專利名稱：一種葉酸受體靶向型納米金顆粒及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及納米金顆粒，特別涉及一種葉酸受體靶向型納米金顆粒及其制備方法。
背景技術(shù)：
納米金顆粒(GNPs)越來越廣泛地應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)研究中。納米金顆粒作為 成像試劑具備很多優(yōu)點(diǎn)，相對于其他物質(zhì)，納米金顆粒自身具有很強(qiáng)的表面等離子共振 (Surface PlasmonResonance, SPR)吸收和散射特性，使其更加有利于用作造影劑應(yīng)用于 醫(yī)學(xué)檢測。納米金顆粒對光漂作用不敏感，且表現(xiàn)出良好的生物相容性和無細(xì)胞毒性。納 米金顆粒廣泛應(yīng)用的另一個重要原因是其易于進(jìn)行生物修飾，納米金顆粒的表面容易與巰 基、氨基以及二硫化物等進(jìn)行結(jié)合，尤其是通過形成金硫(Au-S)鍵，可以將多肽、核酸以及 蛋白質(zhì)等生物分子結(jié)合到納米金顆粒表面，對納米金顆粒的表面進(jìn)行修飾之后，可使納米 金顆粒具有分子靶向功能，將其應(yīng)用于腫瘤的早期診斷。谷胱甘肽(GSH)作為一種天然的小分子三肽，有其特殊的化學(xué)結(jié)構(gòu)，并且具有良 好的水溶性和化學(xué)穩(wěn)定性，可穩(wěn)定地結(jié)合在納米金顆粒的表面，使納米金顆?？蛇M(jìn)行進(jìn)一 步的修飾(Chen W. ,Tu X. , Guo X, Fluorescent gold nanoparticles-based fluorescence sensor for Cu2+ions. Chem. Commun. 2009 :1736-1738.)。葉酸分子可與谷胱甘肽修飾后的 納米金顆粒通過形成共價鍵而連接到納米金顆粒的表面，葉酸受體(folate receptors, FR)是細(xì)胞膜中錨在甘油磷酸脂酞肌醇上的單鏈糖蛋白。葉酸受體對葉酸及其類似物有 高度的親和力，且具有飽和性、可逆性和競爭性等基本特點(diǎn)。在腫瘤研究中發(fā)現(xiàn)，大部分腫 瘤細(xì)胞中的葉酸代謝旺盛，腫瘤細(xì)胞表面的葉酸受體明顯高于正常組織細(xì)胞表面的葉酸受 體，基于這一特點(diǎn)，葉酸受體作為腫瘤細(xì)胞的分子靶點(diǎn)受到了廣泛的關(guān)注。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一目的在于提供一種葉酸受體靶向型納米金顆粒。本發(fā)明的第二目的在于提供一種葉酸受體靶向型納米金顆粒的制備方法。所述一種葉酸受體靶向型納米金顆粒的由納米金顆粒、葉酸和谷胱甘肽組成，所 述谷胱甘肽的巰基和納米金顆粒的表面形成金硫(Au-S)鍵，所述谷胱甘肽中的羧基與所 述葉酸的氨基形成酰胺鍵。所述納米金顆粒、葉酸和谷胱甘肽的摩爾比可為1 (1 2) (1 3)。所述一種葉酸受體靶向型納米金顆粒的制備方法包括以下步驟1)將氯金酸溶液和檸檬酸三鈉溶液加入水中得混合溶液，將混合溶液加熱后冷卻 即得溶液A ；2)將谷胱甘肽溶液加入溶液A中，攪拌，透析后得溶液B ；3)往溶液B中加入N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)和二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)，攪拌混 勻后加入葉酸，再攪拌，透析，即得產(chǎn)物葉酸受體靶向型納米金顆粒。
在步驟1)中，所述氯金酸溶液、檸檬酸三鈉溶液與水的體積比可為1 5 94; 所述氯金酸溶液的質(zhì)量濃度可為1%，所述檸檬酸三鈉溶液的質(zhì)量濃度可為1%，所述加熱 可采用微波加熱，加熱的溫度可為100 120°C，加熱的時間可為1 lOmin。在步驟2)中，所述谷胱甘肽的濃度可為0. lmol/L，所述谷胱甘肽溶液與溶液A的 體積比可為1 200，攪拌的時間可為8 16h，透析的時間可為6 12h。在步驟3)中，所述N-羥基琥珀酰亞胺的濃度可為0. 05mol/L,所述N-羥基琥珀 酰亞胺與溶液B的體積比可為1 400;所述二環(huán)己基碳二亞胺的濃度可為0.05mol/L， 所述二環(huán)己基碳二亞胺與溶液B的體積比可為1 400;所述葉酸與溶液B的體積比可為 1 200 ；再攪拌的時間可為8 16h，透析的時間可為12 24h。本發(fā)明所述一種葉酸受體靶向型納米金顆粒能夠特異性識別表面有高水平葉酸 受體表達(dá)的細(xì)胞，可作為檢測腫瘤細(xì)胞的分子探針，在腫瘤細(xì)胞檢測中具有廣泛的應(yīng)用。本發(fā)明中的葉酸受體靶向型納米金顆粒經(jīng)透射電鏡檢測，粒徑在13 15nm之間， 為均一的球形結(jié)構(gòu)。經(jīng)過紅外光譜表征，葉酸分子通過自身的氨基與谷胱甘肽中的羧基形 成酰胺鍵，結(jié)合在納米金顆粒的表面。經(jīng)過X射線衍射表征，表明納米金顆粒的表面存在谷 胱甘肽和葉酸。拉曼光譜表明納米金顆粒與谷胱甘肽通過金硫(Au-S)鍵結(jié)合。MTT實(shí)驗表 明葉酸受體靶向型納米金顆粒具有良好的細(xì)胞活性和生物相容性。激光共聚焦掃描得出金 納米顆粒表面的葉酸與HeLa細(xì)胞表面的葉酸受體發(fā)生特異性結(jié)合，并定位于細(xì)胞質(zhì)中，可 以用于腫瘤細(xì)胞的診斷。本發(fā)明中的葉酸受體靶向型納米金顆粒與現(xiàn)有納米金顆粒相比具有許多優(yōu)點(diǎn)1)穩(wěn)定性好，在低于0. 5mol/L的鹽濃度條件下和pH值為3 11之間均能保持著 良好的穩(wěn)定性。2)沒有明顯的細(xì)胞毒性，所用的谷胱甘肽分子更小，更有利于細(xì)胞對納米金顆粒 的攝取，具有良好的生物相容性。3)具有良好的葉酸受體靶向性，可作為檢測腫瘤細(xì)胞的分子探針，在腫瘤檢測中 具有廣泛的應(yīng)用。


圖1為葉酸受體靶向型納米金顆粒的透射電鏡圖。在圖1中，標(biāo)尺為lOOnm。圖2為葉酸受體靶向型納米金顆粒的紫外可見吸收光譜圖。在圖2中，橫坐標(biāo)為 波長(nm)，縱坐標(biāo)為吸光度，曲線1為納米金顆粒，曲線2為葉酸受體靶向型納米金顆粒。圖3為葉酸受體靶向型納米金顆粒的X射線光電子圖譜。橫坐標(biāo)為結(jié)合能(eV)， 縱坐標(biāo)為脈沖計數(shù)。在圖3中，光電子能譜峰從左到右分別為々114€，52 ，(18，附8以及01s。圖4為金元素的窄譜圖。在圖4中，橫坐標(biāo)為結(jié)合能(eV)，縱坐標(biāo)為脈沖計數(shù)； Au4f分為Au 4f5/2和Au 4f7/2,結(jié)合能在87. 5eV和84. OeV,分別是由于AuC14_和Au所 決定的。圖5硫元素的窄譜圖。在圖5中，橫坐標(biāo)為結(jié)合能(eV)，縱坐標(biāo)為脈沖計數(shù)；S2p 譜分為162. IeV和163. 6eV，分別為S-H鍵，Au-S鍵中的結(jié)合能。圖6氮元素的窄譜圖。在圖5中，橫坐標(biāo)為結(jié)合能(eV)，縱坐標(biāo)為脈沖計數(shù)；Nls 譜能夠被分為2個峰，分別在398. 85eV和400. 6eV,該結(jié)合能的位置分別代表-NH2和-NHCO中的N。圖7為拉曼光譜。在圖7中，橫坐標(biāo)為拉曼位移(cnT1)，縱坐標(biāo)為強(qiáng)度；曲線a是未經(jīng)修飾的納米金顆粒，曲線b是經(jīng)過谷胱甘肽修飾的納米金顆粒，曲線c是經(jīng)過谷胱 甘肽和葉酸受體修飾的納米金顆粒。圖8為不同濃度的葉酸受體靶向型納米金顆粒與HeLa細(xì)胞和正常的成纖維細(xì)胞 共培養(yǎng)24h后的細(xì)胞存活情況統(tǒng)計圖。在圖8中，橫坐標(biāo)為葉酸受體靶向型納米金顆粒的濃 度(μ g/ml)，縱坐標(biāo)為細(xì)胞存活率(％ ) ;A為HeLa細(xì)胞，B為正常的成纖維細(xì)胞，Control 為未加葉酸受體靶向型納米金顆粒的空白對照。圖9為相同劑量的經(jīng)過FITC修飾過的葉酸受體靶向型納米金顆粒與Hela細(xì)胞和 A549細(xì)胞共培養(yǎng)2h后的激光共聚焦掃描圖。在圖9中，A為Hela細(xì)胞，B為A549細(xì)胞。圖10為葉酸受體靶向型納米金顆粒與HeLa細(xì)胞和A549細(xì)胞共培養(yǎng)2h后在細(xì)胞 內(nèi)的定位分布圖。在圖10中，A為Hela細(xì)胞，其標(biāo)尺為0. 5 μ m，其中C為細(xì)胞核，D為A的 局部放大圖，其標(biāo)尺為100nm，B為A549細(xì)胞，其標(biāo)尺為1 μ m。圖11為葉酸受體靶向型納米金顆粒與葉酸受體高表達(dá)的HeLa細(xì)胞相結(jié)合的檢測 結(jié)果圖。在圖11中，橫坐標(biāo)為細(xì)胞濃度(個/ml)，縱坐標(biāo)為吸光度變化值ΔΑ;·為HeLa 細(xì)胞， 為成纖維細(xì)胞，▲為不含細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)液。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1葉酸受體靶向型納米金顆粒的制備1)將94ml超純水、Iml 氯金酸溶液和5ml 1 %的檸檬酸三鈉溶液于室溫下混 勻，放入微波爐中加熱1 lOmin，自然冷卻至室溫，得溶液A，放入4°C冰箱保存。2)取溶液A 10ml，加入100 μ 1 0. lmol/L谷胱甘肽溶液，勻速攪拌過夜，將混合液 透析6h得溶液B。3)向溶液B中加入50 μ 1 0. 05mol/L的N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)和50 μ 1 0. 05mol/L的二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)，室溫攪拌lh，然后加入50 μ 1葉酸，攪拌12h，將混 合液透析12h即得產(chǎn)物葉酸受體靶向型納米金顆粒，其中納米金顆粒、葉酸和谷胱甘肽的 摩爾比為1:1:2。實(shí)施例2Hela細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)按照細(xì)胞培養(yǎng)的常規(guī)方法培養(yǎng)Hela細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)，分別取對數(shù)生長 期的Hela細(xì)胞和成纖維細(xì)胞，用0. 25%胰蛋白酶0. 02% EDTA消化液消化5min，添加PBS 調(diào)整細(xì)胞密度為1. 5X IO6個/ml，然后分別用PBS進(jìn)行稀釋調(diào)整細(xì)胞量，待檢測。實(shí)施例3葉酸受體靶向型納米金顆粒的鑒定使用透射電鏡和紫外分外光度計觀察葉酸受體靶向型納米金顆粒(參見圖1和 2)，可見葉酸受體靶向型納米金顆粒其呈酒紅色，透射電鏡下顆粒呈很規(guī)則的球型結(jié)構(gòu)，粒 徑比較均一，粒徑為20nm左右，分散性良好。葉酸受體靶向型納米金顆粒的X射線光電子圖譜表明(參見圖3 6)納米金顆 粒的表面是有葉酸以及谷胱甘肽存在的。在圖3中，光電子能譜峰從左到右分別為Au 4f， S2p，Cls，Nls以及01s。圖4為金元素的窄譜，Au 4f 5/2和Au 4f 7/2的結(jié)合能在87. 5eV 和84. OeV,分別是由于AuC14_和Au所決定的。圖5為硫元素的窄譜，可分為162. IeV和163. 6eV,分別為S-H鍵，Au-S鍵中的結(jié)合能；圖6為氮元素的窄譜，Nls譜能夠被分為2個 峰，分別在398. 85eV和400. 6eV,該結(jié)合能的位置分別代表-NH2和-NHCO中的N。拉曼光譜實(shí)驗表明，曲線a中納米金顆粒由于沒有進(jìn)行修飾，其在低頻率區(qū)域表 現(xiàn)出很弱的拉曼吸收情況，幾乎沒有特征峰，而在249. 9cm-1處有1個吸收峰，即為Au-Cl鍵 典型的拉曼吸收峰，納米金顆粒為了保持穩(wěn)定性，其表面有1個靜電雙電子層結(jié)構(gòu)，其中主 要是AuC14_。經(jīng)過谷胱甘肽修飾的納米金顆粒中在291. 317cm-1處有1個很強(qiáng)的拉曼吸收 峰，證實(shí)了谷胱甘肽與納米金顆粒通過Au-S相連接(參見圖7)。將不同濃度的葉酸受體靶向型納米金顆粒與HeLa細(xì)胞和正常的成纖維細(xì)胞共培 養(yǎng)24h，再檢測細(xì)胞的存活情況(參見圖8)。加入不同濃度的葉酸受體靶向型納米金顆粒 的細(xì)胞存活情況與沒有加入葉酸受體靶向型納米金顆粒的細(xì)胞存活情況沒有明顯差別，且 在增大葉酸受體靶向型納米金顆粒濃度后，一定范圍內(nèi)細(xì)胞依然表現(xiàn)出良好的存活率，表 明葉酸受體靶向型納米金顆粒具有良好的細(xì)胞相容性。相同劑量的經(jīng)過FITC修飾過的葉酸受體靶向型納米金顆粒與Hela細(xì)胞和A549 細(xì)胞共培養(yǎng)2h，激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞的變化(參見圖9)。從圖9A中可見Hela細(xì) 胞膜表面具有許多綠色熒光物(即為葉酸受體靶向型納米金顆粒)吸附，部分Hela細(xì)胞內(nèi) 也可見綠色熒光物，而作為對照的圖9B中的A549細(xì)胞膜表面及細(xì)胞內(nèi)基本沒有出現(xiàn)綠色 熒光物。之所以出現(xiàn)此種現(xiàn)象，是因為Hela細(xì)胞中的葉酸受體高表達(dá)，而A549細(xì)胞中的葉 酸受體低表達(dá)。葉酸受體靶向型納米金顆粒能夠與Hela細(xì)胞高表達(dá)的葉酸受體特異性結(jié) 合，并且Hela細(xì)胞表面幾乎完全被熒光物覆蓋，表明了葉酸受體靶向型納米金顆粒與葉酸 受體高表達(dá)的癌細(xì)胞有較高的結(jié)合效率，可以作為該類癌細(xì)胞早期診斷的工具。上述結(jié)果 還表明，被修飾在金納米顆粒表面的葉酸的活性并沒有受到影響，在與HeLa細(xì)胞孵育時， 可以特異性地和葉酸受體相結(jié)合，使靶細(xì)胞被金納米顆粒所識別。證明所制備的葉酸受體 靶向型納米金顆粒對葉酸受體高表達(dá)的細(xì)胞具有良好的靶向性。將葉酸受體靶向型納米金顆粒與HeLa細(xì)胞和A549細(xì)胞共培養(yǎng)2h后，再在透射電 鏡觀測葉酸受體靶向型納米金顆粒在細(xì)胞內(nèi)的定位分布情況(參見圖10)。從圖中可以看 出，葉酸受體靶向型納米金顆粒在HeLa細(xì)胞內(nèi)有分布，而在A549細(xì)胞內(nèi)則未能發(fā)現(xiàn)有葉酸 受體靶向型納米金顆粒的分布。同時還發(fā)現(xiàn)葉酸受體靶向型納米金顆粒未進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)， 因為葉酸受體靶向型納米金顆粒進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)是通過細(xì)胞表面高表達(dá)的葉酸受體的介導(dǎo)的 吞噬作用進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)涵體中，這些內(nèi)涵體在溶酶體的作用下釋放出葉酸受體靶向型納 米金顆粒，因此透射電鏡下觀察到的金納米顆粒都處于細(xì)胞質(zhì)中，這從另一角度說明葉酸 受體靶向型納米金顆粒對葉酸受體高表達(dá)的細(xì)胞具有靶向性。葉酸受體靶向型納米金顆粒與葉酸受體高表達(dá)的HeLa細(xì)胞的結(jié)合情況可通過如 下方法檢測1)取300 μ 1 10nmol/L的葉酸受體靶向型納米金顆粒溶液置于500 μ 1的離心 管中，向其加入100 μ 1不同濃度的Hela細(xì)胞懸液，輕微震蕩混勻后，在4°C的條件下孵育 30mino2)將這些孵育完成的離心管收集，以轉(zhuǎn)速為IOOOrpm離心5min，收集上清液，用紫 外可見分光光譜來進(jìn)行表征，記錄不同濃度條件下528nm處的吸光值。對照組為相同濃度 梯度的成纖維細(xì)胞，空白組為含有葉酸受體靶向型納米金顆粒的無酚紅DMEM培養(yǎng)基，未加細(xì)胞，每組實(shí)驗重復(fù)5次。計算葉酸受體靶向型納米金顆粒溶液離心后與離心前在528nm 處的吸光度變化值，即ΔΑ = AO-Al (AO =空白組吸光度，Al =離心后上清液的吸光度)。
隨著HeLa細(xì)胞濃度的增加，ΔΑ的值也隨之變大(參見圖11)，表明結(jié)合在細(xì)胞 表面的葉酸受體靶向型納米金顆粒就越多，因此離心后，上清液中的葉酸受體靶向型納米 金顆粒就越少。而葉酸受體低表達(dá)的成纖維細(xì)胞中，隨著濃度的增加，ΔΑ的值并沒有發(fā) 生太大的變化，這是因為葉酸受體靶向型納米金顆粒并不能有效地、穩(wěn)定地吸附在細(xì)胞表 面，不能隨著細(xì)胞的沉降而減少上清液中葉酸受體靶向型納米金顆粒的量，這一結(jié)果跟空 白對照組相類似，再次說明了葉酸受體靶向型納米金顆粒具有特異性識別葉酸受體高表達(dá) 的癌細(xì)胞的功能。隨著HeLa細(xì)胞檢測濃度的降低，在細(xì)胞濃度為10 100個/ml時，葉 酸受體靶向型納米金顆粒與HeLa細(xì)胞的結(jié)合呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系。其線性方程為A = 1. 0465+0. 0857C, R = O. 9984，其中A為吸光度，C為細(xì)胞濃度，R為相關(guān)系數(shù)。當(dāng)細(xì)胞濃度 為10個/ml時，Hela細(xì)胞與成纖維細(xì)胞的變化值經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析并沒有明顯差異，因此，基 于葉酸受體靶向型納米金顆粒系統(tǒng)檢測癌細(xì)胞的最低限度為100個/ml，這種較為簡便的 檢測方法的檢測最低限度已經(jīng)接近于文獻(xiàn)所報道的90個細(xì)胞。
權(quán)利要求
1.一種葉酸受體靶向型納米金顆粒，其特征在于所述一種葉酸受體靶向型納米金顆粒 的由納米金顆粒、葉酸和谷胱甘肽組成，所述谷胱甘肽的巰基和納米金顆粒的表面形成金 硫鍵，所述谷胱甘肽中的羧基與所述葉酸的氨基形成酰胺鍵。
2.如權(quán)利要求1所述的一種葉酸受體靶向型納米金顆粒，其特征在于所述納米金顆 粒、葉酸和谷胱甘肽的摩爾比為1 (1 2) (1 3)。
3.一種葉酸受體靶向型納米金顆粒的制備方法，其特征在于包括以下步驟1)將氯金酸溶液和檸檬酸三鈉溶液加入水中得混合溶液，將混合溶液加熱后冷卻即得 溶液A ；2)將谷胱甘肽溶液加入溶液A中，攪拌，透析后得溶液B；3)往溶液B中加入N-羥基琥珀酰亞胺和二環(huán)己基碳二亞胺，攪拌混勻，加入葉酸，再攪 拌，透析，即得產(chǎn)物葉酸受體靶向型納米金顆粒。
4.如權(quán)利要求3所述一種葉酸受體靶向型納米金顆粒的制備方法，其特征在于在步驟 1)中，所述氯金酸溶液、檸檬酸三鈉溶液與水的體積比為1 5 94。
5.如權(quán)利要求3所述一種葉酸受體靶向型納米金顆粒的制備方法，其特征在于在步驟 1)中所述氯金酸溶液的質(zhì)量濃度為1%，所述檸檬酸三鈉溶液的質(zhì)量濃度為1%。
6.如權(quán)利要求3所述一種葉酸受體靶向型納米金顆粒的制備方法，其特征在于在步驟1)中所述加熱采用微波加熱，加熱的溫度可100 120°C，加熱的時間為1 lOmin。
7.如權(quán)利要求3所述一種葉酸受體靶向型納米金顆粒的制備方法，其特征在于在步驟2)中所述谷胱甘肽的濃度可為O.lmol/L，所述谷胱甘肽溶液與溶液A的體積比為1 200。
8.如權(quán)利要求3所述一種葉酸受體靶向型納米金顆粒的制備方法，其特征在于在步驟 2)中攪拌的時間為8 16h，透析的時間為6 12h。
9.如權(quán)利要求3所述一種葉酸受體靶向型納米金顆粒的制備方法，其特征在于在在步 驟3)中所述N-羥基琥珀酰亞胺的濃度為0. 05mol/L,所述N-羥基琥珀酰亞胺與溶液B的 體積比為1 400 ；所述二環(huán)己基碳二亞胺的濃度為0.05mol/L，所述二環(huán)己基碳二亞胺與 溶液B的體積比為1 400;所述葉酸與溶液B的體積比為1 200。
10.如權(quán)利要求3所述一種葉酸受體靶向型納米金顆粒的制備方法，其特征在于在在 步驟3)中再攪拌的時間為8 16h，透析的時間為12 24h。
全文摘要
一種葉酸受體靶向型納米金顆粒及其制備方法，涉及納米金顆粒，提供一種葉酸受體靶向型納米金顆粒及其制備方法與應(yīng)用。所述一種葉酸受體靶向型納米金顆粒由谷胱甘肽、納米金顆粒和葉酸組成。制備方法包括將氯金酸溶液和檸檬酸三鈉溶液加入水中混勻，微波爐加熱后冷卻至得溶液A；將谷胱甘肽溶液加入溶液A中，攪拌，透析后得溶液B；往溶液B中加入NHS和DCC，攪拌混勻，加入葉酸，再攪拌，透析，即得產(chǎn)物葉酸受體靶向型納米金顆粒。所述一種葉酸受體靶向型納米金顆粒能夠特異性識別表面有高水平葉酸受體表達(dá)的細(xì)胞，可作為檢測腫瘤細(xì)胞的分子探針，在腫瘤細(xì)胞檢測中具有廣泛的應(yīng)用。
文檔編號A61K49/18GK102000350SQ201010566939
公開日2011年4月6日 申請日期2010年11月30日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月30日
發(fā)明者孫莉萍, 張召武, 賈靜, 賴友群, 馬燕燕 申請人:廈門大學(xué)