專利名稱：三氧化二砷在制備治療腎癌藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及三氧化二砷在制備治療腎癌藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
大量研究均表明三氧化二砷具有抑制腫瘤細胞增殖、促進細胞凋亡的功能并且具有顯著的臨床療效。研究發(fā)現(xiàn)三氧化二砷可以抑制誘導宮頸癌細胞凋亡、并通過與cytokeratin 18結(jié)合以及下調(diào)hTERT mRNA的表達而發(fā)揮其作用。同樣的,三氧化二砷可抑制人淋巴細胞系T2的增殖，研究發(fā)現(xiàn)它可能通過調(diào)控SHP-1啟動子以及CpG島的功能，來干擾正常細胞或腫瘤細胞的增殖。另外三氧化二砷還可抑制肝癌細胞以及早幼粒白血病細胞的增殖，其中研究最深入的是其在抑制早幼粒白血病細胞增殖、凋亡和死亡的研究。而且有很多報道發(fā)現(xiàn)了該化合物在治療白血病的臨床療效，例如張德芳等采用全反式維甲酸(ATRA)與三氧化二砷(As2O3)和化療藥物聯(lián)合方案治療初診急性早幼粒細胞白血病，總有效率達到96.9%，且無嚴重不良反應(yīng)發(fā)生。另外，根據(jù)哈爾濱醫(yī)學院的臨床實踐，瑞金醫(yī)院血液科針對早幼粒白血病采用三氧化二砷治療，并進行了一系列的研究，在國際上首先證實了三氧化二砷的應(yīng)用可以特異誘導APL細胞調(diào)亡，使得復發(fā)難治白血病得了突破，CR率可達到80%-90%，部分患者得以長期生存。從而開啟了三氧化二砷用于白血病以及其它腫瘤的基礎(chǔ)和臨床研究。雖然如此，但三氧化二砷作為一種劇毒化合物，對泌尿系統(tǒng)具有嚴重的毒性作用，因此有關(guān)三氧化二砷與腎癌的相關(guān)研究較少。目前已經(jīng)清楚的是，0.5μΜ-2μΜ的三氧化二砷可用于治療早幼粒白血病，且通過靜脈注射注入人體后對機體的其它器官和系統(tǒng)的損傷較小。因此我們選擇研究不同劑量三氧化二砷作用不同時間對腎癌細胞的影響，以探討在最低有效濃度下三氧化二砷治療腎癌的潛在臨床價值。結(jié)果表明0.5 μ M三氧化二砷刺激24h可顯著抑制人腎癌細胞786- 0的增殖。為了進一步探討0.5 μ M三氧化二砷抑制人腎癌細胞786-0增殖的作用機理，我們選擇研究該藥物對PI3K-Akt細胞增殖信號轉(zhuǎn)導途徑的影響。PI3K-Akt信號轉(zhuǎn)導途徑是調(diào)控腫瘤細胞增殖的主要信號途徑，由于抑制基因PTEN的低表達從而誘導了 PI3K的表達，進而促進了 Akt分子的表達和磷酸化，從而開啟了細胞內(nèi)蛋白合成和DNA合成途徑，以促進腫瘤細胞大量增殖。同樣人腎癌細胞786-0的增殖也受PI3K-Akt信號途徑調(diào)控。研究中我們首次報道了 0.5 μ M三氧化二砷對人腎癌細胞786-0細胞內(nèi)PI3K-Akt信號途徑的影響，結(jié)果得出0.5 μ M三氧化二砷抑制人腎癌細胞786-0細胞增殖的同時，也抑制ΡΙ3Κ的mRNA和蛋白的表達，進而阻礙了 Akt的表達。因此可以得出，PI3K-Akt信號途徑參與了三氧化二砷抑制人腎癌細胞增殖的過程，且更明確地表明了三氧化二砷在治療腎癌中的潛在臨床價值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明解決的技術(shù)問題在于提供三氧化二砷的新用途，即在制備抗癌藥物中的新應(yīng)用。
本發(fā)明的技術(shù)方案為:三氧化二砷在制備治療腎癌藥物中的應(yīng)用，具體的是在制備治療腎透明細胞腺癌藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明所述的治療腎癌藥物的劑型為注射劑。所述的注射劑中三氧化二砷的摩爾濃度為0.5-2.0 μ M，優(yōu)選為0.5 μ Μ。本發(fā)明研究結(jié)果表明三氧化二砷通過抑制PI3K_Akt轉(zhuǎn)導途徑來抑制人腎癌細胞786-0增值，具有治療人腎癌的潛在臨床價值。
具體實施例方式以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。三氧化二砷對人腎癌細胞786-0增值及其PI3K-Akt轉(zhuǎn)導途徑的影響。I材料與方法 1.1細胞培養(yǎng)
腎透明細胞癌細胞系786-0從中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫購買，目錄號TCHu186ο將購買的細胞接種于RPM1-1640培養(yǎng)基(10%胎牛血清和50 μ g/mL青鏈霉素)，5%C02,培養(yǎng)箱濕度為90%，37°C培養(yǎng)3天。每培養(yǎng)3天傳代一次，取對數(shù)生長期的細胞進行實驗。1.2實驗分組和設(shè)計
將對數(shù)生長期的細胞分別接種于96孔板中，并在5%C02條件下培養(yǎng)。當96孔底部的60%面積貼滿細胞后，吸去培養(yǎng)基并換新的RPM1-1640培養(yǎng)基。5%C02，37°C繼續(xù)培養(yǎng)24h。最后將96孔細胞分成對照組和實驗組，每組45個孔。加入藥物(0.5μ M或1.0 μ M三氧化二砷)和生理鹽水之后分別于0h、12h、和24h取出15個孔細胞，使用BrdU實驗檢測每孔細胞DNA合成量，使用熒光定量PCR檢測PI3K和Akt相對mRNA表達量，使用Western Blot檢測細胞內(nèi)PI3K和Akt的相對表達量。fcdU摻入實驗
在收集待測孔細胞進行檢測前4h時向每個孔中加入一定量BrdU母液至BrdU終濃度為100mM，5%C02，37°C培養(yǎng)。培養(yǎng)結(jié)束后，胰酶消化細胞，用PBS洗脫，400 X g或1700rpm離心5分鐘，去上清，加入10 mL 70% EtOH重懸。用洗滌緩沖液(PBS + 0.5% IFS)洗滌。離心去上清，以0.5 mL 2M HCl + 0.5% IFS，室溫孵育20分鐘。加入Iml洗滌緩沖液洗滌細胞。離心去上清，以0.1M的四硼酸鈉(Na2B4O7)重懸細胞，室溫孵育2分鐘。用Iml洗滌緩沖液洗滌細胞2次。用50 μ L洗滌緩沖液重懸細胞，加入ant1-BrdU抗體，4°C孵育20分鐘。加入1.5ml洗滌緩沖液洗一次。用50 μ L洗滌緩沖液重懸細胞，加入用于FITC結(jié)合Fe段的抗體，4°C孵育20分鐘。加入1.5ml洗滌緩沖液洗滌一次。在450nm的波長處讀取吸光值，用于定量每個孔內(nèi)DNA合成量。1.3熒光定量PCR
取出不同時間(0h，12h和24h)對照組和觀察組3個孔的細胞，胰酶消化細胞，用PBS洗脫，400Xg或1700rpm離心5分鐘,去上清,收集的細胞。使用TRIzol Reagent試劑盒抽提細胞的總 mRNA，并用 DEPC 水定量至 5 μ g/ μ L。使用 PrimeScript One Step RT-PCR Kit將總mRNA擬轉(zhuǎn)錄成cDNA ，并定量。特異性引物為: GAPDH-F: 5’-TGGTGAAGGTCGGTGTGAAC-3，，GAPDH-R:5，-GCTCCTGGAAGATGGTGATGG-3，，
P13K-F:5 ’ -TTTCTCATGGCTGTCCTTCAG-3，，
P13K-R:5，-CAGGAGAATCTAACGGATGC-3，，
Akt-F:5’ -CATCACATCTGGTTTCCTTGG-3’，
Akt-R:5’ -AACTGGAAATGTAATTTTGGG-3，，均為上海生工。以 GAPDH 為內(nèi)參，使用 SYBRGreen熒光定量PCR試劑盒和使用伯樂的IQ5 PCR系統(tǒng)擴增cDNA中的組織因子基因片段和GAPDH基因片段，反應(yīng)條件設(shè)置為:95°C變性5 min，94°C變性30s，57°C退火I min，72°C延伸30s，30個循環(huán)，72°C延伸10 min。計算每個樣品TF和GAPDH的Λ Ct，并采用Λ Ct法計算每個樣品中TF的mRNA轉(zhuǎn)錄倍數(shù)。1.4免疫印跡
取出不同時間(0h，12h和24h)對照組和觀察組3個孔的細胞，胰酶消化細胞，用PBS洗脫，400Xg或1700rpm離心5分鐘，去上清，用緩沖溶液(50 mM Tris-HCl, pH 7.4,150 mMNaCl,1% Nonidet P-40,0.5% deoxycholic acid,0.1% sodium dodecyl sulfate [SDS],5 mM ethylenediaminetetraacetic acid [EDTA],2 mM phenylmethylsulfonyI fluoride[PMSF],20 mg/mL aprotinin,20 mg/mL leupeptin,10 mg/mL pepstanin A and 150 mMbenzamidine)重懸細胞至至5X 101°個。破碎后12000rpm離心20min后取上清進行電泳。使用5%濃縮膠和15%分離膠進行電泳分離，并使用電轉(zhuǎn)將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上。10%牛奶封閉PVDF膜lh，37度孵育一抗I小時，然后PBST清洗3次，每次5min，然后用37度孵育二抗稀釋液，并用PBST清洗3次，每次5min。最后用ECL+plus Western blotting systemkit (Amersham, USA)配置顯光液，然后使用 3490 photo gel imaging systems (Epson,Japan)拍照并記錄,并用Image Pro PLUS軟件分析每個蛋白與GAPDH的相對量。1.5統(tǒng)計學分
采用SPSS19.0軟件進行統(tǒng)計學分析。所有連續(xù)資料均采用t檢驗，結(jié)果以平均值土標準差(I 土 s )表示。所有離散資
料均采用卡方檢驗，統(tǒng)計結(jié)果以X2表示。P〈0.05，表示兩組間比較具有顯著性差異。2 結(jié)果
2.1三氧化二砷對人腎癌細胞786-0增殖的影響
使用BrdU摻入實驗來檢測786-0在三氧化二砷(觀察組)和PBS (對照組)刺激下DNA合成量，用以評價三氧化二砷對人腎癌細胞786-0增殖的影響。由表I可知，0.5 μ M和I μ M三氧化二砷刺激24h后，觀察組DNA合成量顯著低于Oh時的DNA合成量(p〈0.05)，由表2可知,0.5μΜ三氧化二砷刺激24h后且均顯著低于Oh和12h的對照組DNA合成量(p均〈0.05)。結(jié)果表明0.5 μ M三氧化二砷刺激24h有效地抑制人腎癌細胞786-0增殖。表I不同濃度As2O3對人腎癌細胞786-0增殖的影響(0D450，i ±s)
權(quán)利要求
1.三氧化二砷在制備抗癌藥物中的應(yīng)用，其特征在于:所述的三氧化二砷在制備治療腎癌藥物中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的三氧化二砷在制備抗癌藥物中的應(yīng)用，其特征在于:所述的三氧化二砷在制備治療腎透明細胞腺癌藥物中的應(yīng)用。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的三氧化二砷在制備抗癌藥物中的應(yīng)用，其特征在于:所述的治療腎透明細胞腺癌藥物的劑型為注射劑。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的三氧化二砷在制備抗癌藥物中的應(yīng)用，其特征在于:所述的注射劑中三氧化二砷的摩爾濃度為0.5-2.0 μ M。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的三氧化二砷在制備抗癌藥物中的應(yīng)用，其特征在于:所述的注射劑中三氧化二 砷的摩爾濃度為0.5 μ Μ。
全文摘要
本發(fā)明公開了三氧化二砷在制備治療腎癌藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的技術(shù)方案要點為三氧化二砷通過抑制PI3K-Akt轉(zhuǎn)導途徑來抑制人腎癌細胞786-O增值，因此三氧化二砷可以用于制備治療腎癌的藥物尤其是用于制備治療腎透明細胞腺癌藥物中的應(yīng)用。
文檔編號A61K33/36GK103211837SQ201310154548
公開日2013年7月24日 申請日期2013年4月28日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月28日
發(fā)明者張艷, 朱峰, 徐春陽, 李爽, 韓廣業(yè), 郭珂一, 尉娜, 姜洪波, 仲麗麗, 解娜, 楊純生, 李靜, 馮素萍, 劉旭, 代貝貝, 周永霞, 徐佳, 李卓俞, 劉志娟 申請人:新鄉(xiāng)醫(yī)學院