專(zhuān)利名稱(chēng)：一種呼吸道合胞病毒f2蛋白亞單位疫苗及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種呼吸道合胞病毒F2蛋白亞單位疫苗及其制備方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus, RSV)是引起嬰幼兒患毛細(xì)支氣管炎、肺炎、支氣管炎的主要病原體之一，可導(dǎo)致嬰幼兒的死亡。免疫缺陷病人及老年人也是RSV的易感人群。自病毒發(fā)現(xiàn)以來(lái)，雖對(duì)RSV研究取得一定進(jìn)展，但目前只有兩種單抗批準(zhǔn)上市，以治療患病嚴(yán)重的患者。而一種有效、完全安全的RSV疫苗并未問(wèn)世。世界衛(wèi)生組織(WHO)已將RSV疫苗列為全球疫苗發(fā)展計(jì)劃中優(yōu)先發(fā)展的疫苗之一。然而60年代使用的RSV滅活疫苗雖可誘導(dǎo)中和抗體的產(chǎn)生，但疫苗使用后增強(qiáng)了嬰幼兒后繼感染野毒株RSV的發(fā)病程度，甚至引發(fā)死亡。隨后的RSV的減毒活疫苗會(huì)導(dǎo)致上呼吸道的輕微至中度充血，且免疫原形差、遺傳性不穩(wěn)定。目前研制的RSV亞單位疫苗被認(rèn)為是相對(duì)安全的，并不存在毒力返祖與免疫原性低下等問(wèn)題。RSV囊膜上的膜融合(F)和粘附(G)糖蛋白均可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體。但相比較而言，G蛋白傾向于體液免疫，而F 蛋白既可誘發(fā)體液免疫也可以誘發(fā)一定的細(xì)胞免疫，且氨基酸序列相對(duì)保守。所以在SRV 的保護(hù)性抗原中，F(xiàn)蛋白比G蛋白更重要。但目前基于F蛋白相關(guān)的疫苗，難以在原核表達(dá)系統(tǒng)獲得表達(dá)，完全依賴(lài)于細(xì)胞培養(yǎng)獲得。其對(duì)環(huán)境要求較高，且成本昂貴，不利于疫苗的普及。F2肽段是決定RSV感染的宿主細(xì)胞特異性的唯一因素。目前已通過(guò)小鼠模型確定了 2個(gè)位于F2區(qū)的CTL識(shí)別位點(diǎn) AA85-93和AA92-106，其次，AA51-65也是重要的T細(xì)胞識(shí)別表位。本發(fā)明選擇通過(guò)原核表達(dá)系統(tǒng)融合表達(dá)F2蛋白，再通過(guò)酶切獲得純度較高的非融合的F2蛋白。因此，本發(fā)明用F2蛋白免疫機(jī)體，開(kāi)發(fā)一種有效的呼吸道合胞病毒亞單位疫苗。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種呼吸道合胞病毒F2蛋白亞單位疫苗，旨在能刺激機(jī)體產(chǎn)生較好的免疫應(yīng)答，用于人體或動(dòng)物預(yù)防接種，抵抗呼吸道合胞病毒的感染，F(xiàn)2蛋白是由SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列所編碼或具有SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列。本發(fā)明另一目的在于提供一種呼吸道合胞病毒F2蛋白亞單位疫苗的制備方法， 包括如下步驟
(1)重組表達(dá)載體F2/pFN18K的構(gòu)建
以F/pMD18T質(zhì)粒為模板，PCR擴(kuò)增獲得F2基因，并引入Afco I和漢I酶切位點(diǎn)和 6XHis標(biāo)簽，F(xiàn)2基因經(jīng)Afc0 I和I雙酶切后得到帶有粘性末端的目的基因，并與同樣雙酶切過(guò)的大腸桿菌表達(dá)載體PFN18K相連接，形成重組表達(dá)載體F2/pFN18K ；
(2)F2蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及其純化
重組表達(dá)載體F2/pFN18K轉(zhuǎn)化到大腸桿菌表達(dá)菌株中，形成重組工程菌，重組工程菌
3經(jīng)過(guò)發(fā)酵培養(yǎng)，采用鼠李糖誘導(dǎo)表達(dá)Halo-F2融合蛋白；經(jīng)誘導(dǎo)的重組工程菌采用超聲破菌，4°C下2000rpm離心10分鐘后，用梯度透析方法對(duì)Halo-F2融合蛋白復(fù)性，復(fù)性后的蛋白在4°C下，透析至煙草蝕斑病毒蛋白酶(TEV)反應(yīng)液中，每Img Halo-F2融合蛋白加入IOU TEV酶，酶切反應(yīng)他-iai，酶切后的蛋白經(jīng)過(guò)層析純化，得到疫苗蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2 所示。本發(fā)明所述的方法中大腸桿菌表達(dá)載體為質(zhì)粒pFN18K及其衍生質(zhì)粒、以及適用于大腸桿菌系統(tǒng)的含HaloTagI或脫鹵素酶的遺傳修飾衍生物與TEV酶切位點(diǎn)系列的表達(dá)載體，如 pFN6K、pFC14A 等。本發(fā)明所述的方法中大腸桿菌表達(dá)菌株為KRX菌株及其它五cWi K細(xì)胞株。本發(fā)明所述的方法中轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達(dá)菌株的方法為熱休克轉(zhuǎn)化法，電轉(zhuǎn)化法或原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法。本發(fā)明所述的方法中采用金屬離子親和層析純化法或離子交換層析法純化蛋白。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果
在大腸桿菌中原核表達(dá)F2蛋白，可以提高蛋白疫苗的表達(dá)水平，由于大腸桿菌結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、生長(zhǎng)快速、易于培養(yǎng)和發(fā)酵、生產(chǎn)成本低、目的蛋白產(chǎn)量高，這對(duì)于規(guī)?；a(chǎn)及其臨床應(yīng)用具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。


圖1是PCR擴(kuò)增獲得F2基因電泳圖。(1 :DNA Marker 2K plus ；2 :F2目的基因片段)。圖2是重組表達(dá)載體F2/pFN18K雙酶切鑒定電泳圖。(1 :DNA Marker 2K plus ；2 1號(hào)F2/pFN18K質(zhì)粒Afco I和及I雙酶切結(jié)果；3 2號(hào)F2/pFN18K質(zhì)粒Afco I和及I 雙酶切結(jié)果)。圖3是Halo-F2蛋白表達(dá)的SDS-PAGE檢測(cè)圖(1 蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；2 未誘導(dǎo)的 F2/pFN18K/KRX全菌蛋白；3 誘導(dǎo)后的F2/pFN18K/KRX全菌蛋白；4 誘導(dǎo)后的F2/pFN18K/ KRX破菌2000rpm沉淀；5 誘導(dǎo)后的F2/pFN18K/KRX破菌12000rpm沉淀；6 誘導(dǎo)后的F2/ PFN18K/KRX破菌上清)。圖4是Halo-F2蛋白酶切與F2純化的SDS-PAGE檢測(cè)圖(1 蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；2 酶切前的Halo-F2蛋白；3 酶切后的Halo-F2蛋白；4 流穿峰；5 :0. 4mol/L咪唑洗脫峰； 6 :lmol/L咪唑洗脫峰)。圖5是動(dòng)物免疫指標(biāo)分析圖。A是三次免疫后血清中總IgG的變化；B是免疫結(jié)束后檢測(cè)IgGl/IgG2a比值。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，這些實(shí)施例僅用于舉例說(shuō)明本發(fā)明，而不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。實(shí)施例1 F2基因的獲得
擴(kuò)增F/18T/DH5 α菌株(本實(shí)驗(yàn)室保存，含有RSV融合蛋白F的全基因)，然后采用博大泰克公司質(zhì)粒抽提試劑盒提取質(zhì)粒(以下質(zhì)粒抽提均按說(shuō)明書(shū)方法操作)，以此質(zhì)粒為模板，用TIANGEN公司的I1aq DNA聚合酶擴(kuò)增F2基因，引入了 Afco I，BamW I兩個(gè)酶切位點(diǎn)以及 6XHis 標(biāo)簽，采用的引物序列為F2PFNP1: 5，-CCGCCATGGAGGCTTCCAGTCAAAACATCACT GAAGAATTT-3’，F(xiàn)2PFNP2 5 ’ -CGCGGATCCTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCCTTCTGGCTCGATTGTTGGCT G-3，;PCR擴(kuò)增條件為94°C 5min ；94 "C 30s, 50°C 30s，72°C 30s (30個(gè)循環(huán))；72°C 5min ； 回收擴(kuò)增產(chǎn)物，1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，擴(kuò)增得到了大小為^Obp的F2基因(見(jiàn)圖1)。
實(shí)施例2 重組表達(dá)載體F2/pFN18K和重組工程菌F2/pFN18K/KRX的構(gòu)建
采用博大泰克公司的膠回收試劑盒純化F2基因(以下膠回收純化均按說(shuō)明書(shū)方法操作)同時(shí)采用博大泰克公司的小量質(zhì)粒抽提試劑盒抽提PFN18K質(zhì)粒(購(gòu)買(mǎi)于美國(guó)!Iomega 公司)，用Afco I私BamH I (購(gòu)于于TAKARA公司)于37°C雙酶切F2基因與pFN18K質(zhì)粒3 小時(shí)。用膠回收試劑盒回收雙酶切的F2片段與pFN18K片段。取180ng F2片段與90ng PFN18K片段，用0. 5μ 1 Τ4 DNA連接酶(來(lái)源于TAKARA公司，CK5021B)于16°C連接過(guò)夜，連接產(chǎn)物通過(guò)熱休克法轉(zhuǎn)化用CaCl2制備的五coli KRX感受態(tài)細(xì)胞(購(gòu)買(mǎi)于美國(guó)!Iomega 公司)，涂布Kan+-LB平板，37°C培養(yǎng)16小時(shí)，挑取數(shù)個(gè)單菌落接種Kan+-LB培養(yǎng)液，37°C振蕩培養(yǎng)12小時(shí)后抽提質(zhì)粒。用Afco I和I雙酶切重組載體F2/pFN18K (重組質(zhì)粒 700ng ；酶各1 μ 1 ;20 μ 1總體系，置于37°C作用3h)后，可以得到大小為290bp的目的片段(見(jiàn)圖2)。實(shí)施例3 Halo_F2蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)
挑取重組工程菌F2/pFN18K/KRX單菌落接種到Kan+-LB培養(yǎng)液中，37°C震蕩培養(yǎng)過(guò)夜， 第二天按1%分別接種到新鮮Kan+-LB培養(yǎng)液中，37°C震蕩培養(yǎng)至0D600約為0. 8時(shí)，取適當(dāng)樣品后分別加入終濃度為1μ 1/ml鼠李糖(來(lái)源于Sanland-chem International Inc, 102189)，在下誘導(dǎo)表達(dá)過(guò)夜，誘導(dǎo)結(jié)束后取適量樣品進(jìn)行SDS-PAGE鑒定其大小是否正確。Halo-F2蛋白的表觀分子量是13.3KDa (見(jiàn)圖3)，與理論計(jì)算值基本一致，為包涵體與可溶蛋白兩種形式表達(dá)。實(shí)施例4 F2蛋白的純化
誘導(dǎo)表達(dá)的重組菌液經(jīng)過(guò)離心收集菌體，用菌體裂解液(0.3mol/L Tris basic, 0. lmol/L NaCl、pH9. 0)重懸，超聲破菌，4°C下2000rpm沉淀?xiàng)壣锨?，?000rpm沉淀溶于變性緩沖液(0. lmol/L NaCl,0. 3mol/L Tris basic, 8mol/L 尿素，pH9. 0)后，通過(guò)梯度稀釋復(fù)性，復(fù)性Halo_F2蛋白。將復(fù)性的Halo-F2蛋白透析至反應(yīng)液(0. 05mol/L NaH2PO4, 0. 5mol/L NaCl, lmmol/L EDTA, lmmmo 1/L DTT，pH8. 0)，并稀釋 Halo_F2 蛋白濃度為 lmg/L， 向其中加入 ου TEV酶于20°C酶切他-1池。酶切后的蛋白液透析至菌體裂解液中，并濃縮蛋白液至5mg/L。用Bio-Rad 5ml親和層析預(yù)裝柱進(jìn)行親和層析純化，洗滌緩沖液(0. Imol/ L NaCl,0. 3mol/L Tris basic,8mol/L 尿素，0. 4mol/L 咪唑，pH9. 0)洗滌雜蛋白，使用洗脫緩沖液(0. lmol/L NaCl,0. 3mol/L Tris basic,8mol/L 尿素，lmol/L 咪唑，ρΗ9· 0)洗脫目的蛋白，SDS-PAGE檢測(cè)并用軟件BandScan分析，純度為90% (附圖4)。洗脫的目的蛋白F2 透析到PBS溶液中，一 20°C保存?zhèn)溆?。?shí)施例5動(dòng)物的免疫及其免疫原性測(cè)定
取生長(zhǎng)健康的6-8周齡的雌性昆明種小鼠若干，設(shè)置PBS(0. 14mol/L NaCl,2. 7mmol/L KCl, 0. 0lmol/L Na2HPO4,1. 8mmol/L KH2PO4, pH 7. 4)組，F(xiàn)2 蛋白組兩組，每組 5 只。分別在 0，2，4 周免疫小鼠，毎次抗原的使用劑量為50 u g/只，PBS組以200 u 1的無(wú)菌PBS代替。毎次免疫前一 天尾部取血，用以監(jiān)測(cè)血清中IgG的變化趨勢(shì)。第3次免疫一周后摘眼球處死并取血制備血清。 用F2蛋白包板，血清以1:1000稀釋后作為ー抗，HRP酶標(biāo)兔抗鼠IgG(來(lái)源于KPL公司，100366) 以1:4000稀釋后作ニ抗，OPD顯色，0D492讀數(shù)。與PBS組相比，F(xiàn)2蛋白組的抗F2抗體效價(jià)上 升更加明顯，兩者之間有顯著性差異。說(shuō)明F2蛋白能引起有效地免疫應(yīng)答(見(jiàn)圖5)。
序列表
SEQUENCE LISTING
<110> 昆明理工大學(xué)
<120> ー種呼吸道合胞病毒F2蛋白亞單位疫苗及其制備方法 <160> 2
<170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 288 <212> DNA
<213> respiratory syncytial virus <400> 1
atggaggctt ccagtcaaaa catcactgaa gaattttatc aatcaacatg cagtgcagtt60
agcaaaggct atcttagtgc tctaagaact ggttggtata ctagtgttat aactatagaa120
ttaagtaata tcaaggaaaa taagtgtaat ggaacagatg ctaaggtaaa attgataaaa180
caagaattag ataaatacaa aaatgctgta acagaattgc agttgctcat gcaaagcaca240
ccagcagcca acaatcgagc cagaaggcac caccaccacc accactaa288
<210> 2 <211> 95 <212> PRT
<213> respiratory syncytial virus, mycobacteria tuberculosis <400> 2
MET Glu Ala Ser Ser Gln Asn lie Thr Glu Glu Phe Tyr Gln Ser Thr
151015
Cys Ser Ala Val Ser Lys Gly Tyr Leu Ser Ala Leu Arg Thr Gly Trp
202530
Tyr Thr Ser Val lie Thr lie Glu Leu Ser Asn lie Lys Glu Asn Lys
354045
Cys Asn Gly Thr Asp Ala Lys Val Lys Leu lie Lys Gln Glu Leu Asp
505560
Lys Tyr Lys Asn Ala Val Thr Glu Leu Gln Leu Leu MET Gln Ser Thr
65707580
Pro Ala Ala Asn Asn Arg Ala Arg Arg His His His His His His
85909權(quán)利要求
1.一種呼吸道合胞病毒F2蛋白亞單位疫苗，其特征在于F2蛋白是由SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列所編碼或具有SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列。
2.—種權(quán)利要求1所述的呼吸道合胞病毒F2蛋白亞單位疫苗的制備方法，其特征是包括以下具體步驟(1)重組表達(dá)載體F2/pFN18K的構(gòu)建以F/pMD18T質(zhì)粒為模板，PCR擴(kuò)增獲得F2基因，并引入Afco I和漢I酶切位點(diǎn)和 6XHis標(biāo)簽，F(xiàn)2基因經(jīng)Afc0 I和I雙酶切后得到帶有粘性末端的目的基因，并與同樣雙酶切過(guò)的大腸桿菌表達(dá)載體PFN18K相連接，形成重組表達(dá)載體F2/pFN18K ；(2)F2蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及其純化重組表達(dá)載體F2/pFN18K轉(zhuǎn)化到大腸桿菌表達(dá)菌株中，形成重組工程菌，重組工程菌經(jīng)過(guò)發(fā)酵培養(yǎng)，采用鼠李糖誘導(dǎo)表達(dá)Halo-F2融合蛋白；經(jīng)誘導(dǎo)的重組工程菌采用超聲破菌，4°C下2000rpm離心10分鐘后，用梯度透析方法對(duì)Halo-F2融合蛋白復(fù)性，復(fù)性后的蛋白在4°C下，透析至煙草蝕斑病毒蛋白酶反應(yīng)液中，每Img Halo-F2融合蛋白加入IOU TEV 酶，酶切反應(yīng)他-1 1，酶切后的蛋白經(jīng)過(guò)層析純化，得到疫苗蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的呼吸道合胞病毒F2蛋白亞單位疫苗制備方法，其特征在于大腸桿菌表達(dá)載體為質(zhì)粒PFN18K及其衍生質(zhì)粒，以及適用于大腸桿菌系統(tǒng)的含HaloTagI或脫鹵素酶的遺傳修飾衍生物與TEV酶切位點(diǎn)系列的表達(dá)載體。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的呼吸道合胞病毒F2蛋白亞單位疫苗制備方法，其特征在于大腸桿菌表達(dá)菌株為KRX菌株及其它五cWi K細(xì)胞株。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的呼吸道合胞病毒F2蛋白亞單位疫苗制備方法，其特征在于轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達(dá)菌株的方法為熱休克轉(zhuǎn)化法，電轉(zhuǎn)化法或原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的呼吸道合胞病毒F2蛋白亞單位疫苗制備方法，其特征在于采用金屬離子親和層析純化法或離子交換層析法純化蛋白。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種呼吸道合胞病毒F2蛋白亞單位疫苗及其制備方法，本方法構(gòu)建了重組表達(dá)載體F2/pFN18K，并將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中形成重組工程菌，重組工程菌經(jīng)過(guò)發(fā)酵培養(yǎng)，通過(guò)鼠李糖誘導(dǎo)在大腸桿菌中獲得高效表達(dá)Halo-F2蛋白，并通過(guò)煙草蝕斑病毒蛋白酶(TEV)酶切、層析純化獲得純度較高的F2蛋白；本發(fā)明動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，F(xiàn)2蛋白免疫原性較強(qiáng)，能刺激機(jī)體產(chǎn)生較好的免疫應(yīng)答，用于人體或動(dòng)物預(yù)防接種，抵抗呼吸道合胞病毒的感染，在大腸桿菌中原核表達(dá)F2蛋白，可以提高蛋白疫苗的表達(dá)水平，對(duì)于規(guī)?；a(chǎn)及其臨床應(yīng)用具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。
文檔編號(hào)A61P31/14GK102294027SQ201110209750
公開(kāi)日2011年12月28日 申請(qǐng)日期2011年7月26日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月26日
發(fā)明者井申榮, 曾韋錕, 楊靖佳, 黃芬 申請(qǐng)人:昆明理工大學(xué)