專(zhuān)利名稱(chēng)：兩親性三嵌段聚合物及其制備方法和siRNA藥物載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種基于聚羥基脂肪酸酯的兩親性三嵌段聚合物及其制備方法和SiRNA藥物載體，屬于生命醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
RNA干擾是一種由21-23個(gè)核苷酸組成的雙鏈小分子干擾RNA(siRNA)介導(dǎo)的、序列特異性的、轉(zhuǎn)錄后基因沉默技術(shù)。由于RNA干擾技術(shù)能高效、特異的沉默疾病相關(guān)基因，使其已逐漸被發(fā)展成為新型的治療遺傳性或獲得性疾病包括病毒感染和癌癥等的基因治療手段，到目前為止已經(jīng)開(kāi)展了大量利用siRNA進(jìn)行疾病治療的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床實(shí)驗(yàn)。這其中主要包括針對(duì)乙型和丙型肝炎病毒、艾滋病毒等的病毒實(shí)驗(yàn)，與神經(jīng)退化性疾病相關(guān)的研究以及以表達(dá)端粒酶或表皮生長(zhǎng)因子等基因?yàn)榘谢虻陌┌Y治療。其中以siRNA治療·由視網(wǎng)膜退化引起的老年黃斑病變研究已經(jīng)進(jìn)入臨床三期試驗(yàn)階段。雖然siRNA在體外應(yīng)用研究中及細(xì)胞水平上顯示出良好的沉默效果，但由于其巨大的分子量及自身所攜帶的大量負(fù)電荷使其不能自主穿越細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞發(fā)揮作用，在系統(tǒng)運(yùn)輸時(shí)易引起非特異性的脫靶效應(yīng)和免疫應(yīng)答，同時(shí)還面臨被核酸酶降解等障礙，導(dǎo)致在以治療人類(lèi)疾病為目的的siRNA體內(nèi)系統(tǒng)運(yùn)輸面臨著巨大的挑戰(zhàn)。所以siRNA的轉(zhuǎn)染問(wèn)題成為限制其應(yīng)用的主要瓶頸。如何增強(qiáng)siRNA穿透細(xì)胞膜的能力，提高其在體內(nèi)的穩(wěn)定性和靶向性等都是siRNA藥物載體急需解決的問(wèn)題。因此設(shè)計(jì)和合成安全有效的siRNA藥物載體已成為目前siRNA藥物研發(fā)的重要方向。病毒載體因潛在的安全性問(wèn)題及高成本等缺點(diǎn)使其廣泛的臨床應(yīng)用受到極大的限制。而非病毒的陽(yáng)離子脂質(zhì)和類(lèi)脂及陽(yáng)離子聚合物載體因安全性高、副作用小、生產(chǎn)成本低等特點(diǎn)越來(lái)越受到人們的青睞。已報(bào)道的陽(yáng)離子脂質(zhì)體和類(lèi)脂，如穩(wěn)定的核酸脂肪微滴(SNALP)、Oligofectamine、脂醇、i-FECT 和脂醇 98N12_5(1)，其對(duì) siRNA 的運(yùn)輸效果已得到證實(shí)；陽(yáng)離子聚合物能通過(guò)靜電相互作用與siRNA分子磷酸基團(tuán)所帶的負(fù)電荷結(jié)合形成聚合電解質(zhì)絡(luò)合物，該絡(luò)合物通過(guò)刺激非特異性的細(xì)胞內(nèi)吞將siRNA運(yùn)輸進(jìn)細(xì)胞,然后經(jīng)“質(zhì)子海綿”效應(yīng)介導(dǎo)的內(nèi)涵體逃逸將siRNA分子從運(yùn)輸載體上解離，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)siRNA的運(yùn)輸。傳統(tǒng)方法采用水溶性的陽(yáng)離子聚合物與siRNA分子互混得到兩者的復(fù)合物或納米顆粒，雖然可以實(shí)現(xiàn)對(duì)siRNA的運(yùn)輸目的，但該方法重復(fù)性差，而且工藝難以放大，而兩親性的陽(yáng)離子聚合物能自組裝成穩(wěn)定的納米顆粒，該納米顆粒具有實(shí)體瘤的高通透性和滯留效應(yīng)(EPR 效應(yīng)，Enhanced permeability and retention),可促進(jìn) siRNA 藥物在腫瘤組織的聚集，并能有效的被腫瘤細(xì)胞吸收。目前用于siRNA運(yùn)輸?shù)年?yáng)離子聚合物材料包括聚乙烯亞胺(PEI)、聚左旋賴(lài)氨酸(PLL)、樹(shù)狀分子，殼聚糖等，他們與不同的疏水性材料結(jié)合后，能自組裝形成不同結(jié)構(gòu)的納米顆粒，既可實(shí)現(xiàn)對(duì)siRNA的包裹，也可將siRNA錨定在其表面；對(duì)這些納米顆粒進(jìn)行適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)修飾或配體修飾還可增強(qiáng)siRNA在體內(nèi)的穩(wěn)定性和靶向性。盡管針對(duì)siRNA藥物運(yùn)輸載體的研究取得了一定的突破和發(fā)展，但要使siRNA藥物成功用于治療人類(lèi)疾病，仍有一些關(guān)鍵性問(wèn)題需要解決，如毒性、特異性、靶向性、免疫刺激、轉(zhuǎn)染效率低等。由此，生物相容性好、能快速去質(zhì)子化的可生物降解的兩親性的陽(yáng)離子高分子聚合物載體因能有效結(jié)合和保護(hù)siRNA分子，增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)siRNA分子的吸收，提高其穩(wěn)定性和靶向性，并能使siRNA分子有效釋放，實(shí)現(xiàn)治療目的，而使得這類(lèi)載體在siRNA藥物給藥中具有更好的優(yōu)勢(shì)和應(yīng)用前景。聚羥基脂肪酸酯(PHA)是一種天然的高分子生物材料，分子量多為50，000到20, 000, 000道爾頓，其中的脂肪酸可以是丁酸、戊酸或己酸等；它是由原核生物在碳、氮營(yíng)養(yǎng)失衡的情況下合成，并作為碳源和能源貯存的一類(lèi)熱塑性聚酯，是一類(lèi)β -羥基脂肪酸族聚酯的總稱(chēng)。通過(guò)改變菌種、給料、發(fā)酵過(guò)程可以很方便地改變PHA的組成，PHA的結(jié)構(gòu)變化幾乎是無(wú)限的。另外，不同的單體還可以形成不同的共聚物，這些共聚物包括二元共聚物，如 聚3-羥基丁酸-4-羥基丁酸共聚酯(Ρ3/4ΗΒ)、聚3-羥基丁酸_3_羥基己酸共聚酯(ΡΗΒΗΗχ)，或者三元共聚物如聚3-羥基丁酸-3-羥基戊酸-3-羥基己酸共聚酯(PHBVHHx。同時(shí)單體在共聚物中比例的變化也帶來(lái)共聚物性能的許多變化。其中PHA的親疏水性就與其組分及各組分所占比例有關(guān)。PHA具有良好的生物相容性和生物可降解性，可作為生物醫(yī)用材料和生物可降解包裝材料，因此已成為近年來(lái)生物材料領(lǐng)域最為活躍的研究熱點(diǎn)。在·藥物緩釋體系研究中也因其獨(dú)有的性能而備受青睞，而且該類(lèi)材料已經(jīng)被FDA批準(zhǔn)用作手術(shù)的縫合線(xiàn)。目前已經(jīng)證明商品化生產(chǎn)的PHA產(chǎn)品都具有生物相容性和生物可降解性。理想的非病毒載體應(yīng)該是具有高效、低毒的聚合物。本發(fā)明將這種具有良好的生物相容性和生物可降解性的疏水性聚羥基脂肪酸酯與親水性聚合物和陽(yáng)離子化合物聚合，制備成可自組裝的兩親性聚合物作為siRNA藥物的運(yùn)輸載體，結(jié)合三者的優(yōu)勢(shì)，希望在實(shí)現(xiàn)siRNA藥物有效運(yùn)輸?shù)耐瑫r(shí)，可降低載體本身的毒副作用，并且選用這種可生物降解的材料作為載體，還可實(shí)現(xiàn)siRNA藥物的緩慢釋放，減少給藥劑量，從而達(dá)到長(zhǎng)效治療的目的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一在于提供一種基于聚羥基脂肪酸酯的兩親性三嵌段聚合物。實(shí)現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案如下一種兩親性三嵌段聚合物，其為聚羥基脂肪酸酯、親水性聚合物及陽(yáng)離子化合物共聚形成的聚合物，其結(jié)構(gòu)通式I為[mA-B-C]或[mB-A-C];其中A來(lái)源于聚羥基脂肪酸酯，mA表示聚羥基脂肪酸酯的單甲醚；B來(lái)源于親水性聚合物，mB表示親水性聚合物的單甲醚；C來(lái)源于陽(yáng)離子化合物；所述陽(yáng)離子化合物為陽(yáng)離子肽、陽(yáng)離子酯質(zhì)、陽(yáng)離子聚合物或其組合。本發(fā)明的另一目的是提供一種轉(zhuǎn)染效率高、靶向性強(qiáng)、低毒、安全性好的siRNA藥物運(yùn)輸載體。實(shí)現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案如下一種SiRNA藥物的運(yùn)輸載體，其是活性成分為上述兩親性三嵌段聚合物的帶正電荷的納米顆粒，所述納米顆粒的粒徑可為50_400nm,其表面電荷可為5_60mV。在其中一些實(shí)施例中，“A”或式I的聚羥基脂肪酸酯(PHA)的結(jié)構(gòu)通式如下
權(quán)利要求
1.一種兩親性三嵌段聚合物，其特征是，它為聚羥基脂肪酸酯、親水性聚合物及陽(yáng)離子化合物共聚形成的聚合物，其結(jié)構(gòu)通式I為[mA-B-C]或[mB-A-C]，其中A來(lái)源于聚羥基脂肪酸酯，mA表示聚羥基脂肪酸酯的單甲醚；B來(lái)源于親水性聚合物，mB表示親水性聚合物的單甲醚；C來(lái)源于陽(yáng)離子化合物；所述陽(yáng)離子化合物為陽(yáng)離子肽、陽(yáng)離子酯質(zhì)、或陽(yáng)離子聚合物。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的兩親性三嵌段聚合物，其特征是，所述聚羥基脂肪酸酯的結(jié)構(gòu)通式如下
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的兩親性三嵌段聚合物，其特征是，所述聚羥基脂肪酸酯是聚羥基丁酸酯、聚羥基戊酸酯、聚3-羥基丁酸-3-羥基戊酸共聚酯、聚3-羥基丁酸-4-羥基丁酸酯、聚3-羥基丁酸-3-羥基己酸酯。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的兩親性三嵌段聚合物，其特征是，所述聚羥基脂肪酸酯是聚3-羥基丁酸-4-羥基丁酸酯。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的兩親性三嵌段聚合物，其特征是，所述聚羥基脂肪酸酯的數(shù)均分子量范圍是500至10，000道爾頓。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的兩親性三嵌段聚合物，其特征是，所述聚羥基脂肪酸酯的數(shù)均分子量范圍是500至4000道爾頓。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的兩親性三嵌段聚合物，其特征是，所述陽(yáng)離子肽為賴(lài)氨酸-丙氨酸-亮氨酸-丙氨酸、聚左旋賴(lài)氨酸或魚(yú)精蛋白；所述陽(yáng)離子脂質(zhì)為二油酰磷脂酰乙醇胺、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、膽固醇二油酰卵磷脂或胺乙基胺基甲酰基膽固醇；所述陽(yáng)離子聚合物為聚乙烯亞胺、精胺、亞精胺、二亞乙基三胺、三亞乙基四胺、四亞乙基五胺、五亞乙基六胺或殼聚糖。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的兩親性三嵌段聚合物，其特征是，所述陽(yáng)離子肽是聚左旋賴(lài)氨酸；所述陽(yáng)離子脂質(zhì)是胺乙基胺基甲?；懝檀?；所述陽(yáng)離子聚合物是聚乙烯亞胺。
9.根據(jù)權(quán)利要求I所述的兩親性三嵌段聚合物，其特征是，所述親水性聚合物是聚乙二醇，其具有的數(shù)均分子量是400至8，000道爾頓。
10.一種權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)所述的兩親性三嵌段聚合物的合成方法，其特征是，包括以下步驟以端丙烯基聚羥基脂肪酸酯單甲醚-聚乙二醇為大分子引發(fā)劑或端丙烯基聚乙二醇單甲醚-聚羥基脂肪酸酯為大分子引發(fā)劑，通過(guò)邁克爾加成與陽(yáng)離子化合物的氨基反應(yīng)得到兩親性三嵌段聚合物； 上述陽(yáng)離子化合物為陽(yáng)離子肽、陽(yáng)離子酯質(zhì)、或陽(yáng)離子聚合物。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的合成方法，其特征是，所述端丙烯基聚羥基脂肪酸酯單甲醚-聚乙二醇大分子引發(fā)劑是由端羥基聚羥基脂肪酸酯單甲醚-聚乙二醇在活化劑的作用下，將其末端羥基轉(zhuǎn)變?yōu)楸┗玫?；上述活化劑為能活化羥基的試劑、丙烯酸酯單體或甲基丙烯酸酯單體。
12.根據(jù)權(quán)利要求10所述的合成方法，其特征是，所述端丙烯基聚乙二醇單甲醚-聚羥基脂肪酸酯大分子引發(fā)劑是由端羥基聚乙二醇單甲醚-聚羥基脂肪酸酯在活化劑的作用下，將其末端羥基轉(zhuǎn)變?yōu)楸┗玫?；上述活化劑為能活化羥基的試劑、丙烯酸酯單體或甲基丙烯酸酯單體。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的合成方法，其特征是，所述能活化羥基的試劑為六亞甲基二異氰酸酯、羰基二咪唑、異佛爾酮二異氰酸酯、I-乙基-(3- 二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺、或N，N’ - 二環(huán)己基碳二亞胺；所述丙烯酸酯單體為丙烯酰氯。
14.一種SiRNA藥物運(yùn)輸載體，其特征是，其是活性成分為權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)所述兩親性三嵌段聚合物的帶正電荷的納米顆粒，所述納米顆粒的粒徑為50-400nm,其zeta電勢(shì)為 5-60mV。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的siRNA藥物運(yùn)輸載體，其特征是，所述兩親性三嵌段聚合物為 mP3/4HBQ.5-PEG2-lPEI18 或 IiiPEGc14-PSz^HBc15-IPEIl 8tj
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種兩親性三嵌段聚合物及其制備方法，它為聚羥基脂肪酸酯、親水性聚合物及陽(yáng)離子化合物共聚形成的聚合物，其結(jié)構(gòu)通式I為[mA-B-C]或[mB-A-C]，其中A來(lái)源于聚羥基脂肪酸酯，mA表示聚羥基脂肪酸酯的單甲醚；B來(lái)源于親水性聚合物，mB表示親水性聚合物的單甲醚；C來(lái)源于陽(yáng)離子化合物；所述陽(yáng)離子化合物為陽(yáng)離子肽、陽(yáng)離子酯質(zhì)、陽(yáng)離子聚合物。本發(fā)明還公開(kāi)了一種siRNA藥物運(yùn)輸載體，其是活性成分為上述兩親性三嵌段聚合物的帶正電荷的納米顆粒，所述納米顆粒的粒徑在50-400nm，其zeta電勢(shì)為5-60mV。本發(fā)明所述的聚合物具有生物相容；相對(duì)疏水性；其形成的納米顆粒具有良好的穩(wěn)定性，制備方法簡(jiǎn)單，可重復(fù)性高；原料廉價(jià)，節(jié)約成本等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)A61K48/00GK102786695SQ20121014088
公開(kāi)日2012年11月21日 申請(qǐng)日期2012年5月8日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月8日
發(fā)明者周麗, 張必良 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院