專利名稱：紫金砂及其提取物的新用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種植物提取物的用途，特別是涉及一種紫金砂及其提取物在制備用于治療或緩解以心肌缺血再灌注損傷為主的心肌缺血性疾病的新用途。
背景技術(shù)：
紫金砂來源于傘形科植物當(dāng)歸屬植物白根獨活(Angelica polymorpha Maxim)的根，具有溫中散寒，理氣止痛的作用。主要含有香豆素、色原酮、揮發(fā)油等成分。既往實驗證實紫金砂具有良好的抑制胃腸平滑肌痙攣、鎮(zhèn)痛、抗?jié)儭⒈Ｗo胃黏膜等作用。以心肌梗死、·冠狀動脈狹窄為代表的缺血性心肌病是現(xiàn)今主要致死原因之一，據(jù)世界衛(wèi)生組織報告，到2020年急性冠脈閉塞將會成為世界上的主要死因。通過溶栓、經(jīng)皮冠狀動脈成形術(shù)或搭橋術(shù)使缺血區(qū)早期再灌是缺血心肌存活的必要前提。然而，再灌注被認(rèn)為是雙刃劍，會導(dǎo)致比單純?nèi)毖鼮閲?yán)重的損傷，即所謂的缺血再灌注損傷。因此，尋找對心肌缺血再灌注損傷具明確治療作用藥物，是今后心血管治療藥物領(lǐng)域研究重點。目前，尚未發(fā)現(xiàn)紫金砂及其提取物應(yīng)用于心肌缺血及心肌缺血再灌注的專利申請及文獻(xiàn)報道。發(fā)明人研究發(fā)現(xiàn)紫金砂提取物預(yù)先給藥后，可顯著緩解和抑制心肌缺血再灌注損傷，可以用于治療以心肌缺血再灌注損傷為代表的心肌缺血性疾病。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種治療或緩解心肌缺血性疾病的藥物。本發(fā)明人通過實驗證實，一定劑量的紫金砂提取物預(yù)先口服給藥后，對心肌缺血再灌注損傷具有確切治療效果，可以用于心肌梗塞等缺血性心肌病的治療。為此，本發(fā)明提供一種紫金砂及其提取物在制備用于治療心肌缺血性疾病的產(chǎn)品和/或藥物中的用途。其中所述的心肌缺血性疾病為心肌梗死、缺血再灌注損傷、再狹窄、冠狀動脈心臟病、各種原因引發(fā)的冠狀動脈狹窄及痙攣。優(yōu)選地，所述的心肌缺血性疾病為心肌缺血再灌注損傷。所述的心肌缺血再灌注損傷，系指缺血心肌在恢復(fù)血液灌流后，出現(xiàn)心肌結(jié)構(gòu)破壞及功能障礙反而加重的現(xiàn)象。能夠引發(fā)心肌缺血再灌注損傷的疾病主要包括心肌梗死、冠狀動脈心臟病、各種原因引發(fā)的冠狀動脈狹窄及痙攣等。本發(fā)明所述的紫金砂及其提取物中含有香豆素類和色原酮類成分，優(yōu)選地，所述香豆素類成分為選自水合氧化前胡素內(nèi)酯、栓翅芹烯醇、異歐前胡素、奧斯索、佛手柑內(nèi)酯、歐前胡素、二氫歐山芹素、異虎耳草素、氧化前胡素乙基醚中的一種或多種，所述色原酮類成分為3’ R_(+)_亥茅酚、3’ -O-乙酰基亥茅酚、拐芹色原酮、ledebouriellol的一種或多種。其中所述的香豆素類、色原酮類成分含量總和占總提取物的重量百分比為10-90%，優(yōu)選的重量百分比為20-80%，進一步優(yōu)選的重量百分為25-78%，更優(yōu)選的重量百分比26.3-78%，特別優(yōu)選的重量百分比為29.4%,26.3%,33.5%,59.38%,78%,38.61%。上述水合氧化前胡素內(nèi)酯、栓翅芹烯醇、3’(R)-+-亥茅酚、3’ -O-乙酰基亥茅酚、異歐前胡素五種主要成分的總含量占總提取物的重量百分比為0.5-40%，優(yōu)選的重量百分比為5-35%，進一步優(yōu)選的重量百分比為10-30%，更優(yōu)選的重量百分比為10.25-29.4%,特別優(yōu)選的重量百分比為 11.65%U0.25%U4.82%,21.98%,29.4%U4.17%。優(yōu)選地，水合氧化前胡素內(nèi)酯、栓翅芹烯醇、3’(R)-+-亥茅酚、3’ -O-乙?；ッ┓?、異歐前胡素五種主要成分在紫金砂總提取物中的重量百分比含量分別為5-25%、
0.5-2%,0.2-1.2%,0.2-1.2%,1.2-3.5%，優(yōu)選的重量百分比含量分別為 7.37-23.9%,
0.63-1.8%,0.31-1.06%,0.33-0.98%,1.54-3.29%。本發(fā)明所述的紫金砂提取物，其制備方法可以用溶劑提取法、溶劑萃取法、醇沉法、柱色譜法、大孔吸附樹脂法、液-液逆流分配色譜法或CO2超臨界萃取法等方法中的任意一種，或者是這些方法的任意組合。優(yōu)選的柱色譜為硅膠G柱色譜、大孔樹脂柱色譜，優(yōu)選的大孔樹脂為AB-8大孔樹脂。 在一個優(yōu)選的實施例中，本發(fā)明所述的溶劑提取法可包括以下步驟，I)將紫金砂藥材粉碎；2)用合適的溶劑提取1-5次，優(yōu)選提取2-3次，優(yōu)選的溶劑是乙醇、甲醇、丙酮、丙醇、異丙醇、乙醇水溶液或甲醇的水溶液等，提取方式可以是加熱回流、微波提取、超聲提取、冷浸提取等方式；3)合并提取液，濃縮至干，獲得紫金砂提取物，優(yōu)選的濃縮方式為減壓濃縮。在一個優(yōu)選的實施例中，上述溶劑提取法獲得的提取物還可用大孔吸附樹脂進一步提取，具體地包括以下步驟:4)將步驟3)中獲得的紫金砂提取物在水中分散，再用合適的溶劑萃取1-6次，優(yōu)選提取2-5次，進一步優(yōu)選提取3次，分別合并萃取液后，濃縮至干；5)將步驟4)中獲得的紫金砂粗提物加入水，超聲分散，再加入合適的溶劑萃取1-6次，優(yōu)選提取2-5次，進一步優(yōu)選提取3次，將水層蒸干，加入乙醇，優(yōu)選加入5-20%的乙醇水溶液，進一步優(yōu)選加入8-15%的乙醇水溶液，特別優(yōu)選加入10%的乙醇水溶液，溶散，然后上大孔樹脂柱，樹脂柱徑高比為1: 8 1: 12，優(yōu)選的樹脂柱徑高比為1: 9 I: 11，更優(yōu)選的樹脂柱徑高比為1: 10，上樣后用6-10倍BV (床容積，bed volume, BV)的乙醇洗去雜質(zhì)，優(yōu)選用6-10倍BV的5-20%的乙醇水溶液，進一步優(yōu)選用6-10倍BV的8-15 %的乙醇水溶液，特別優(yōu)選用8倍BV的10 %的乙醇水溶液；再用8-12倍BV的70-90 %乙醇洗脫，優(yōu)選用10倍BV的85%乙醇洗脫，收集后者洗脫部分，濃縮至干，得到紫金砂提取物，其中優(yōu)選的溶劑為石油醚，優(yōu)選的濃縮方式為減壓濃縮，優(yōu)選的大孔樹脂為AB-8大孔樹脂。在另一個具體的實施例中，本發(fā)明所述的溶劑提取法獲得的提取物還可用柱色譜法進一步提取，具體地包括以下步驟:4)將步驟3)中獲得的紫金砂提取物用純乙醇溶散均勻后，以硅膠G拌樣，上硅膠G柱，樹脂柱徑高比1: 6 1: 10，優(yōu)選的樹脂柱徑高比為1: 9 1: 11，更優(yōu)選的樹脂柱徑高比1: 8，上樣后用合適的有機溶劑洗脫1-3次，優(yōu)選地用石油醚洗脫I次后，再用乙酸乙酯/丙酮(I: I)洗脫，收集乙酸乙酯/丙酮(I: I)洗脫液，減壓濃縮至干，得到洗脫物。在一個優(yōu)選的實施例中，本發(fā)明所述的CO2超臨界萃取法包括以下步驟:1)將紫金砂藥材粉碎；2)在萃取溫度40-50°C、萃取壓力30-40MPa時超臨界萃取2_5小時，優(yōu)選在萃取溫度45°C、萃取壓力35MPa時萃取3小時，優(yōu)選的超臨界萃取裝置為HA121-50-01超臨界萃取裝置，優(yōu)選以無水乙醇作夾帶劑；3)將萃取物減壓蒸干，得到超臨界萃取提取物，優(yōu)選將萃取物于40°C減壓蒸干。根據(jù)需要，本發(fā)明的紫金砂及其提取物可以和一種或多種藥學(xué)上可接受的載體制成藥物組合物。優(yōu)選的藥物載體包括藥學(xué)領(lǐng)域常規(guī)的稀釋劑、填充劑、粘合劑、濕潤劑、吸收促進劑、表面活性劑、吸附載體、潤滑劑、香味劑、甜味劑。任選地，該藥物組合物還可以包含其他活性物質(zhì)，優(yōu)選的其他活性物質(zhì)為延胡素生物堿提取物或DL-四氫巴馬汀。所述的藥物組合物可以制成片劑、膠囊、粉劑、顆粒、錠劑、栓劑，或口服液等多種藥物形式。上述不同劑型的藥物均可以按照藥學(xué)領(lǐng)域的常規(guī)方法制備。發(fā)明的有益效果本發(fā)明提供了紫金砂及其提取物在用于治療心肌缺血性疾病的用途。在大鼠及兔上的藥效學(xué)試驗結(jié)果表明，紫金 砂提取物在缺血前預(yù)防給藥，連續(xù)7天，可有效降低心肌梗死面積，顯著提升機體抗氧化能力，有效減少脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物的產(chǎn)生，其作用與公認(rèn)陽性治療藥物復(fù)方丹參滴丸基本相當(dāng)，表明紫金砂及其提取物在治療心肌缺血再灌注損傷上具良好應(yīng)用前景。
具體實施例方式下面將結(jié)合實施例對本發(fā)明的實施方案進行詳細(xì)描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解，下列實施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。實施例1紫金砂提取物I的制備取紫金砂藥材500g粉碎后，用80%乙醇加熱回流提取2次，每次提取2小時，溶劑用量為4000ml，合并提取液，減壓濃縮至干，得乙醇提取物96g。稱取乙醇提取物適量，用紫外可見分光光度測得總香豆素類、色原酮類成分含量總和為29.4%。用高效液相法測得水合氧化前胡素內(nèi)酯、栓翅芹烯醇、3’(R)-+-亥茅酚、3’ -O-乙酰基亥茅酚、異歐前胡素含量分別為 8.24%,0.68%,0.41%,0.43%,1.89%。實施例2紫金砂提取物2的制備取紫金砂藥材50g粉碎后，用甲醇超聲提取3次，每次提取0.5小時，溶劑用量為400ml，合并提取液，減壓濃縮至干，得甲醇提取物4.2g。稱取甲醇提取物適量，用紫外可見分光光度測得香豆素類、色原酮類成分含量總和為26.3%。用高效液相法測得水合氧化前胡素內(nèi)酯、栓翅芹烯醇、3’(R)-+-亥茅酚、3’ -O-乙酰基亥茅酚、異歐前胡素含量分別為
7.37%,0.63%,0.31%,0.33%、1.61%。實施例3紫金砂提取物3的制備取紫金砂藥材IOOg粉碎后，用丙酮冷浸提取2次，每次提取24小時，溶劑用量為IOOOml，合并提取液，減壓濃縮至干，得丙酮提取物9.2g。稱取丙酮提取物適量，用紫外可見分光光度測得香豆素類、色原酮類成分含量總和為33.5%。用高效液相法測得水合氧化前胡素內(nèi)酯、栓翅芹烯醇、3’(R)-+-亥茅酚、3’ -O-乙?；ッ┓?、異歐前胡素含量分別為
9.73%、1.04%,0.86%,0.88%,2.31%。實施例4紫金砂提取物4的制備取紫金砂藥材IOOg粉碎后，選用HA121-50-01超臨界萃取裝置，以200ml無水乙醇作夾帶劑，在萃取溫度45°C、萃取壓力35MPa時提取3小時。將萃取物于40°C減壓蒸干，得到超臨界萃取提取物5.2g。稱取提取物適量，用紫外可見分光光度測得香豆素類、色原酮類成分含量總和為59.38%。用高效液相法測得水合氧化前胡素內(nèi)酯、栓翅芹烯醇、3，(R)-+-亥茅酚、3’ -O-乙酰基亥茅酚、異歐前胡素含量分別為15.37%、1.28%、1.06%,
0.98%,3.29%。實施例5紫金砂提取物5的制備取實施例1的乙醇提取物25g在50ml水中分散，再用150ml石油醚萃取三次，分別合并萃取液后，減壓濃縮至干。稱取紫金砂粗提物10g，加入15ml水超聲分散，再加入50ml石油醚萃取3次，將水層蒸干，加入10%乙醇溶散，然后上AB-8大孔樹脂柱，樹脂柱徑高比I: 10，上樣后用8倍BV的10%乙醇洗去雜質(zhì)，再用10倍BV的85%乙醇洗脫，收集后者洗脫部分，減壓濃縮至干，得到紫金砂提取物。測定香豆素類、色原酮類成分含量總和為78%;水合氧化前胡素內(nèi)酯、栓翅芹烯醇、3’ R_(+)_亥茅酚、3’ -O-乙酰基亥茅酚、異歐前胡素含量(重量％ )分別為 23.9%U.8%,0.8%,0.6%,2.3%0實施例6紫金砂提取物6的制備取實施例1的乙醇提取物IOg用純乙醇溶散均勻后以15g硅膠G拌樣，上60g硅膠G柱，樹脂柱徑高比1: 8 ，上樣后先用300ml石油醚洗脫，再用500ml的乙酸乙酯/丙酮(I: I)洗脫，分別收集這兩部分洗脫液，減壓濃縮至干，得到石油醚洗脫物0.56g、乙酸乙酯/丙酮(I: I)洗脫物0.85g。稱取乙酸乙酯/丙酮(I: I)洗脫物適量，用紫外可見分光光度測定香豆素類、色原酮類成分含量總和為38.61 %。用高效液相法測定水合氧化前胡素內(nèi)酯、栓翅芹烯醇、3’(R)-+-亥茅酚、3’ -O-乙酰基亥茅酚、異歐前胡素的含量含量分別為 10.31%, 1.14%,0.68%,0.50%, 1.54%。本發(fā)明所述的紫金砂提取物的質(zhì)量控制方法可包括以下含量測定方法中的一種或兩種:1.香豆素類、色原酮類成分總含量測定(紫外分光光度法)對照品溶液的配制:精密稱取水合氧化前胡素內(nèi)酯對照品3.0mg,置于IOml量瓶中，加甲醇使其完全溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液。標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備:精密吸取對照品溶液2.5ml至25ml容量瓶中，定容。分別吸取
2.0,3.0,4.0,5.0,6.0,6.7ml，用甲醇稀釋定容到IOml量瓶中，搖勻，在307nm波長處測定吸光度。以水合氧化前胡素內(nèi)酯對照品濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。供試品溶液的配置:取紫金砂提取物適量，加甲醇溶解定容至25ml量瓶中，搖勻。精密吸取1ml，加甲醇定容至IOml量瓶中，搖勻。測定法:取供試品溶液在307nm波長處測定吸光度，按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計算樣品中香豆素、色原酮類成分總含量，即得。2.水合氧化前胡素內(nèi)酯、栓翅芹烯醇、3’ (R)-+-亥茅酚、3’ -O-乙?；ッ┓?、異歐前胡素含量測定(高效液相色譜法)色譜條件:色譜柱:用十八烷基鍵合硅膠為填充劑；流動相:甲醇-水；流速:
1.0ml/mim ;柱溫:室溫。洗脫條件如表I所示。
權(quán)利要求
1.紫金砂及其提取物在制備用于治療心肌缺血性疾病的產(chǎn)品和/或藥物中的用途。
2.權(quán)利要求1的用途，其中所述的心肌缺血性疾病為心肌梗死、缺血再灌注損傷、再狹窄、冠狀動脈心臟病、各種原因引發(fā)的冠狀動脈狹窄及痙攣； 優(yōu)選地，所述的心肌缺血性疾病為心肌缺血再灌注損傷。
3.權(quán)利要求1或2的用途，其中所述提取物中含有香豆素類和色原酮類成分， 優(yōu)選地，所述香豆素類成分為選自水合氧化前胡素內(nèi)酯、栓翅芹烯醇、異歐前胡素、奧斯索、佛手柑內(nèi)酯、歐前胡素、二氫歐山芹素、異虎耳草素、氧化前胡素乙基醚中的一種或多種，所述色原酮類成分為3’ R_(+)_亥茅酚、3’ -O-乙酰基亥茅酚、拐芹色原酮、Iedebouriellol 的一種或多種。
4.權(quán)利要求3的用途，其中所述的香豆素類、色原酮類成分含量總和占總提取物的重量百分比為10-90%，優(yōu)選的重量百分比為20-80%，進一步優(yōu)選的重量百分為25-78%，更優(yōu)選的重量百分比26.3-78 %，特別優(yōu)選的重量百分比為29.4%、26.3%、33.5%、59.38%,78%,38.61%。
5.權(quán)利要求3的用途，其中所述的水合氧化前胡素內(nèi)酯、栓翅芹烯醇、3’(R)-+-亥茅酚、3’ -O-乙酰基亥茅酚、異歐前胡素五種主要成分的總含量占總提取物的重量百分比為0.5-40%，優(yōu)選的重量百分比為5-35%，進一步優(yōu)選的重量百分比為10-30%，更優(yōu)選的重量百分比為10.25-29.4 %，特別優(yōu)選的重量百分比為11.65 %、10.25 %、14.82 %、21.98%,29.4%,14.17% ； 優(yōu)選地，水合氧化前胡素內(nèi)酯、栓翅芹烯醇、3’(R)-+-亥茅酚、3’ -O-乙?；ッ┓印悮W前胡素五種主要成分在紫金砂總提取物中的重量百分比含量分別為5-25%、0.5-2%,0.2-1.2%,0.2-1.2%,1.2-3.5%，優(yōu)選的重量百分比含量分別為 7.37-23.9%,0.63-1.8%,0.31-1.06%,0.33-0.98%,1.54-3.29%。
6.權(quán)利要求1-5任一項的用途，其中所述的提取物，其制備方法為溶劑提取法、溶劑萃取法、醇層法、柱色譜法、大孔吸附樹脂法、液-液逆流分配色譜法或CO2超臨界萃取法等方法中的任意一種,或這些方法的任意組合； 優(yōu)選的柱色譜為硅膠G柱色譜、大孔樹脂柱色譜，優(yōu)選的大孔樹脂為AB-8大孔樹脂。
7.權(quán)利要求1-5任一項的用途，其中所述的提取物，其制備方法包括以下步驟，I)將紫金砂藥材粉碎；2)用合適的溶劑提取1-5次，優(yōu)選提取2-3次，優(yōu)選的溶劑是乙醇、甲醇、丙酮、丙醇、異丙醇、乙醇水溶液或甲醇的水溶液等，提取方式可以是加熱回流、微波提取、超聲提取、冷浸提取等方式；3)合并提取液，濃縮至干，獲得紫金砂提取物，優(yōu)選的濃縮方式為減壓濃縮； 任選地，該方法還包括以下步驟: 4)將步驟3)中獲得的紫金砂提取物在水中分散，再用合適的溶劑萃取1-6次，優(yōu)選提取2-5次，進一步優(yōu)選提取3次，分別合并萃取液后，濃縮至干； 5)將步驟4)中獲得的紫金砂粗提物加入水，超聲分散，再加入合適的溶劑萃取1-6次，優(yōu)選提取2-5次，進一步優(yōu)選提取3次，將水層蒸干，加入乙醇，優(yōu)選加入5-20%的乙醇水溶液，進一步優(yōu)選加入8-15%的乙醇水溶液，特別優(yōu)選加入10%的乙醇水溶液，溶散，然后上大孔樹脂柱，樹脂柱徑高比為1: 8 1: 12，優(yōu)選的樹脂柱徑高比為1: 9 1: 11，更優(yōu)選的樹脂柱徑高比為1: 10，上樣后用6-10倍BV(床容積，bed volume，BV)的乙醇洗去雜質(zhì)，優(yōu)選用6-10倍BV的5-20%的乙醇水溶液，進一步優(yōu)選用6-10倍BV的8-15%的乙醇水溶液，特別優(yōu)選用8倍BV的10%的乙醇水溶液；再用8-12倍BV的70-90%乙醇洗脫，優(yōu)選用10倍BV的85%乙醇洗脫，收集后者洗脫部分，濃縮至干，得到紫金砂提取物。
其中優(yōu)選的溶劑為石油醚，優(yōu)選的濃縮方式為減壓濃縮，優(yōu)選的大孔樹脂為AB-8大孔樹脂； 或者，任選地，該方法還包括以下步驟: 4)將步驟3)中獲得的紫金砂提取物用純乙醇溶散均勻后，以硅膠G拌樣，上硅膠G柱，樹脂柱徑高比1: 6 1: 10，優(yōu)選的樹脂柱徑高比為1: 9 1: 11，更優(yōu)選的樹脂柱徑高比1: 8，上樣后用合適的有機溶劑洗脫1-3次，優(yōu)選地用石油醚洗脫I次后，再用乙酸乙酯/丙酮(I: I)洗脫，收集乙酸乙酯/丙酮(I: I)洗脫液，減壓濃縮至干，得到洗脫物。
8.權(quán)利要求6的用途，其中所述的CO2超臨界萃取法包括以下步驟:1)將紫金砂藥材粉碎；2)在萃取溫度40-50°C、萃取壓力30-40MPa時超臨界萃取2_5小時，優(yōu)選在萃取溫度45°C、萃取壓力35MPa時萃取3小時，優(yōu)選的超臨界萃取裝置為HA121-50-01超臨界萃取裝置，優(yōu)選以無水乙醇作夾帶劑；3)將萃取物減壓蒸干，得到超臨界萃取提取物，優(yōu)選將萃取物于40°C減壓蒸干。
9.權(quán)利要求1-5任一項的用途，其中所述的藥物含有紫金砂及其提取物，和一種或多種藥學(xué)上可接受的載體，優(yōu)選的載體包括:稀釋劑、填充劑、粘合劑、濕潤劑、吸收促進劑、表面活性劑、吸附載體、潤滑劑、香味劑、甜味劑； 任選地，其中所述的藥物還包含其他活性物質(zhì)， 優(yōu)選的其他活性物質(zhì)為延胡素生物堿提取物或DL-四氫巴馬汀。
10.權(quán)利要求9的用途，其中所述的藥物為片劑、膠囊、粉劑、顆粒、錠劑、栓劑，或口服液。
全文摘要
本發(fā)明公開了紫金砂提取物的新用途。發(fā)明人通過實驗證實，不同劑量紫金砂提取物口服預(yù)先給藥后，可有效阻止或緩解心肌缺血再灌注所導(dǎo)致的心肌損傷。
文檔編號A61K36/232GK103156893SQ201110408540
公開日2013年6月19日 申請日期2011年12月9日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月9日
發(fā)明者王永安, 于能江, 楊郁, 李萬華, 駱媛, 關(guān)雷, 劉艷芹 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所