專利名稱：一種細菌傳遞的非注射型dna疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程和疫苗學(xué)領(lǐng)域，具體的說是ー種細菌傳遞的非注射型DNA疫苗。
背景技術(shù)：
DNA疫苗也稱為核酸疫苗或基因疫苗。這種疫苗是將編碼病原的某種抗原基因克隆于ー個真核表達載體，由此獲得重組表達質(zhì)粒，即DNA疫苗。DNA疫苗注射到所要免疫的動物體內(nèi)后，其攜帯的抗原基因即可在動物體內(nèi)表達，由此產(chǎn)生的抗原即可誘發(fā)機體的免疫反應(yīng)，使得受免動物獲得特定的免疫保護。DNA疫苗的優(yōu)點是安全，并且免疫效應(yīng)較好，因此是ー種具良好發(fā)展?jié)摿Φ囊呙缧问?。然而，由于DNA疫苗的導(dǎo)入方式通常是注射，因此在 應(yīng)用上具有注射型疫苗的所有局限。如何既保持DNA疫苗的優(yōu)點又克服其注射應(yīng)用的缺點是ー個需要解決的問題。遲緩愛德華氏菌(Edwardsiellatarda)和海豚鏈球菌(Streptococcus iniae)是重要的水產(chǎn)養(yǎng)殖病原菌。這兩種細菌皆能感染多種海水和淡水魚類，包括我國重要的經(jīng)濟品種牙鲆和大菱鲆，從而給養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟損失。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種細菌傳遞的非注射型DNA疫苗。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為一種細菌傳遞的非注射型DNA疫苗，以遲緩愛德華氏菌減毒株TX5RM作為傳遞載體，傳遞海豚鏈球菌DNA疫苗pCNSilO菌株的細菌傳遞的非注射型DNA疫苗。所述細菌傳遞的非注射型DNA疫苗為將海豚鏈球菌DNA疫苗pCNSilO菌株轉(zhuǎn)化入遲緩愛德華氏菌減毒株TX5RM中，得DNA疫苗菌株TX5Si。所述DNA疫苗菌株TX5Si可作為制備遲緩愛德華氏菌和/或海豚鏈球菌的DNA疫苗。本發(fā)明具有如下優(yōu)點I.制備簡単。本發(fā)明的疫苗只需簡單的常規(guī)細菌培養(yǎng)，無需任何提取、純化過程。2.非注射型應(yīng)用。本發(fā)明的疫苗具有減毒疫苗和DNA疫苗的共同優(yōu)點，可以通過浸泡和ロ服方法導(dǎo)入，從而避免了常規(guī)的注射型DNA疫苗的缺點。3.交叉保護效應(yīng)。本發(fā)明疫苗能夠同時保護魚類抵抗遲緩愛德華氏菌和海豚鏈球菌感染。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進ー步說明。實施例g在對本發(fā)明進行舉例描述，而非以任何形式對本發(fā)明進行限制。實施例I
非注射型DNA疫苗的構(gòu)建
步驟I)海豚鏈球菌DNA疫苗pCNSilO的構(gòu)建以質(zhì)粒pACYC184(購于北京NewEngland Biolabs公司)為模板，采用F1/R1為引物進行PCR擴增，PCR條件為94°C 60s預(yù)變性模板 DNA，然后 94°C 40s, 55 °C 60s, 72 °C 60s，5 個循環(huán)后改為 94°C 40s, 63 °C 60s，72°C 60s, 25個循環(huán)后再在72°C延伸反應(yīng)IOmin。PCR產(chǎn)物用“天根生化科技(北京)有限公司” DNA產(chǎn)物純化試劑盒純化。PCR產(chǎn)物純化后與載體pBS-T (購于“天根生化科技(北京)有限公司”)于室溫連接4-6小時，連接混合液轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5ci，在含有氨芐青霉素(100ug/ml)的LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)，篩選轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒，即為質(zhì)粒pBSSi。將質(zhì)粒pBSSi和質(zhì)粒 pSialO (pSialO 構(gòu)建見參考文獻 Cheng S, Hu Y, Jiao X, Sun L. Identification andimmunoprotective analysis of a Streptococcus iniae subunit vaccine candidate.Vaccine 2010 ；28 :2636-41)用限制性內(nèi)切酶BamHI酶切，分別回收O. 9kb和6kb片段，將這ニ片段用T4DNA連接酶連接，連接液轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5a，在含有氨芐青霉素(IOOug/ml)的LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)，篩選轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒，即為質(zhì)粒pCNSilO。所述LB組成成分按重量百分比計1.0%蛋白胨，O. 5%酵母粉，1.0%氯化鈉，97. 5%蒸懼水；所述弓丨物為Fl : 5 ’ -ATGGATCCAGGAGGGACAGCTGATA-3，和 Ri : 5 ’ -GGATCCGAATGCACCAATAACTGCCT-3，。步驟2) TX5Si疫苗菌株的構(gòu)建將質(zhì)粒pCNSi 10按照Hanahan方法(Sambrook andRussell Molecular し丄oning A Laboratory Mannual. Cold Spring Harbor LaboratoryPress 2001)轉(zhuǎn)化入遲緩愛德華氏菌減毒株TX5RM(TX5RM具體見參考文獻Sun Y, Liu C，SunL. Isolation andanalysis of the vaccine potential of an attenua ted Edwardsiellatarda strain. Vaccine 2010 ；28 :6344-50)，得菌株TX5S i，即為對遲緩愛德華氏菌和/或海豚鏈球菌有保護作用的非注射型DNA疫苗菌株。實施例3TX5Si疫苗的應(yīng)用步驟I)疫苗海藻酸鈉微球飼料和對照海藻酸鈉微球飼料的制備在LB培養(yǎng)基中于28°C培養(yǎng)DNA疫苗菌株TX5Si至OD6tltl為0.8-1，然后離心(5000g，4°C ) lOmin。收集菌體，將其懸浮于海水中至終濃度為lxl09cfu/ml，即為DNA疫苗菌株TX5Si懸浮液。將50ml海藻酸鈉(3%)與30mlDNA疫苗菌株TX5Si懸浮液或PBS (對照)混合，隨后加入2000ml石蠟、10ml S-80乳化劑(皆購于美國Sigma公司)以及50ml氯化鈣(0. 15M)(購于“Sangon生物工程(上海)有限公司”)；將含有DNA疫苗菌株TX5Si和PBS対照的混合液分別離心(lOOOg, IOmin)，收集沉淀；將含有DNA疫苗菌株TX5Si和PBS的沉淀分別與IOOOg魚飼料(購于“山東升索漁用飼料研究中心”)混合，用F(II)-26雙螺桿擠條制粒機(華南理工大學(xué)，廣州)加工制成顆粒飼料(I. 5mmX 2. 0mm)，即為疫苗海藻酸鈉微球飼料和對照海藻酸鈉微球飼料。步驟2)疫苗浸泡液的制備將疫苗菌株TX5Si在LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至0D_為
0.8-1，而后將培養(yǎng)液離心(5000g，4°C，IOmin)，收集菌體，將其懸浮于海水中至終濃度為lxl07cfu/ml,即為疫苗浸泡液。步驟3)疫苗的導(dǎo)入將100條牙鲆(每條重約12. 4g)隨機分為4組，每組25條。將這4組分別命名為A、B、C和D。將A和C組(樣品組)的每條魚喂食上述步驟I)的疫苗海藻酸鈉微球飼料，持續(xù)3天；將B和D組(對照組)的每條魚喂食上述步驟I)的對照海藻酸鈉微球飼料，持續(xù)3天。隨后將A和C組魚(樣品組)在上述步驟2)的疫苗浸泡液中浸泡8小時，將B和D組魚(對照組)在普通海水中浸泡8小時。步驟4)遲緩愛德華氏菌和海豚鏈球菌懸液的制備在LB培養(yǎng)基中分別培養(yǎng)遲緩愛德華氏菌TXl和海豚鏈球菌G26至OD6tltl為O. 9，然后離心(5000g，4°C，IOmin)，收集菌體。將遲緩愛德華氏菌菌體懸浮于海水中至終濃度為lxl08cfU/ml，即為遲緩愛德華氏菌懸液；將海豚鏈球菌菌體懸浮于海水中至終濃度為2xl08cfu/ml，即為海豚鏈球菌懸液。所述菌株TXl保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心CGMCC，保藏編號為CGMCC No. 2330，分類命名為遲緩愛德華氏菌( Edwardsiella tarda)，保藏時間2008年I月9日。所述菌株G26保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心CGMCC，保藏編號為CGMCC No. 1984，分類命名為海豚鏈球菌(Streptococcus iniae)，保藏時間2007年3月22日。步驟5)疫苗的免疫保護效應(yīng)檢測在步驟3)免疫后的第30天，將A和B組魚在上述步驟4)的遲緩愛德華氏菌懸液中浸泡2h，將C和D組魚腹腔注射上述步驟4)的海豚鏈球菌懸液(IOOul/每條魚)。在以后的20天中，每天觀察并記錄各組魚的死亡情況。20天后，統(tǒng)計各組魚的總死亡數(shù)目A組，4條；B組，18條；C組，3條；D組，20條。利用下列公式計算相對免疫保護效率(RPS)RPS = 100x(l-免疫組魚的總死亡百分比/對照組魚的總死亡百分比)故TX5Si針對遲緩愛德華氏菌和海豚鏈球菌的相對免疫保護效率分別為78%和85%。由此得出TX5Si通過非注射免疫可誘發(fā)對遲緩愛德華氏菌和海豚鏈球菌的良好的免疫保護效應(yīng)。
權(quán)利要求
1.一種細菌傳遞的非注射型DNA疫苗，其特征在于以遲緩愛德華氏菌減毒株TX5RM作為傳遞載體，傳遞海豚鏈球菌DNA疫苗pCNSilO菌株的細菌傳遞的非注射型DNA疫苗。
2.按權(quán)利要求I所述的細菌傳遞的非注射型DNA疫苗，其特征在于所述細菌傳遞的非注射型DNA疫苗為將海豚鏈球菌DNA疫苗pCNSilO菌株轉(zhuǎn)化入遲緩愛德華氏菌減毒株TX5RM中，得DNA疫苗菌株TX5Si。
3.按權(quán)利要求I所述的非注射型DNA疫苗，其特征在于所述DNA疫苗菌株TX5Si可作為制備遲緩愛德華氏菌和/或海豚鏈球菌的DNA疫苗。
全文摘要
本發(fā)明涉及基因工程和疫苗學(xué)領(lǐng)域，具體的說是一種細菌傳遞的非注射型DNA疫苗的構(gòu)建和應(yīng)用方法。其構(gòu)建方法為利用一種遲緩愛德華氏菌減毒株為載體傳遞一種海豚鏈球菌DNA疫苗，由此獲得細菌傳遞的DNA疫苗TX5Si。TX5Si通過口服和浸泡途徑免疫魚類即可誘發(fā)針對遲緩愛德華氏菌和海豚鏈球菌的免疫保護效應(yīng)。該發(fā)明的非注射型DNA疫苗為解決DNA疫苗的注射應(yīng)用問題提供了一種可行方法。
文檔編號A61K48/00GK102698288SQ201210165259
公開日2012年10月3日 申請日期2012年5月25日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月25日
發(fā)明者孫云, 孫黎, 胡永華 申請人:中國科學(xué)院海洋研究所