別涉及藤黃酸作為熱休克蛋白90抑制劑的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
熱休克蛋白(Heat shock proteins，Hsps)是真核細(xì)胞中的一類分子伴侶，其主 要功能是參與新生蛋白的合成、變性蛋白的復(fù)性及細(xì)胞內(nèi)部蛋白的遷移等生命活動(dòng)。熱休 克蛋白90(Hsp90)作為熱休克蛋白家族中重要的一員，在細(xì)胞的生命活動(dòng)中扮演重要的角 色，其在細(xì)胞中的含量約占細(xì)胞蛋白總量的 2%。Hsp90參與細(xì)胞代謝、生長、發(fā)育、分 化、死亡和免疫等幾乎所有的生理過程的調(diào)節(jié)，因此其活性異常與人體的許多疾病(如神 經(jīng)退行性疾病、心血管類疾病、病毒感染和癌癥等)密切相關(guān)。人體中的Hsp90 —般可以分為Hsp90 α、Hsp90 β、GRP94和TRAPl等亞型，其單體 由一個(gè)25kDa的N-末端和一個(gè)15kDa的C-末端，通過約40kDa的中間連接區(qū)(TRAP1不含 這個(gè)區(qū))組成。目前針對(duì)Hsp90開發(fā)的抑制劑類化合物，有些已作為抗腫瘤藥物應(yīng)用于臨 床研究。尋找和發(fā)現(xiàn)新穎的Hsp90抑制劑，對(duì)于Hsp90相關(guān)疾病的治療具有重要的意義。藤黃酸是60年代從中藥藤黃中分離到的蒽酮類化合物，早期的研究表明藤黃 酸對(duì)腫瘤細(xì)胞有較強(qiáng)的抑制作用(Guo QL，You QD, Wu ZQ，Yuan ST, Zhao L =General gambogic acids inhibited growth of human hepatoma SMMC-7721 cells in vitro and in nude mice. Acta PharmacolSin 2004，25 :769_774.)，但迄今尚未見藤黃酸作為 Hsp90 抑制劑應(yīng)用的研究報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供藤黃酸在制備熱休克蛋白90抑制劑中的應(yīng)用。所述藤黃酸的名稱為(ζ) _甲基-3-戊烯基)_ ； 1，5- 二亞甲基-1，3，11-三氫-呋 喃并(3,4-g)吡喃并(3,2-b)蒽酮-1-巴豆酸，分子式為C38H44O8，結(jié)構(gòu)式為 所述藤黃酸(Gambogic acid，簡稱GB)為金黃色結(jié)晶，旋光度為-685° (甲醇)， 不易溶于水，在甲醇等有機(jī)溶劑中有較好的溶解性。實(shí)驗(yàn)表明，所述藤黃酸對(duì)Hsp90具有較強(qiáng)的抑制作用，是Hsp90的非競爭性可逆抑 制劑。其對(duì)HeLa細(xì)胞的IC5tl低于1 μ mol/L，具有很強(qiáng)的抗腫瘤活性，能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的 凋亡，抗腫瘤作用靶點(diǎn)明確，可用于制備治療癌癥等的藥物。鑒于藤黃酸對(duì)Hsp90的抑制作用，且Hsp90在引起腫瘤細(xì)胞凋亡等生物學(xué)過程中發(fā)揮著重要的作用，因而藤黃酸可在制 備熱休克蛋白90抑制劑中的應(yīng)用。


圖1為藤黃酸對(duì)Hsp90的ATPase活性的抑制作用。在圖1中，橫坐標(biāo)為化 合物Compounds,濃度均為200ymol/L,縱坐標(biāo)為抑制率Inhibition(% )，圖1表明， 藤黃酸對(duì)Hsp90的ATPase活性的抑制作用最強(qiáng)，抑制率接近80%，甚至高于陽性對(duì)照 GA(geldanamycin)。圖2為藤黃酸作用HeLa細(xì)胞24h后相關(guān)蛋白質(zhì)表達(dá)的Western blot分析結(jié)果。 在圖2中，隨著藤黃酸濃度(0. 2、0. 5、1.0、1.5μπιΟ1/ 的增加，Hsp90的客戶蛋白Akt和 磷酸化的Akt表達(dá)量下調(diào)，而Hsp70的表達(dá)量顯著上調(diào)，表明藤黃酸對(duì)Hsp90客戶蛋白質(zhì)具 有降解作用。圖2中的GA為陽性對(duì)照。圖3為藤黃酸對(duì)Hsp90內(nèi)源熒光的影響。在圖3中，橫坐標(biāo)為波長 Wavelength (nm)，縱坐標(biāo)為熒光強(qiáng)度 Fluorescence Intensity (a. u)。藤黃酸對(duì) Hsp90 的內(nèi) 源熒光具有較強(qiáng)的淬滅作用，隨著濃度的增加，淬滅作用增強(qiáng)。表明藤黃酸與Hsp90間形成 了靜態(tài)復(fù)合物。由上述曲線可以計(jì)算得出藤黃酸與Hsp90的解離常數(shù)約為3. 5ymol/L。圖4為分子相互作用儀(Fortebio)檢測藤黃酸與Hsp90的結(jié)合。在圖4中，橫坐 標(biāo)為結(jié)合與解離的時(shí)間(sec)，縱坐標(biāo)為光移動(dòng)的距離Shift，不同濃度(0、l、2、5ymOl/L) 的藤黃酸與Hsp90結(jié)合的曲線見圖4中的600s以內(nèi)的曲線。而600s以上的曲線為二者解 離的曲線。經(jīng)計(jì)算得出二者間的解離常數(shù)約為3.0 μ mol/L。圖5為藤黃酸對(duì)Hsp90紫外可見光譜的影響。在圖5中，橫坐標(biāo)為波長(nm)，縱坐 標(biāo)為Hsp90在有無藤黃酸存在時(shí)的吸收光譜Absorption。由圖5可見，隨著藤黃酸濃度的 增加，Hsp90的吸收光譜發(fā)生有規(guī)律的變化，進(jìn)一步表明藤黃酸與Hsp90結(jié)合，導(dǎo)致其發(fā)色 團(tuán)受到影響，從而使吸收光譜發(fā)生改變。圖6為藤黃酸對(duì)Hsp90構(gòu)象的影響。在圖6中，橫坐標(biāo)為波長(nm)，縱坐標(biāo)為偏 振光的吸光度差(mdeg. cm. μ mol/L)，由圖6可見，在濃度為1. 4 μ mol/L的藤黃酸作用下， Hsp90的α -螺旋結(jié)構(gòu)由原來的21. 5%降低至17. 5%，即藤黃酸的結(jié)合導(dǎo)致Hsp90構(gòu)象的改變。圖7為藤黃酸對(duì)Hsp90的非競爭性可逆抑制作用。圖7是雙倒數(shù)圖，橫坐標(biāo)為ATP 濃度的倒數(shù)1/[ATP]，縱坐標(biāo)為反應(yīng)速度的倒數(shù)1/v。由圖7可見，藤黃酸對(duì)Hsp90的ATPase 活性的抑制作用的雙倒數(shù)圖呈現(xiàn)橫軸的截距不變，而縱軸的截距逐漸變低的系列直線。由 此可以判斷藤黃酸是Hsp90的非競爭性可逆抑制劑。圖8為藤黃酸對(duì)HeLa細(xì)胞的細(xì)胞毒作用。在圖8中，橫坐標(biāo)為藤黃酸的濃度 Concentration ( μ M)，縱坐標(biāo)為HeLa細(xì)胞的抑制率Inhibition )。圖8表明藤黃酸對(duì) HeLa細(xì)胞的抑制作用呈現(xiàn)濃度依賴性。由此計(jì)算得出其IC5tl約為0. 69 μ mol/L。圖9為藤黃酸對(duì)HeLa細(xì)胞形態(tài)的影響。由圖9可見，隨著藤黃酸濃度的增高，細(xì) 胞形態(tài)發(fā)生明顯改變。從左至右分別為陰性對(duì)照；0.2、0.5、1.0、1.5ymol/L的藤黃酸以及 陽性對(duì)照(GA)的作用結(jié)果。可見藤黃酸在濃度較高時(shí)，其對(duì)HeLa細(xì)胞的形態(tài)影響較大，細(xì) 胞出現(xiàn)收縮變圓的凋亡形態(tài)。
圖10為藤黃酸誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡。圖10中橫坐標(biāo)為DNA含量DNA content,縱 坐標(biāo)為細(xì)胞數(shù)Relative cell number ；在圖 10 中，用不同濃度(0、0· 2、0· 5、1. 0、1. 5 μ mol/ L)的藤黃酸作用HeLa細(xì)胞24和48h后用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期的變化。隨著濃度和作 用時(shí)間的延長，HeLa細(xì)胞周期分布發(fā)生明顯的變化，約有75%的細(xì)胞發(fā)生凋亡。圖11為藤黃酸對(duì)HeLa細(xì)胞中凋亡調(diào)控蛋白質(zhì)表達(dá)的影響。藤黃酸引起HeLa細(xì) 胞的凋亡與Hsp90客戶蛋白的降解及Bax(—種促凋亡蛋白質(zhì))升高以及凋亡抑制蛋白質(zhì) XIAP的下調(diào)有關(guān)。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)例進(jìn)一步闡述本發(fā)明，但這些實(shí)例僅用于說明本發(fā)明，而不用于 限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1、藤黃酸對(duì)Hsp90的ATP酶(ATPase)活性的抑制作用采用孔雀綠磷鉬酸銨分析法檢測藤黃酸對(duì)Hsp90催化ATP水解的抑制作用。預(yù)先配置無機(jī)磷檢測試劑Solution A (孔雀綠、聚乙烯醇、鉬酸銨與水按 2:1:1: 2混合)，Solution 8(34%的檸檬酸鈉)。實(shí)驗(yàn)中的6々(格爾德霉素)、1 ((根 赤殼菌素)、NB (新生霉素)及CM(潮霉素)均為已知的Hsp90抑制劑，作陽性對(duì)照，DMSO 為陰性對(duì)照，空白對(duì)照以GST(谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶)代替Hsp90。反應(yīng)開始時(shí)，Hsp90與化合物 (濃度均為200μπιΟ1/ 室溫下混合lh，加入ATP啟動(dòng)反應(yīng)，反應(yīng)在96孔板中進(jìn)行。37°C， 反應(yīng)3h。3h后加入80 μ L Solution A終止ATP水解反應(yīng)，約5min后加入10 μ L Solution B終止顯色反應(yīng)，15min后于酶標(biāo)儀檢測OD62tl的值，每組數(shù)據(jù)做3次平行。抑制率(％ )= (陰性對(duì)照的3次平均值-實(shí)驗(yàn)組的平均值)/(陰性對(duì)照的3次平均值-空白對(duì)照組的平 均值)X 100%采用孔雀綠磷鉬酸銨分析法，發(fā)現(xiàn)藤黃酸對(duì)Hsp90的ATPase活性有很強(qiáng)的抑制作 用。在測試的所有化合物中，藤黃酸對(duì)Hsp90的ATPase活性的抑制作用最強(qiáng)，在200 μ mol/ L時(shí)，其抑制率接近80% (圖1)。實(shí)施例2、藤黃酸對(duì)Hsp90客戶蛋白的降解作用在該實(shí)施例中，采用Western Blot法檢測藤黃酸對(duì)腫瘤細(xì)胞中Hsp90的客戶蛋白 的降解作用。分別用0. 2、0· 5、1、1. 5 μ mol/L的藤黃酸處理HeLa細(xì)胞24h，1 μ mol/L的GA作為 陽性對(duì)照，等量DMSO作為陰性對(duì)照。吸去培養(yǎng)液，用PBS漂洗一次，加入細(xì)胞裂解液，4°C裂 解5min左右，快速刮取細(xì)胞置于1. 5mL離心管中。冰浴超聲裂解細(xì)胞10次，每次ls，得到 的細(xì)胞裂解液于4°C，13500rpm離心15min。取上清，Bradford法測定蛋白質(zhì)濃度，調(diào)整蛋 白濃度一致，加入2 X sample buffer (樣品緩沖液)混勻，100°C水浴lOmin，進(jìn)行SDS-PAGE 電泳。再100V電泳轉(zhuǎn)膜Ih到預(yù)先用甲醇浸潤過的硝酸纖維素(PVDF)膜上。5% BSA(牛 血清蛋白)室溫封閉lh，一抗(體積比1 1000稀釋)室溫孵育2h，TBST (Tris Buffered Saline with Tween)洗滌3次，每次lOmin。二抗(體積比1 5000稀釋)室溫孵育lh， TBST洗滌后的PVDF膜用增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光劑(ECL)溶液浸潤，顯影觀察。不同濃度的藤黃酸處理HeLa細(xì)胞24h后，Western blot檢測與Hsp90相關(guān)蛋白 的表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Hsp90的客戶蛋白Akt出現(xiàn)降解，而磷酸化的Akt (p-Akt)的水平下調(diào)；同時(shí)Hsp70表達(dá)量上調(diào)(圖2)，與陽性對(duì)照GA的作用結(jié)果一致，表明藤黃酸在細(xì)胞水 平上，亦對(duì)Hsp90具有較強(qiáng)的抑制作用。實(shí)施例3、熒光光譜法檢測藤黃酸與Hsp90的結(jié)合在該實(shí)施例中，使用熒光光譜法檢測藤黃酸與Hsp90的結(jié)合作用。使用大腸桿菌異源表達(dá)Hsp90融合蛋白，蛋白溶于PBS(pH 7.4)中。實(shí)驗(yàn)前先將 Hsp90用PBS(pH 7.4)稀釋至1 μ mol/L，取2mL至熒光比色皿并置于熒光分光光度計(jì)中，實(shí) 驗(yàn)分別在293，303和3101( 3個(gè)溫度下進(jìn)行。藤黃酸溶于DMSO中，濃度為lOmol/L。實(shí)驗(yàn)采 取滴加的方式增加體系中抑制劑的含量，每次加入后都要充分混勻，待體系穩(wěn)定后重復(fù)測 定三次。藤黃酸的濃度變化分別為0、l、2、3、4、5、6、7、8、9、10ymol/L。儀器參數(shù)設(shè)置激發(fā)波長為280nm，激發(fā)及發(fā)射狹縫寬度均為5nm，掃描速度為快 速掃描(間隔2nm/次)，記錄290 500nm的熒光光譜。藤黃酸對(duì)Hsp90的內(nèi)源熒光具有較強(qiáng)的猝滅作用(圖3)，表明Hsp90與藤黃酸間 形成了靜態(tài)復(fù)合物。經(jīng)計(jì)算得出二者的解離常數(shù)約為3. 5 μ mol/L。實(shí)施例4、Fortebio實(shí)驗(yàn)證明藤黃酸與Hsp90的結(jié)合在該實(shí)施例中，采用Fortebio法驗(yàn)證藤黃酸與Hsp90的結(jié)合。使用大腸桿菌異源表達(dá)Hsp90融合蛋白，將Hsp90蛋白用生物素(biotin，B)進(jìn) 行標(biāo)記，利用B與(str印tavidin，SA)特異性的結(jié)合將目的蛋白固定在SA-biosenser上。 標(biāo)記后的蛋白B-Hsp90過脫鹽柱將未結(jié)合的B截留，并收集B-Hsp90濃縮至10 μ mol/L 于-80°C貯藏。實(shí)驗(yàn)中Hsp90蛋白濃度為0. 7 μ mol/L,藤黃酸濃度分別為1、2、4、5 μ Μ,結(jié)合 與解離的時(shí)間均為lOmin，實(shí)驗(yàn)溫度為303K。藤黃酸與Hsp90的結(jié)合及解離曲線(圖4)以及由此計(jì)算得出的解離常數(shù) (3. O μ mol/L)，表明Hsp90與藤黃酸有較強(qiáng)的結(jié)合。實(shí)施例5、吸收光譜法檢測藤黃酸與Hsp90的結(jié)合在該實(shí)施例中，采用紫外可見光譜法檢測Hsp90與藤黃酸的結(jié)合。 使用大腸桿菌異源表達(dá)Hsp90融合蛋白，Hsp90溶于PBS (pH = 7. 4)中。實(shí)驗(yàn)前 先用PBS對(duì)儀器進(jìn)行基線校正，將Hsp90稀釋至3. 3 μ mol/L。藤黃酸溶于DMSO中，實(shí)驗(yàn)采 取逐滴加入的方式，每次加入后充分混勻并反應(yīng)lmin，記錄200 500nm的吸收光譜。實(shí)驗(yàn) 在298K下進(jìn)行，藤黃酸的濃度變化分別為l、2、3、4、6、7.5、9ymol/L?？瞻讓?duì)照為相同條件 下100 μ L PBS中加入等量的化合物或DMS0，作為本底值在數(shù)據(jù)處理中扣除。隨著藤黃酸濃度的增加，Hsp90的吸收光譜發(fā)生有規(guī)律的變化(圖5)，進(jìn)一步表明 藤黃酸與Hsp90結(jié)合，導(dǎo)致其發(fā)色團(tuán)受到影響。實(shí)施例6、藤黃酸對(duì)Hsp90 二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響在該實(shí)施例中，采用圓二色譜法檢測藤黃酸對(duì)Hsp90 二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響。使用大腸桿菌異源表達(dá)Hsp90融合蛋白，蛋白于lOmol/L PBS (pH 7. 6)中透析除 去洗脫緩沖液(Elution Buffer)中的小分子，超濾濃縮至10 μ mol/L待用。實(shí)驗(yàn)前先用 PBS對(duì)儀器進(jìn)行基線校正，取ImL濃度為0. 7 μ M的Hsp90至光路徑為0. 5mm石英比色皿中 并置于圓二色譜儀中。藤黃酸溶于乙腈中，濃度為lOmol/L。實(shí)驗(yàn)采取逐滴加入的方式改變 體系中抑制劑的含量，每次加入后都要充分混勻，反應(yīng)5min后再連續(xù)平行測定三次。藤黃 酸的濃度變化分別為0、0. 7,1. 4 μ mol/L,陰性對(duì)照及陽性對(duì)照分別為乙腈和GA。
儀器參數(shù)設(shè)置為靈敏度(sensitivity (IOOmdeg))；起始波長300nm，終止波長 190nm ；數(shù)據(jù)間隔(data pitch) :0· Inm ；掃描方式(scanning mode)連續(xù)掃描(continuous Scanning)；掃描速度(speed) :200nm/min ；頻帶寬度(band width) :lnm;溫度(T) :298K。在濃度為1.4μπι01/1的藤黃酸作用下，Hsp90的α -螺旋結(jié)構(gòu)由原來的21. 5%降 低至17. 5%。即藤黃酸的結(jié)合導(dǎo)致Hsp90構(gòu)象的改變(圖6)。實(shí)施例7、藤黃酸對(duì)Hsp90的非競爭性可逆抑制作用在該實(shí)施例中，通過酶動(dòng)力學(xué)分析方法，分析藤黃酸對(duì)Hsp90的可逆抑制作用。使用大腸桿菌異源表達(dá)Hsp90融合蛋白，蛋白于lOmol/L PBS (pH 7. 6)中透析除 去洗脫緩沖液(Elution Buffer)中的小分子，超濾濃縮至ΙΟμπιοΙ/L待用。通過酶動(dòng)力學(xué) 實(shí)驗(yàn)判斷抑制劑類型。在蛋白濃度一定的條件下(Chsp9ci = 0. 18 μ mol/L)，同時(shí)檢測ATP和 藤黃酸濃度的變化對(duì)Hsp90催化ATP水解速度的影響。陰性對(duì)照為2% DMS0，空白對(duì)照將 實(shí)驗(yàn)組中Hsp90替換為GST。反應(yīng)于37°C下進(jìn)行，時(shí)間為3h，每組數(shù)據(jù)3次平行。由ATP濃度與Hsp90催化ATP水解反應(yīng)速度的雙倒數(shù)圖可以判斷藤黃酸是Hsp90 的非競爭性可逆抑制劑(圖7)。實(shí)施例8、體外抗腫瘤活性檢測在該實(shí)施例中，采用MTT (Methyl Thiazolyltetrazolium)法檢測藤黃酸在體外對(duì) 腫瘤細(xì)胞的抑制效果。收集對(duì)數(shù)生長期的HeLa細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，以6X IO4個(gè)/mL接種于96孔板 中，每孔80 μ L.另設(shè)3孔無細(xì)胞的空白對(duì)照孔(僅含DMEM完全培養(yǎng)基)。置37°C，5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，然后加入20 μ L用DMEM完全培養(yǎng)基稀釋好的樣品，等量DMSO作 為陰性對(duì)照組，繼續(xù)培養(yǎng)72h.每孔加10 μ L濃度為5mg/mL MTT溶液，37°C反應(yīng)3h，每孔加 IOOyL終止液(10% SDS，0.01mol/L HCl)過夜，酶標(biāo)儀比色測定(測定波長595nm，參考 波長655nm).對(duì)腫瘤細(xì)胞生長的抑制率按下式計(jì)算抑制率=(陰性對(duì)照組OD值-實(shí)驗(yàn)組 OD值)/ (陰性對(duì)照組OD值-空白組OD值)X 100%，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。半數(shù)抑制率(IC5tl)為腫瘤細(xì)胞生長抑制率為50%時(shí)的樣品濃度。藤黃酸對(duì)宮頸癌細(xì)胞HeLa具有很強(qiáng)的抑制活性，IC50為0. 69 μ mol/L (圖8)。實(shí)施例9、細(xì)胞凋亡分析在該實(shí)施例中，采用碘化丙啶(propidium iodide, PI)染色及流式細(xì)胞儀(Flow CytoMeter, FCM)測定法檢測藤黃酸誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的效果。細(xì)胞存活率測定取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞，均以1. 5 2X IO5個(gè)/mL密度接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板上或 者是以0. 5 1 X IO5個(gè)/mL密度接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板上。培養(yǎng)過夜后，用藤黃酸處理 細(xì)胞，同時(shí)以未經(jīng)處理細(xì)胞為陰性對(duì)照。 消化收集藥物處理了 一定時(shí)間的細(xì)胞，包括培養(yǎng)液中懸浮的死細(xì)胞，SOOrpm離 心5min，去上清，加ImL PBS緩沖液重懸細(xì)胞，再次離心去上清，最后重懸細(xì)胞于含5g/mL PI 的 PBS 緩沖液中(PI buffer :3· 4mmol/L 檸檬酸鈉(Trisodium Citrate) ,9. 65mmol/L NaCl，PI 20mg/mL，0. 03% Nonidet P-40，配于H2O中)，避光冰上孵育lOmin，流式細(xì)胞儀測 定細(xì)胞存活率。
細(xì)胞周期測定
細(xì)胞的前期接種、藥物處理與收集同上。收集的細(xì)胞經(jīng)PBS緩沖液洗一次后，去上 清，將細(xì)胞逐滴加入70%預(yù)冷的乙醇中，-22°C固定6h以上。離心去上清，重懸細(xì)胞于PBS緩 沖液，再次離心，去上清，最后重懸細(xì)胞于含lOOimit/mL RNA酶的PBS緩沖液中，避光37°C 處理30min，加2mg/mL PI至終濃度50g/mL，避光孵育lOmin，過濾后流式細(xì)胞儀分析。對(duì)經(jīng)藤黃酸作用后的HeLa細(xì)胞的形態(tài)進(jìn)行顯微觀察。HeLa細(xì)胞經(jīng)濃度為0. 2、
0.5,1. O和1. 5 μ mol/L的藤黃酸分別處理24h和48h。正常的HeLa細(xì)胞呈多角形，飽滿， 細(xì)胞邊緣較為圓滑，貼壁牢固；而1. 0 μ mol/L的藤黃酸處理24h的HeLa細(xì)胞開始皺縮，
1.5 μ mol/L的藤黃酸處理48h的HeLa細(xì)胞變圓，開始從壁上脫落，懸浮細(xì)胞增多(圖9)。 從左至右分別為陰性對(duì)照；0.2、0.5、1.0、1.5ymol/L的藤黃酸以及陽性對(duì)照(GA)的作用 結(jié)果?？梢娞冱S酸在濃度較高時(shí)，其對(duì)HeLa細(xì)胞的形態(tài)影響較大，細(xì)胞出現(xiàn)收縮變圓的凋 亡形態(tài)。用濃度為0. 2、0. 5、1. 0和1. 5 μ mol/L的藤黃酸作用HeLa細(xì)胞24和48h，測定細(xì) 胞周期分布，從圖中可以看出隨時(shí)間的延長，濃度的升高，相應(yīng)的凋亡峰逐漸增加(圖10)。 用濃度為1. 5 μ mol/L的藤黃酸處理HeLa細(xì)胞48h，其凋亡細(xì)胞占到70%以上，即藤黃酸可 以引起HeLa細(xì)胞發(fā)生凋亡。用Western blot法檢測凋亡相關(guān)蛋白質(zhì)表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)藤黃酸引起HeLa細(xì)胞 的凋亡與Hsp90客戶蛋白的降解及Bax(—種促凋亡蛋白質(zhì))升高以及凋亡抑制蛋白質(zhì) XIAP的下調(diào)有關(guān)。但Bcl-2的下調(diào)不明顯。(圖11)。
權(quán)利要求
藤黃酸在制備熱休克蛋白90抑制劑中的應(yīng)用。
全文摘要
藤黃酸作為熱休克蛋白90抑制劑的用途。涉及藤黃酸，提供藤黃酸在制備熱休克蛋白90抑制劑中的應(yīng)用。所述藤黃酸的名稱為(z)-甲基-3-戊烯基)-；1，5-二亞甲基-1，3，11-三氫-呋喃并(3，4-g)吡喃并(3，2-b)蒽酮-1-巴豆酸，分子式為C38H44O8，旋光度為-685°，不易溶于水，在甲醇等有機(jī)溶劑中有較好的溶解性。所述藤黃酸能夠抑制熱休克蛋白90的ATP酶活性，降解熱休克蛋白90的客戶蛋白，在制備治療各種因熱休克蛋白90活性異常引起的疾病的藥物上具有廣泛的應(yīng)用。
文檔編號(hào)A61P35/00GK101890000SQ20101025644
公開日2010年11月24日 申請(qǐng)日期2010年8月18日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月18日
發(fā)明者孫藝飛, 宋思揚(yáng), 張連茹, 易玉婷, 沈月毛, 胡志鈺, 鄭忠輝, 郭秋菊, 陳俊杰 申請(qǐng)人:廈門大學(xué)