專利名稱：腸毒素c2超抗原突變蛋白和編碼基因及其制備和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及腸毒素C2超抗原突變蛋白，具體的說(shuō)是一種具有藥用前景的腸毒素 C2超抗原突變蛋白和編碼基因及其制備和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
超抗原(superantigen，SAg)是一組由細(xì)菌或病毒編碼的，并在極低濃度下對(duì)人 體或其他哺乳動(dòng)物T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生極強(qiáng)免疫刺激活性的蛋白質(zhì)分子。不像傳統(tǒng)的抗原，超 抗原不需要抗原遞呈細(xì)胞的加工處理，在抗原遞呈細(xì)胞外側(cè)的抗原結(jié)合區(qū)與MHC II (組織 相容性復(fù)合物)分子和T細(xì)胞V β區(qū)結(jié)合形成復(fù)合物，從而激發(fā)大量的T淋巴細(xì)胞增殖，進(jìn) 而導(dǎo)致在體外或體內(nèi)釋放大量的細(xì)胞因子和其它效應(yīng)分子。正因?yàn)槌?jí)抗原存在這種特殊 的生物活性和作用機(jī)理，所以致使其可以作為一種臨床上的免疫調(diào)節(jié)劑和抗腫瘤藥物，用 于的腫瘤治療。金黃色葡萄球菌腸毒素 C2(腸毒素 C2，Staphylococcal enterotoxinC2, SEC2) 是一類具有代表性的微生物外毒素。由于其極強(qiáng)的T細(xì)胞激活功能，成為一類典型微生物 超抗原，近年來(lái)受到人們的廣泛關(guān)注。但是，由于腸毒素C2超抗原的作用必須依賴于與免 疫系統(tǒng)中的MHC II分子相結(jié)合，這必然會(huì)導(dǎo)致其在人體中可能與來(lái)自正常組織或細(xì)胞的 MHC II分子的結(jié)合，從而對(duì)正常細(xì)胞也產(chǎn)生一定的毒性作用；此外，由于金黃色葡萄球菌腸 毒素是一種細(xì)菌外毒素，因此在對(duì)人體會(huì)產(chǎn)生一定的毒素綜合癥(TSQ和食物中毒癥狀， 并在臨床上表現(xiàn)為嘔吐、腹瀉、以及致熱等癥狀，因此限制了其臨床應(yīng)用和治療可得效果。 前期研究中，曾經(jīng)改變了 MHCII的結(jié)合能力，但發(fā)現(xiàn)隨著毒性降低，其抑瘤活性也有顯著降 低，臨床應(yīng)用前景不大。因此，一方面減少腸毒素C2作為細(xì)菌外毒素所帶來(lái)的毒副作用，另一方面保留或 增強(qiáng)其超抗原活性和腫瘤抑制能力，進(jìn)而提高腸毒素C2在未來(lái)抗腫瘤方面的開(kāi)發(fā)潛力，本 發(fā)明通過(guò)基因定點(diǎn)突變技術(shù)對(duì)SEC2中與毒性和超抗原活性相關(guān)的位點(diǎn)進(jìn)行突變，從而達(dá) 到降低毒性且保持抑瘤活性的目的，所構(gòu)建的腸毒素C2超抗原突變蛋白具有極高的臨床 藥用前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供具有藥用前景的腸毒素C2超抗原突變蛋白和編碼基因及其 制備方法和應(yīng)用。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下—種具有藥用前景的腸毒素C2超抗原突變蛋白，所述具有藥用前景的腸毒素C2 超抗原突變蛋白具有序列表SEQ ID NO 2, SEQ ID NO :4或SEQ IDNO :6中的氨基酸序列。一種具有藥用前景的腸毒素C2超抗原突變蛋白的編碼基因，所述編碼基因具有 序列表 SEQ ID NO =USEQ ID NO 3 或 SEQ ID NO 5 中堿基序列。具有藥用前景的腸毒素C2超抗原突變蛋白的制備方法
以金黃色葡萄球菌基因組DNA為模板，采用特異性PCR引物SeC2-F :5’ -CGG AAT TCG AGA GTC AAC CAG A-3，和 sec2_R :5，-TCG CTC GAG TTA TCCATT CTT TGT TG-3，擴(kuò)增 出SEC2全基因sec2 ；在此基礎(chǔ)上，以SEC2全基因sec2為模板，采用引物對(duì)sec2_F :5，-CGG AAT TCG AGA GTC AAC CAG A-3'禾口 R-Mutant 5' -TAT TTT CCA TCAAAC CAG TAA ACT CAC TTG-3'； F-Mutant, 5' -GTT TAC TGG TTT GAT GGA AAATAT GAA ΑΤΑ T-3’ 和 sec2_R :5’ -TCG CTC GAG TTA TCC ATT CTT TGT TG-3’分別擴(kuò)增獲得突變位點(diǎn)左側(cè)和右側(cè)的重疊PCR產(chǎn)物，然后 以sec2-F和sec2-R為引物，采用上述獲得突變位點(diǎn)左側(cè)和右側(cè)的重疊PCR產(chǎn)物為模板進(jìn) 行PCR擴(kuò)增擴(kuò)得具有序列表SEQ ID NO 7中堿基序列sec^ii突變基因；以具有序列表SEQ ID NO :7中堿基序列secaii基因?yàn)槟０?，采用引物?duì)sec2-F 5' -CGG AAT TCG AGA GTC AAC CAG AUPW -GGA ATAACA AAA GCT GAA GGA AAC CAC-3’ ；P2 :5’ -GGT TTC CTT CAG CTT TTGTTA TTC C-3’ 和 sec2_R :5’ -TCG CTC GAG TTA TCC ATT CTT TGT TG-3，分別擴(kuò)增獲得突變位點(diǎn)左側(cè)和右側(cè)的重疊PCR產(chǎn)物，然后以sec2-F 和sec2-R為引物，采用上述獲得突變位點(diǎn)左側(cè)和右側(cè)的重疊PCR產(chǎn)物為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增 擴(kuò)得具有序列表SEQ ID NO 1中堿基序列sam-Ι突變基因；以具有序列表SEQ ID NO :7中堿基序列secaii基因?yàn)槟０?，采用引物?duì)sec2-F 5，-CGG AAT TCG AGA GTC AAC CAG A-3，和 P3 5'-GGA AACGCC TTT GAT AAT GGG AAC-3，; P4 5'-CCA TTA TCA AAG GCG TTT CCTTC-3，和 sec2_R 5'-TCG CTC GAG TTA TCC ATT CTT TGT TG-3’分別擴(kuò)增獲得突變位點(diǎn)左側(cè)和右側(cè)的重疊PCR產(chǎn)物，然后以sec2-F和sec2-R為 引物，采用上述獲得突變位點(diǎn)左側(cè)和右側(cè)的重疊PCR產(chǎn)物為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增擴(kuò)得具有序 列表SEQ ID NO 3中堿基序列sam-2突變基因；以具有序列表SEQ ID NO 1中堿基序列sam-l基因?yàn)槟０?，采用引物?duì)seC2_F 5，-CGG AAT TCG AGA GTC AAC CAG A-3，和 P3 5'-GGA AACGCC TTT GAT AAT GGG AAC-3，; P4 5'-CCA TTA TCA AAG GCG TTT CCTTC-3，和 sec2_R 5'-TCG CTC GAG TTA TCC ATT CTT TGT TG-3’分別擴(kuò)增獲得突變位點(diǎn)左側(cè)和右側(cè)的重疊PCR產(chǎn)物，然后以sec2-F和sec2-R為 引物，采用上述獲得突變位點(diǎn)左側(cè)和右側(cè)的重疊PCR產(chǎn)物為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增擴(kuò)得具有序 列表SEQ ID NO 3中堿基序列sam-3突變基因；將以上突變基因sam-1、sam-2、sam-3分別克隆入表達(dá)載體pET48a，并轉(zhuǎn)化大腸 桿菌BL21(DE3)為宿主菌，構(gòu)建成基因工程菌，經(jīng)誘導(dǎo)后在菌體內(nèi)表達(dá)目的蛋白。并經(jīng)蛋白 分離純化得到具有藥用前景的腸毒素C2超抗原突變蛋白純品。所述的誘導(dǎo)方法是通過(guò)以IPTG為誘導(dǎo)物進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。所述的蛋白分離純化方 法為M親和層析法，所用的介質(zhì)為瓊脂糖凝膠樹(shù)脂。具有序列表SEQ ID NO :2、SEQ ID NO 4或SEQ ID NO 6中氨基酸序列的突變蛋 白具有可作為抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)類的臨床藥物的應(yīng)用前景。本發(fā)明所具有如下優(yōu)點(diǎn)1.本發(fā)明為人工構(gòu)建的系列編碼超抗原突變蛋白的核苷酸序列，獲知其基因全序 列的組成。2.本發(fā)明利用基因工程技術(shù)，突變構(gòu)建了一系列編碼具有藥用前景的腸毒素C2 超抗原突變蛋白的核苷酸基因，并在大腸桿菌中表達(dá)，表達(dá)獲得的一系列具有藥用前景的腸毒素C2超抗原突變蛋白經(jīng)檢驗(yàn)具有較好的超抗原活性和較高的腫瘤抑制活性。3.本發(fā)明構(gòu)建并獲得的系列超抗原突變蛋白由于顯著降低了其催吐、腹瀉和致熱 毒性，并保持了較高的腫瘤抑制活性，因此更具有用于臨床腫瘤治療的前景。4.本發(fā)明提供的制備大量減毒超抗原腸毒素C2突變蛋白的方法能使該系列蛋白 達(dá)到高效表達(dá)及純化，能滿足工業(yè)化生產(chǎn)的需要。


圖1為本發(fā)明中各腸毒素C2突變蛋白基因的PCR產(chǎn)物核酸電泳圖譜(其中M代 表 DL2000marker ;1、2、3、4 依次代表具有序列表 SEQ ID N0:1、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO 7中堿基序列的各突變基因的PCR產(chǎn)物sam-1、sam_2、sam-3和sec2m、)。圖2為本發(fā)明中各腸毒素C2突變蛋白純品的電泳圖譜(其中M代表蛋白marker ； 1、2、3依次代表具有序列表SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:4、SEQ IDNO :6中氨基酸序列的各突 變蛋白SAM-1、SAM-2和SAM-3 ；4代表由突變基因sedm編碼的突變蛋白SEC2M)。圖3為本發(fā)明中各腸毒素C2突變蛋白純品的超抗原活性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖(橫坐 標(biāo)為劑量梯度，縱坐標(biāo)為增值指數(shù))。圖4為本發(fā)明中各腸毒素C2突變蛋白純品的體外抑制Hepal-6腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)能 力的檢測(cè)結(jié)果圖(其中縱坐標(biāo)為抑瘤率；橫坐標(biāo)為各突變蛋白的劑量梯度)。圖5為本發(fā)明中各腸毒素C2突變蛋白純品的小鼠體內(nèi)抑制S180細(xì)胞生長(zhǎng)能力的 檢測(cè)結(jié)果圖(其中縱坐標(biāo)為抑瘤率；橫坐標(biāo)為各突變蛋白的劑量梯度)。圖6為本發(fā)明中各腸毒素C2突變蛋白純品的家兔致熱活性檢測(cè)結(jié)果圖(其中縱 坐標(biāo)為溫度上升值；橫坐標(biāo)為各突變蛋白的作用時(shí)間)。圖7為突變蛋白SAM-I的三維結(jié)構(gòu)示意圖；圖8為突變蛋白SAM-2的三維結(jié)構(gòu)示意圖；圖9為突變蛋白SAM-3的三維結(jié)構(gòu)示意圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1具有序列表SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO 5中堿基序列的具有藥用前 景的腸毒素C2超抗原突變蛋白基因序列；具有序列表SEQ IDNO 7中堿基序列的sedrn突 變基因序列；具有序列表SEQ ID NO 2, SEQ IDNO :4、SEQ ID NO :6氨基酸序列的具有藥用 前景的腸毒素C2超抗原突變蛋白序列(參見(jiàn)序列表)具有序列表SEQ ID NO=I堿基序列的一種具有藥用前景的腸毒素C2超抗原突變 蛋白基因001gagagtcaaccagaccctacgccagatgagttgcacaaatcaagtgagtt
051tactggtttgatggaaaatatgaaatatttatatgatgatcattatgtat
101cagcaactaaagttatgtctgtagataaatttttggcacatgatttaatt
151gtgataaaaa3. C 3.3.3.3.3.3. tatgacaaagtgaaaacaga
201gttattaaatgaagatttagcaaagaagtacaaagatgaagtagttgatg
251tgtatggatcgtaaactgctatttttcatccaaagataat
301gtaggtaaagttacaggtggtaaaacttgtatgtatggaggaataacaaa
351agctgaaggaaaccactttgataatgggaacttacaaaatgtacttataa
401gagtttatgaaaataaaagaaacacaatttcttttgaagtgcaaactgat
451aagaaaagtgtaacagctcaagaactagacataaaagctaggaatttttt
501￡1￡Ι ￡1￡Ι ￡1￡1￡1aaaaatttgtatgagtttaacagttcaccatatgaaacag
551gatatataaaatttattgaaaataacggcaatactttttggtatgatatg
601atgcctgcaccaggcgataagtttgaccaatctaaatatttaatgatgta
651caacgacaataaaacggttgattctaaaagtgtgaagatagaagtccacc
701￡1C ￡1 ￡1C ￡1 ￡1 ￡1gaatgga
SEQID NO. 1的信息(參見(jiàn)序列表)
(a)序列特征
*長(zhǎng)度717堿基對(duì)
*類型核酸
*鏈型雙鏈
*拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
(b)分子類型:cDNA
(C)假設(shè)否
(d)反義否
(e)最初來(lái)源金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)
具有序列表SEQ ID NO :3堿基序列的一種具有藥用前景的腸毒素C2蛋白基因
001gagagtcaaccagaccctacgccagatgagttgcacaaatcaagtgagtt
051tactggtttgatggaaaatatgaaatatttatatgatgatcattatgtat
101cagcaactaaagttatgtctgtagataaatttttggcacatgatttaatt
151gtgataaaaa3. C 3.3.3.3.3.3. tatgacaaagtgaaaacaga
201gttattaaatgaagatttagcaaagaagtacaaagatgaagtagttgatg
251tgtatggatcgtaaactgctatttttcatccaaagataat
301gtaggtaaagttacaggtggtaaaacttgtatgtatggaggaataacaaa
351acatgaaggaaacgcctttgataatgggaacttacaaaatgtacttataa
401gagtttatgaaaataaaagaaacacaatttcttttgaagtgcaaactgat
451aagaaaagtgtaacagctcaagaactagacataaaagctaggaatttttt
501aaaaatttgtatgagtttaacagttcaccatatgaaacag
551gatatataaaatttattgaaaataacggcaatactttttggtatgatatg
601atgcctgcaccaggcgataagtttgaccaatctaaatatttaatgatgta
651caacgacaataaaacggttgattctaaaagtgtgaagatagaagtccacc
701 3. C 3.3. C 3.3.3.gaatgga
SEQID NO. 3的信息(參見(jiàn)序列表)
(a)序列特征
*長(zhǎng)度717堿基對(duì)
*類型核酸
*鏈型雙鏈
*拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
(b)分子類型:cDNA
(C)假設(shè)否
(d)反義否
(e)最初來(lái)源金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)
具有序列表SEQ ID NO :5堿基序列的一種具有藥用前景的腸毒素C2蛋白基因
001gagagtcaaccagaccctacgccagatgagttgcacaaatcaagtgagtt
051tactggtttgatggaaaatatgaaatatttatatgatgatcattatgtat
101cagcaactaaagttatgtctgtagataaatttttggcacatgatttaatt
151 ￡Ι ￡1￡10￡Ι ￡1gtgataaaaa3. C 3.3.3.3.3.3. tatgacaaagtgaaaacaga
201gttattaaatgaagatttagcaaagaagtacaaagatgaagtagttgatg
251tgtatggatcgtaaactgctatttttcatccaaagataat
301gtaggtaaagttacaggtggtaaaacttgtatgtatggaggaataacaaa
351agctgaaggaaacgcctttgataatgggaacttacaaaatgtacttataa
401gagtttatgaaaataaaagaaacacaatttcttttgaagtgcaaactgat
451aagaaaagtgtaacagctcaagaactagacataaaagctaggaatttttt
501￡1￡Ι ￡1￡Ι ￡1￡1￡1aaaaatttgtatgagtttaacagttcaccatatgaaacag
551gatatataaaatttattgaaaataacggcaatactttttggtatgatatg
601atgcctgcaccaggcgataagtttgaccaatctaaatatttaatgatgta
651caacgacaataaaacggttgattctaaaagtgtgaagatagaagtccacc
701￡1C ￡1 ￡1C ￡1 ￡1 ￡1gaatgga
SEQID NO. 5的信息(參見(jiàn)序列表)
(a)序列特征
*長(zhǎng)度717堿基對(duì)
*類型核酸
*鏈型雙鏈
*拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
(b)分子類型:cDNA
(C)假設(shè)否
(d)反義否
(e)最初來(lái)源金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)
具有序列表SEQ ID NO 7堿基序列的secaii突變基因
001gagagtcaaccagaccctacgccagatgagttgcacaaatcaagtgagtt
051tactggtttgatggaaaatatgaaatatttatatgatgatcattatgtat
101cagcaactaaagttatgtctgtagataaatttttggcacatgatttaatt
151gtgataaaaa3. C 3.3.3.3.3.3. tatgacaaagtgaaaacaga201gttattaaatgaagatttagcaaagaagtacaaagatgaagtagttgatg251tgtatggatcgtaaactgctatttttcatccaaagataat301gtaggtaaagttacaggtggtaaaacttgtatgtatggaggaataacaaa351acatgaaggaaaccactttgataatgggaacttacaaaatgtacttataa401gagtttatgaaaataaaagaaacacaatttcttttgaagtgcaaactgat451aagaaaagtgtaacagctcaagaactagacataaaagctaggaatttttt501aattaataaaaaaaatttgtatgagtttaacagttcaccatatgaaacag551gatatataaaatttattgaaaataacggcaatactttttggtatgatatg601atgcctgcaccaggcgataagtttgaccaatctaaatatttaatgatgta651caacgacaataaaacggttgattctaaaagtgtgaagatagaagtccacc701ttacaacaaagaatggaSEQID NO. 7的信息(參見(jiàn)序列表)
(a)序列特征
*長(zhǎng)度717堿基對(duì)
*類型核酸
*鏈型雙鏈
*拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
(b)分子類型:cDNA
(c)假設(shè)否
(d)反義否
(e)最初來(lái)源金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)
具有序列表SEQ ID NO :2氨基酸序列的一種具有藥用前景的腸毒素C2超抗原突變蛋白序列001 esqpdptpde lhksseftgl menmkylydd hyvsatkvms051 ynisdkklkn ydkvktelln edlakkykde vvdvygsnyy101 vgkvtggktc myggitkaeg nhfdngnlqn vlirvyenkr151 kksvtaqeld ikarnflink knlyefnssp yetgyikfie201 mpapgdkfdq skylmmyndn ktvdsksvki evhlttkngSEQ ID NO. 2的信息(參見(jiàn)序列表)(a)序列特征*長(zhǎng)度239個(gè)氨基酸*類型肽鏈*鏈型單鏈(b)分子類型成熟肽鏈(C)假設(shè)否(d)反義否(e)最初來(lái)源金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus)具有序列表SEQ ID NO 4氨基酸序列的一種具有藥用前景的腸毒素C2超抗原突 變蛋白序列0154]001 esqpdptpde lhksseftgl menmkylydd hyvsatkvms vdkflahdli
0155]051 ynisdkklkn ydkvktelln edlakkykde vvdvygsnyy vncyfsskdn
0156]101 vgkvtggktc myggitkheg nafdngnlqn vlirvyenkr ntisfevqtd
0157]151 kksvtaqeld ikarnflink knlyefnssp yetgyikfie nngntfwydm
0158]201 mpapgdkfdq skylmmyndn ktvdsksvki evhlttkng
0159]SEQ ID NO. 4的信息(參見(jiàn)序列表)
0160](a)序列特征
0161]*長(zhǎng)度239個(gè)氨基酸
0162]*類型肽鏈
0163]*鏈型單鏈
0164](b)分子類型成熟肽鏈
0165](C)假設(shè)否
0166](d)反義否
0167](e)最初來(lái)源金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus)
0168]具有序列表SEQ ID NO 6氨基酸序列的一種具有藥用前景的腸毒素C2超抗原突 變蛋白序列
0169]001 esqpdptpde lhksseftgl menmkylydd hyvsatkvms vdkflahdli
0170]051 ynisdkklkn ydkvktelln edlakkykde vvdvygsnyy vncyfsskdn
0171]101 vgkvtggktc myggitkaeg nafdngnlqn vlirvyenkr ntisfevqtd
0172]151 kksvtaqeld ikarnflink knlyefnssp yetgyikfie nngntfwydm
0173]201 mpapgdkfdq skylmmyndn ktvdsksvki evhlttkng
0174]SEQ ID NO. 6的信息(參見(jiàn)序列表)
0175](a)序列特征:
0176]*長(zhǎng)度239個(gè)氨基酸
0177]*類型肽鏈
0178]*鏈型單鏈
0179](b)分子類型成熟肽鏈
0180](C)假設(shè)否
0181](d)反義否
0182](e)最初來(lái)源金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus)
0183]實(shí)施例2
0184]具有藥用前景的腸毒素C2超抗原突變蛋白的制備方法
0185]①金黃色葡萄球菌基因組DNA的提取
0186]接種金黃色葡萄球菌單菌落于5ml液體LB培養(yǎng)基中，37°C搖床過(guò)夜培養(yǎng)，取1. 5ml 的培養(yǎng)物離心收集菌體。提取金黃色葡萄球菌基因組DNA (基因組DNA提取操作按F.奧斯 伯，R.布倫特，R.E.金斯頓，D.D.穆?tīng)?，J.G.塞德曼，J.A.史密斯，K.斯特拉爾《精編分子 生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》美國(guó)紐約John Wiley & Sons出版社1995年第三版P39-40)。②PCR引物設(shè)計(jì)及反應(yīng)條件分別設(shè)計(jì)合成PCR引物序列如下
sec2-F :5，-CGG AAT TCG AGA GTC AAC CAG A—3，sec2-R 5' -TCG CTC GAG TTA TCC ATT CTT TGT TG-3’F-Mutant, 5' -GTT TAC TGG TTT GAT GGA AAA TAT GAA ΑΤΑ T-3，R-Mutant :5，-TAT TTT CCA TCA AAC CAG TAA ACT CAC TTG-3，Pl :5，-GGA ATA ACA AAA GCT GAA GGA AAC CAC—3，P2 :5’ -GGT TTC CTT CAG CTT TTG TTA TTC C-3’P3 5' -GGA AAC GCC TTT GAT AAT GGG AAC-3'P4 :5，-CCA TTA TCA AAG GCG TTT CCT TC-3，所有引物均由invitrogen生物技術(shù)公司合成。以金黃色葡萄球菌基因組DNA為模板，采用特異性PCR引物sec2-F和sec2-R擴(kuò) 增出SEC2全基因sec2 ；在此基礎(chǔ)上，以SEC2全基因sec2為模板，采用引物對(duì)sec2_F :5，-CGG AAT TCG AGA GTC AAC CAG A-3'禾口 R-Mutant 5' -TAT TTT CCA TCAAAC CAG TAA ACT CAC TTG-3'； F-Mutant, 5' -GTT TAC TGG TTT GAT GGA AAATAT GAA ΑΤΑ T-3’ 和 sec2_R :5’ -TCG CTC GAG TTA TCC ATT CTT TGT TG-3’分別擴(kuò)增獲得突變位點(diǎn)左側(cè)和右側(cè)的重疊PCR產(chǎn)物，然后 以sec2-F和sec2-R為引物，采用上述獲得突變位點(diǎn)左側(cè)和右側(cè)的重疊PCR產(chǎn)物為模板進(jìn) 行PCR擴(kuò)增擴(kuò)得具有序列表SEQ ID NO 7中堿基序列sec^ii突變基因；以具有序列表SEQ ID NO :7中堿基序列secaii基因?yàn)槟０?，采用引物?duì)sec2-F 5' -CGG AAT TCG AGA GTC AAC CAG AUPW -GGA ATAACA AAA GCT GAA GGA AAC CAC-3’ ；P2 :5’ -GGT TTC CTT CAG CTT TTGTTA TTC C-3’ 和 sec2_R :5’ -TCG CTC GAG TTA TCC ATT CTT TGT TG-3，分別擴(kuò)增獲得突變位點(diǎn)左側(cè)和右側(cè)的重疊PCR產(chǎn)物，然后以sec2-F 和sec2-R為引物，采用上述獲得突變位點(diǎn)左側(cè)和右側(cè)的重疊PCR產(chǎn)物為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增 擴(kuò)得具有序列表SEQ ID NO 1中堿基序列sam-Ι突變基因；以具有序列表SEQ ID NO :7中堿基序列secaii基因?yàn)槟０澹捎靡飳?duì)sec2-F 5，-CGG AAT TCG AGA GTC AAC CAG A-3，和 P3 5'-GGA AACGCC TTT GAT AAT GGG AAC-3，; P4 5'-CCA TTA TCA AAG GCG TTT CCTTC-3，和 sec2_R 5'-TCG CTC GAG TTA TCC ATT CTT TGT TG-3’分別擴(kuò)增獲得突變位點(diǎn)左側(cè)和右側(cè)的重疊PCR產(chǎn)物，然后以sec2-F和sec2-R為 引物，采用上述獲得突變位點(diǎn)左側(cè)和右側(cè)的重疊PCR產(chǎn)物為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增擴(kuò)得具有序 列表SEQ ID NO 3中堿基序列sam-2突變基因；以具有序列表SEQ ID NO 1中堿基序列sam-Ι基因?yàn)槟０?，采用引物?duì)seC2_F 5，-CGG AAT TCG AGA GTC AAC CAG A-3，和 P3 5'-GGA AACGCC TTT GAT AAT GGG AAC-3，; P4 5'-CCA TTA TCA AAG GCG TTT CCTTC-3，和 sec2_R 5'-TCG CTC GAG TTA TCC ATT CTT TGT TG-3’分別擴(kuò)增獲得突變位點(diǎn)左側(cè)和右側(cè)的重疊PCR產(chǎn)物，然后以sec2-F和sec2-R為 引物，采用上述獲得突變位點(diǎn)左側(cè)和右側(cè)的重疊PCR產(chǎn)物為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增擴(kuò)得具有序 列表SEQ ID NO 3中堿基序列sam-3突變基因；各基因片斷的PCR反應(yīng)體系均為10XPfu DNA聚合酶反應(yīng)緩沖液10 μ 1、dNTP 8uL、上下游引物各20pmol、模板金黃色葡萄球菌基因組DNA 50ng、Pfu DNA聚合酶2U，無(wú)菌 超純水補(bǔ)齊體積至100 μ 1。各基因片斷的PCR反應(yīng)條件均為
第一階段95°C，5分鐘；第二階段94°C，30 秒；55°C，30 秒；72°C，90 秒；共 30 個(gè)循環(huán)；第三階段72 °C，10分鐘；③各腸毒素C2突變蛋白基因的鑒定各片斷PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1. 2%瓊脂糖凝膠電 泳分析并分離(參見(jiàn)圖1)，分別切下大小為717bp的基因片段，按博大泰克生物技術(shù)公司膠 回收試劑盒使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行膠回收；具有藥用前景的腸毒素C2超抗原突變蛋白的表達(dá)1)具有藥用前景的腸毒素C2超抗原突變蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建以上Sam-l，Sam-2 和sam-3的PCR回收產(chǎn)物分別經(jīng)EcoRI、XhoI雙酶切，再行膠回收，以T4 DNA連接酶分別 連接入經(jīng)同樣雙酶切的ρΕΤ48ει表達(dá)載體，構(gòu)建成表達(dá)載體pET-^a-sam-l-SEQ ID NO=U pET-28a-sam-2-SEQ IDNO :3、pET-28a-sam-3_SEQ ID NO :5，轉(zhuǎn)化 Ε· coli BL21(DE3)感受 態(tài)細(xì)胞(轉(zhuǎn)化操作按F.奧斯伯，R.布倫特，R.E.金斯頓，D.D.穆?tīng)?，J.G.塞德曼，J.A.史 密斯，K.斯特拉爾《精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》美國(guó)紐約John Wiley& Sons出版社1995年 第三版P39-40)，篩選陽(yáng)性克隆并以Sanger雙脫氧末端終止法測(cè)定DNA序列(DNA測(cè)序由上 海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成)。2)具有藥用前景的腸毒素C2超抗原突變蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)和純化分別接種轉(zhuǎn) 化了各表達(dá)載體質(zhì)粒的BL21(DE3)單菌落于含50、g/ml卡那霉素的液體LB培養(yǎng)基中， 過(guò)夜活化培養(yǎng)，以(V/V)接種量轉(zhuǎn)接下一級(jí)，37°C搖床培養(yǎng)至0D_為0. 5，加入終濃度 l.Ommol/L的IPTG (購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)，30°C誘導(dǎo)表達(dá)4小時(shí)。分別離心收集菌體，并將各收集的菌體重懸于1/5體積的平衡緩沖液(IOmM Tirs-HCl, 0. 5M NaCl, 20mM咪唑，pH7. 9)，分別采用Ni親和層析柱對(duì)各目的產(chǎn)物進(jìn)行純化， 即獲得具有序列表SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO 6中氨基酸序列的具有藥用前 景的腸毒素C2超抗原突變蛋白；純化時(shí)以0. 5ml/min速度上樣于預(yù)先平衡好的Ni親和層析柱；以含40mM咪唑 的平衡緩沖液洗滌10個(gè)柱體積，洗去非特異性結(jié)合的雜蛋白；最后以洗脫緩沖液(20mM Tirs-HCl，0. 5M NaCl,250mM咪唑，pH7. 9)洗脫下目的產(chǎn)物，并對(duì)洗脫產(chǎn)物經(jīng)透析法除鹽濃 縮。通過(guò)SDS-PAGE電泳鑒定蛋白大小及純度(參見(jiàn)圖2，如圖所示，大腸桿菌BL21(DE3)重 組表達(dá)菌株經(jīng)過(guò)IPTG誘導(dǎo)，并經(jīng)M-親和層析柱純化后，獲得了高純度的突變蛋白，能夠滿 足進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)需要)。同樣方法利用secaii基因制備SEC2M蛋白，作為突變前參照。實(shí)施例3超抗原活性檢測(cè)取SPF級(jí)純系小鼠Balb/c，通過(guò)頸椎處死后在無(wú)菌條件下取其脾臟，輕輕壓碎后 過(guò)200目篩網(wǎng)。然后將過(guò)篩網(wǎng)后的細(xì)胞懸液在lOOOrpm/min轉(zhuǎn)速下離心5min收集細(xì)胞沉 淀，用5mL紅細(xì)胞裂解液重懸細(xì)胞，靜置5min后于lOOOrpm/min離心5min。再以不含血清 的1640培養(yǎng)基(購(gòu)自Gibco公司)清洗細(xì)胞1-2次，最后用含10%小牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)液(購(gòu)自Gibco公司)調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度，以8X105cells/孔加到96孔板中。分別將經(jīng)純 化的各突變蛋白以10ng/ml、100ng/ml、1000ng/ml、10000ng/ml的終濃度加入各孔。以BSA 作為陰性對(duì)照，SEC2標(biāo)準(zhǔn)品作為陽(yáng)性對(duì)照，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)7 后，加入25ul/孔的MTT液(購(gòu)自Sigma公司)。繼續(xù)培養(yǎng)4h，1500r/min離心5分鐘后棄上清培養(yǎng)液，收 集細(xì)胞，加入濃度為120ul/well的二甲基亞砜溶液(DMSO)，溶解15min后，通過(guò)酶標(biāo)儀以測(cè) 定波長(zhǎng)570nm、參比波長(zhǎng)630nm條件下測(cè)吸光值。最后以增殖指數(shù)(Proliferation Index, PI)表示增值能力，PI =實(shí)驗(yàn)組吸光值/陰性對(duì)照組吸光值(參見(jiàn)圖3，各突變蛋白在不同 濃度范圍均能夠有效地刺激小鼠T細(xì)胞增殖)。實(shí)施例4SEC2突變蛋白的抗腫瘤活性檢測(cè)將小鼠肝癌細(xì)胞H印al-6傳代培養(yǎng)后用胰蛋白酶-EDTA消化液消化，用含10% FBS的1640培養(yǎng)基稀釋成濃度為5X IO5ceIlsAiL的單細(xì)胞懸液，然后以2. 5X IO4Cells/ 孔培養(yǎng)在96孔板。將按實(shí)施例3中方法分離獲得的小鼠脾淋巴細(xì)胞以5X 105cells/well 加入到上述含有H印al-6細(xì)胞的96孔板中，使效靶比達(dá)到20 1。然后將純化的系列超 抗原突變蛋白分別以10、100、1000、10000ng/mL的終濃度加入各孔。以BSA作為陰性對(duì)照， SEC2野生蛋白作為陽(yáng)性對(duì)照，并設(shè)腫瘤細(xì)胞對(duì)照孔、淋巴細(xì)胞自然釋放孔、空白對(duì)照孔及調(diào) 零孔，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔，按常規(guī)條件培養(yǎng)72h，加入20ul/Well的MTT液。繼續(xù)培養(yǎng)4h， 1000r/min離心收集細(xì)胞，加入DMS0120ul/well，溶解15min后，酶標(biāo)儀上以570nm測(cè)定各 孔的吸光值。腫瘤抑制瘤計(jì)算公式如下100-[(蛋白實(shí)驗(yàn)孔吸光值-淋巴細(xì)胞自然釋放孔 吸光值)/ (腫瘤細(xì)胞對(duì)照孔吸光值-空白對(duì)照孔吸光值)]X 100 % (參見(jiàn)圖4，各突變蛋白 均對(duì)!fepal-6細(xì)胞具有一定體外抑制能力)。實(shí)施例5SEC2突變蛋白的小鼠體內(nèi)實(shí)體瘤抑制活性檢測(cè)6-8周齡的雌性BALB/C小鼠購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，購(gòu)進(jìn)后適應(yīng)性 飼養(yǎng)觀察一天，排除體重差距大、質(zhì)量不合格動(dòng)物。實(shí)驗(yàn)第0天，各組小鼠腋下無(wú)菌接種由 生理鹽水稀釋的S180肉瘤小鼠腹水液0. 2ml (約合瘤細(xì)胞5 X IO6個(gè)/ml)。接種后按體重 隨機(jī)分為9組，每組8只。在實(shí)驗(yàn)第1、4、7天，對(duì)所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物尾靜脈注射給藥0. 5ml/只， 各組給藥種類和劑量分別為空白對(duì)照生理鹽水組N. S、SEC2組5 μ g/只、SEC2組15 μ g/ 只、SAM-I 組 5 μ g/ 只、SAM-I 組 15 μ g/ 只、SAM-2 組 5 μ g/ 只、SAM-2 組 15 μ g/ 只、SAM-3 組5 μ g/只、SAM-3組15 μ g/只。實(shí)驗(yàn)第10天將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處死解剖剝離腫瘤并稱重，計(jì)算 抑瘤率。抑瘤率=(空白對(duì)照組瘤重-給藥組瘤重)/空白對(duì)照組瘤重X 100%(參見(jiàn)圖5，各突變蛋白均對(duì)BALB/C小鼠體內(nèi)的S180實(shí)體瘤具有一定體內(nèi)抑制能 力，說(shuō)明本發(fā)明中的突變蛋白有望進(jìn)一步開(kāi)發(fā)成為臨床抗腫瘤藥物和免疫調(diào)節(jié)藥物。)實(shí)施例6SEC2突變蛋白的致熱活性分析以健康大白兔(體重約2. 0-2. 5kg)作為熱源活性試驗(yàn)?zāi)Ｐ?。試?yàn)前每只兔子體 溫連續(xù)保持穩(wěn)定90分鐘，且起始體溫不超過(guò)38. 6 to 39. 5°C的個(gè)體方可用于進(jìn)一步的試 驗(yàn)。將純化獲得的各腸毒素C2突變蛋白分別經(jīng)0. 22 μ m微孔濾膜過(guò)濾除菌后，用無(wú)菌PBS 溶液稀釋至10 μ g/ml,以10 μ g/kg的劑量通過(guò)耳緣靜脈進(jìn)行注射。通過(guò)熱源試驗(yàn)測(cè)定儀 觀察每組兔子直腸溫度在4小時(shí)以內(nèi)的變化情況，并計(jì)算溫度變化差異(Δ Temperature)。 以野生SEC2及無(wú)菌PBS緩沖液分別作為陽(yáng)性和陰性對(duì)照，每組測(cè)試3只兔子。(參見(jiàn)圖6，本發(fā)明中的突變蛋白的致熱毒性較野生型和突變前下降明顯，更具有臨床藥用應(yīng)用前景。)實(shí)施例7SEC2突變蛋白的體內(nèi)催吐活性分析以健康幼貓(8-10周，約500g)作為催吐活性試驗(yàn)?zāi)Ｐ汀⒓兓@得的腸毒素突 變蛋白分別經(jīng)0. 22 μ m微孔濾膜過(guò)濾除菌后，用無(wú)菌PBS溶液稀釋至相同濃度，然后以每只 貓2mg的劑量進(jìn)行腹腔注射，連續(xù)觀察6小時(shí)，并記錄其出現(xiàn)的催吐及腹瀉反應(yīng)情況(參見(jiàn) 表1)。如表1所示，本發(fā)明中突變蛋白的催吐活性和腹瀉活性較野生型和突變前下降明顯， 更具有臨床藥用應(yīng)用前景。表1.幼貓腹腔注射不同SEC2突變體蛋白催吐活性比較
權(quán)利要求
1.腸毒素C2超抗原突變蛋白，其特征在于其為減毒腸毒素C2超抗原突變蛋白，所述 減毒腸毒素C2超抗原突變蛋白具有序列表SEQ ID N0:2、SEQ ID NO :4或SEQ ID NO :6中氨基酸序列。
2.—種權(quán)利要求1所述腸毒素C2超抗原突變蛋白的編碼基因，其特征在于所述減毒 腸毒素C2超抗原突變編碼蛋白，SEQ ID N0:2、SEQ ID NO :4或SEQ ID NO :6編碼基因分 別具有序列表SEQ ID NO =USEQ ID NO 3或SEQID NO 5中堿基序列。
3.—種權(quán)利要求1所述腸毒素C2超抗原突變蛋白的制備方法，其特征在于1)以金黃色葡萄球菌基因組DNA為模板，采用特異性PCR引物Sec2-F:5’-CGGAAT TCG AGA GTC AAC CAG A-3，和 sec2_R :5，-TCG CTC GAG TTATCC ATT CTT TGT TG-3，擴(kuò)增 出SEC2全基因sec2 ；在此基礎(chǔ)上，以SEC2全基因sec2為模板，采用引物對(duì)sec2-F:5’-CGG AAT TCG AGA GTC AAC CAG A-3'禾口 R-Mutant :5‘ -TAT TTT CCA TCAAAC CAG TAA ACT CAC TTG-3'； F-Mutant, 5' -GTT TAC TGG TTT GAT GGA AAATAT GAA ΑΤΑ T-3’ 和 sec2_R :5’ -TCG CTC GAG TTA TCC ATT CTT TGT TG-3’分別擴(kuò)增獲得突變位點(diǎn)左側(cè)和右側(cè)的重疊PCR產(chǎn)物，然后 以sec2-F和sec2-R為引物，采用上述獲得突變位點(diǎn)左側(cè)和右側(cè)的重疊PCR產(chǎn)物為模板進(jìn) 行PCR擴(kuò)增擴(kuò)得具有序列表SEQ ID NO 7中堿基序列sec^ii突變基因；2)以具有序列表SEQID N0:7中堿基序列的DNA片段sec2m為模板，采用引物對(duì) sec2-F 5' -CGG AAT TCG AGA GTC AAC CAG A—3’ 禾口 Pl :5’ -GGA ATA ACA AAA GCT GAA GGA AAC CAC-3’ ；P2 :5’ -GGT TTC CTT CAGCTT TTG TTA TTC C-3’ 和 sec2_R :5’ -TCG CTC GAG TTA TCC ATT CTT TGTTG-3’分別擴(kuò)增獲得突變位點(diǎn)左側(cè)和右側(cè)的重疊PCR產(chǎn)物，然后 以sec2-F和sec2-R為引物，采用上述獲得突變位點(diǎn)左側(cè)和右側(cè)的重疊PCR產(chǎn)物為模板進(jìn) 行PCR擴(kuò)增擴(kuò)得具有序列表SEQ ID NO 1中堿基序列sam-Ι突變基因；3)以具有序列表SEQID N0:7中堿基序列的DNA片段sec2m為模板，采用引物對(duì) sec2-F 5'-CGG AAT TCG AGA GTC AAC CAG A-3，和P3 5'-GGA AAC GCC TTT GAT AAT GGG AAC-3，；P4 5' -CCA TTA TCA AAG GCGTTT CCT TC-3，禾口 sec2_R :5，-TCG CTC GAG TTA TCC ATT CTT TGT TG-3’分別擴(kuò)增獲得突變位點(diǎn)左側(cè)和右側(cè)的重疊PCR產(chǎn)物，然后以sec2-F和 sec2-R為引物，采用上述獲得突變位點(diǎn)左側(cè)和右側(cè)的重疊PCR產(chǎn)物為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增擴(kuò) 得具有序列表SEQ ID NO 3中堿基序列sam-2突變基因；4)以具有序列表SEQID N0:1中堿基序列的DNA片段sam-Ι為模板，采用引物對(duì) sec2-F 5'-CGG AAT TCG AGA GTC AAC CAG A-3，和P3 5'-GGA AAC GCC TTT GAT MT GGG AAC-3，；P4 5' -CCA TTA TCA AAG GCGTTT CCT TC-3，禾口 sec2_R :5，-TCG CTC GAG TTA TCC ATT CTT TGT TG-3’分別擴(kuò)增獲得突變位點(diǎn)左側(cè)和右側(cè)的重疊PCR產(chǎn)物，然后以sec2-F和 sec2-R為引物，采用上述獲得突變位點(diǎn)左側(cè)和右側(cè)的重疊PCR產(chǎn)物為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增擴(kuò) 得具有序列表SEQ ID NO 3中堿基序列sam-3突變基因；5)將以上突變基因sam-1、sam-2、sam-3分別克隆入表達(dá)載體pET18a，并轉(zhuǎn)化大腸桿 菌BL21 (DE3)，構(gòu)建成異源表達(dá)各腸毒素C2突變蛋白的基因工程菌，經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)并純化制 得相應(yīng)腸毒素C2超抗原突變蛋白。
4.一種權(quán)利要求1所述腸毒素C2超抗原突變蛋白的應(yīng)用，其特征在于具有序列表 SEQ ID NO :2、SEQ ID NO 4或SEQ ID NO 6中氨基酸序列的具有藥用前景的腸毒素C2超抗原突變蛋白可作為抗腫瘤或免疫調(diào)節(jié)類的前體藥物的活性成份。
全文摘要
本發(fā)明涉及腸毒素C2超抗原突變蛋白和編碼基因及其制備和應(yīng)用。所述的腸毒素C2超抗原突變蛋白SAM-1，SAM-2和SAM-3分別具有序列表SEQID NO2、SEQ ID NO4和SEQ ID NO6中氨基酸序列；制備過(guò)程以具有序列表SEQ ID NO7中堿基序列的DNA片段為模板進(jìn)行重疊PCR擴(kuò)增，然后以sec2-F和sec2-R為引物，采用上述的重疊PCR產(chǎn)物為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到突變基因，將其克隆入表達(dá)載體pET-28a，以大腸桿菌BL21(DE3)為宿主菌，構(gòu)建成異源表達(dá)各腸毒素C2突變蛋白的基因工程菌，經(jīng)誘導(dǎo)后異源表達(dá)得各腸毒素C2超抗原突變蛋白。本發(fā)明突變蛋白在保持較高超抗原活性和腫瘤抑制活性的基礎(chǔ)上，其催吐和致熱活性較野生型腸毒素C2蛋白有顯著的降低，具有較好的臨床藥用前景。
文檔編號(hào)A61P35/00GK102060916SQ201010275279
公開(kāi)日2011年5月18日 申請(qǐng)日期2010年9月8日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月8日
發(fā)明者劉昌孝, 張惠文, 徐明愷, 李洪義, 王小剛, 蔡永明, 陳艷 申請(qǐng)人:沈陽(yáng)協(xié)合生物制藥股份有限公司