專(zhuān)利名稱(chēng)：多能干細(xì)胞心肌細(xì)胞分化促進(jìn)劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于促進(jìn)多能干細(xì)胞分化成心肌細(xì)胞的組合物，和用于誘導(dǎo)多能干細(xì)胞分化成心肌細(xì)胞的方法，以及用于從多能干細(xì)胞制備心肌細(xì)胞的方法。
背景技術(shù)：
誘導(dǎo)多能干細(xì)胞分化的技術(shù)對(duì)于再生醫(yī)學(xué)的實(shí)現(xiàn)和體外藥物篩選研究的建立或藥物安全性評(píng)價(jià)是關(guān)鍵。尤其，對(duì)于用于心臟病的再生醫(yī)學(xué)和藥物評(píng)價(jià)很重要，原因在于目前在日本心臟病是第二位的死因。存在多種藥物，其誘發(fā)嚴(yán)重的副作用，包括心臟停搏和心律不齊，導(dǎo)致不斷增加的對(duì)提供同質(zhì)心肌細(xì)胞(其可用于心臟毒性研究)的需要。到目前為止，已有報(bào)道，通過(guò)將人ES細(xì)胞和小鼠飼養(yǎng)細(xì)胞，END2細(xì)胞共培養(yǎng)來(lái)誘導(dǎo)人ES細(xì)胞分化為心肌細(xì)胞(非專(zhuān)利文獻(xiàn)I)。然而，此方法的分化效率不令人滿意并且它難以獲得純的人心肌細(xì)胞，因?yàn)樗玫娜诵募〖?xì)胞通常被小鼠END2細(xì)胞污染。還有報(bào)道，通過(guò)由ES細(xì)胞制備胚胎體并向胚胎體中加入若干細(xì)胞因子(成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白4 (BMP4)、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF) ,Dickkopf-1 (DKKl)、活化素A)來(lái)誘導(dǎo)心肌細(xì)胞分化(非專(zhuān)利文獻(xiàn)2和3)。然而，此方法需要大量的細(xì)胞因子并且成本太高，同時(shí)其分化效率不足。引用列表非專(zhuān)利文獻(xiàn)非專(zhuān)利文獻(xiàn)1:Mummery, C., 等，Differentiation of human embryonic stem cells tocardiomyocytes:role of c oculture with visceral endoderm-like cells(人胚月臺(tái)干細(xì)胞分化成心肌細(xì)胞:與內(nèi)臟內(nèi)胚層樣細(xì)胞共培養(yǎng)的作用).Circulation(循環(huán)).107(21)，2733-40(2003)。非專(zhuān)利文獻(xiàn)2:Yang, L., 等，Human cardiovascular progenitor cells develop from aKDR+embryonic-stem-cell-derived population (人心血管祖細(xì)胞發(fā)育自 KDR+ 胚胎干細(xì)胞源的種群).Nature (自然).453 (7194)，524-8 (2008)。非專(zhuān)利文獻(xiàn)3:Leschik, J.,等，Cardiac commitment of primate embryonic stem cells (靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物胚胎干細(xì)胞的心臟定向).Nat Protoc.3(9)，1381-7(2008)。上述文獻(xiàn)通過(guò)引用結(jié)合于此。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問(wèn)題在再生醫(yī)學(xué)和藥物發(fā)現(xiàn)領(lǐng)域需要以低成本高效率制備同質(zhì)心肌細(xì)胞的方法。解決問(wèn)題的方案
本發(fā)明的發(fā)明人考察了 9600種庫(kù)化合物的促進(jìn)猴ES細(xì)胞分化成心肌細(xì)胞的作用，并且發(fā)現(xiàn)低分子量化合物N11474具有促進(jìn)心肌細(xì)胞分化的作用。此外，發(fā)現(xiàn)通過(guò)NI 1474及其類(lèi)似化合物的合成開(kāi)發(fā)獲得的類(lèi)似物KY02111具有促進(jìn)心肌細(xì)胞分化的作用。因而，本發(fā)明已經(jīng)得以實(shí)現(xiàn)。本發(fā)明提供一種用于促進(jìn)多能干細(xì)胞分化成心肌細(xì)胞的組合物，所述組合物包含由式(I)表示的化合物或其鹽:[式I]
權(quán)利要求
1.一種用于促進(jìn)多能干細(xì)胞分化成心肌細(xì)胞的組合物，所述組合物包含由式(I)表示的化合物或其鹽: [式1]
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中， R6至R9各自獨(dú)立地是氫原子；鹵素原子；羥基；具有I至5個(gè)碳原子的直鏈或支鏈烷氧基；未取代的或被鹵素原子取代的具有I至5個(gè)碳原子的直鏈或支鏈烷基；或基團(tuán)-NR12R13,其中R12和R13各自獨(dú)立地是氫原子，氧原子，或是未取代的或被鹵素原子取代的具有I至5個(gè)碳原子的直鏈或支鏈烷基；其中R6至R9中的兩個(gè)相鄰基團(tuán)能夠結(jié)合在一起以形成 _0_CH2_0_ 或 _0_ (CH2) 2_〇_。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的組合物，其中， R1至R5各自獨(dú)立地是氫原子；鹵素原子；羥基；具有I至5個(gè)碳原子的直鏈或支鏈烷氧基；或是未取代的或被鹵素原子取代的具有I至5個(gè)碳原子的直鏈或支鏈烷基；其中R1至R5中的兩個(gè)相鄰基團(tuán)能夠結(jié)合在一起以形成-O-CH2-O-或-O-(CH2)2-O-,并且X是氧原子；硫原子；或基團(tuán)-NR15，其中R15是氫原子，具有I至5個(gè)碳原子的直鏈或支鏈烷基，或具有I至5個(gè)碳原子的直鏈或支鏈酰基。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的組合物，其中， R2和R3是具有I至5個(gè)碳原子的直鏈或支鏈烷氧基，或R2和R3結(jié)合在一起以形成-O-CH2-O-或-O- (CH2) 2~0-, R6和R9各自獨(dú)立地是，氫原子；鹵素原子；羥基；具有I至5個(gè)碳原子的直鏈或支鏈烷氧基；或是未取代的或被鹵素原子取代的具有I至5個(gè)碳原子的直鏈或支鏈烷基，并且R7是氫原子；鹵素原子；羥基；具有I至5個(gè)碳原子的直鏈或支鏈烷氧基；未取代的或被鹵素原子取代的具有I至5個(gè)碳原子的直鏈或支鏈烷基；或基團(tuán)-NR12R13，其中R12和R13各自獨(dú)立地是氫原子，氧原子，或是未取代的或被鹵素原子取代的具有I至5個(gè)碳原子的直鏈或支鏈烷基， R8是氫原子；鹵素原子；羥基；具有I至5個(gè)碳原子的直鏈或支鏈烷氧基；或是未取代的或被鹵素原子取代的具有I至5個(gè)碳原子的直鏈或支鏈烷基，或者R7和R8結(jié)合在一起以形成-O-CH2-O-或-0-(CH2)2-0-。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的組合物，其中，R1, R4, R5, RdPR9 是氫原子， R2和R3是甲氧基，乙氧基或丙氧基，并且 RlO和Rn是氫原子。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的組合物，其中， X是硫原子，并且 η是O至4的整數(shù)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中， R1, R4, R5, R6, R8和R9各自獨(dú)立地是氫原子；鹵素原子；輕基；具有I至5個(gè)碳原子的直鏈或支鏈烷氧基；或是未取代的或被鹵素原子取代的具有I至5個(gè)碳原子的直鏈或支鏈烷基； R2和R3是具有I至5個(gè)碳原子的直鏈或支鏈烷氧基，或R2和R3結(jié)合在一起以形成-O-CH2-O-或-O- (CH2) 2~0-, R7是被基團(tuán)-C (O) A取代的具有I至5個(gè)碳原子的直鏈或支鏈烷氧基，其中A是飽和或不飽和的5元或6元環(huán),所述5元或6元環(huán)是未取代的或被具有I至5個(gè)碳原子的直鏈或支鏈烷基取代并且所述環(huán)能夠含有I個(gè)或2個(gè)獨(dú)立地選自氮原子、氧原子和硫原子中的原子；并且 X是氧原子；硫原子；或基團(tuán)-NR15，其中R15是氫原子，具有I至5個(gè)碳原子的直鏈或支鏈烷基，或具有I至5個(gè)碳原子的直鏈或支鏈?；?br> 8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的組合物，其中，R1, R4, R5, R6, R8 和 R9 是氫原子， R2和R3是甲氧基，乙氧基或丙氧基， R10和R11是氫原子， X是硫原子， A是哌啶基、哌嗪基或嗎啉基，其是未取代的或被具有I至5個(gè)碳原子的直鏈或支鏈烷基取代，并且 η是O至4的整數(shù)。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述化合物選自下列各項(xiàng):
10.根據(jù)權(quán)利要求1至9中任一項(xiàng)所述的組合物，其中多能干細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的組合物，其中多能干細(xì)胞是靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物細(xì)胞。
12.根據(jù)權(quán)利要求1至11中任一項(xiàng)所述的組合物，所述組合物聯(lián)合不同的心肌細(xì)胞分化促進(jìn)劑使用。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的組合物，其中所述不同的心肌細(xì)胞分化促進(jìn)劑是雙呋脒腙；bFGF、BMP4、VEGF, DKKl和活化素A的組合；或Wnt信號(hào)傳導(dǎo)抑制劑。
14.一種用于促進(jìn)心肌細(xì)胞分化的試劑盒，所述試劑盒包括權(quán)利要求1至11中任一項(xiàng)所述的組合物。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的試劑盒，所述試劑盒還包括不同的心肌細(xì)胞分化促進(jìn)劑。
16.一種用于誘導(dǎo)多能干細(xì)胞分化成心肌細(xì)胞的方法，所述方法包括在含有權(quán)利要求1至13中任一項(xiàng)所述的組合物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)多能干細(xì)胞。
17.一種用于從多能干細(xì)胞制備心肌細(xì)胞的方法，所述方法包括在含有權(quán)利要求1至13中任一項(xiàng)所述的組合物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)多能干細(xì)胞。
18.通過(guò)權(quán)利要求17所述的方法制備的心肌細(xì)胞。
19.一種具有式(I)的化合物或其鹽:
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的化合物或其鹽，其中， R6至R9各自獨(dú)立地是氫原子；鹵素原子；羥基；具有I至5個(gè)碳原子的直鏈或支鏈烷氧基；未取代的或被鹵素原子取代的具有I至5個(gè)碳原子的直鏈或支鏈烷基；或基團(tuán)-NR12R13,其中R12和R13各自獨(dú)立地是氫原子，氧原子，或是未取代的或被鹵素原子取代的具有I至5個(gè)碳原子的直鏈或支鏈烷基；其中R6至R9中的兩個(gè)相鄰基團(tuán)能夠結(jié)合在一起以形成-O-CH2-Q-或-Q- (CH2) 2~0-,η是3至6的整數(shù)。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的化合物或其鹽，其中， R1, R4, R5, R6和R9各自獨(dú)立地是氫原子；鹵素原子；輕基；具有I至5個(gè)碳原子的直鏈或支鏈烷氧基；或是未取代的或被鹵素原子取代的具有I至5個(gè)碳原子的直鏈或支鏈烷基；并且 R7是氫原子；鹵素原子；羥基；具有I至5個(gè)碳原子的直鏈或支鏈烷氧基；未取代的或被鹵素原子取代的具有I至5個(gè)碳原子的直鏈或支鏈烷基；或基團(tuán)-NR12R13，其中R12和R13各自獨(dú)立地是氫原子，氧原子，或是未取代的或被鹵素原子取代的具有I至5個(gè)碳原子的直鏈或支鏈烷基， R8是氫原子；鹵素原子；羥基；具有I至5個(gè)碳原子的直鏈或支鏈烷氧基；或是未取代的或被鹵素原子取代的具有I至5個(gè)碳原子的直鏈或支鏈烷基，或R7和R8結(jié)合在一起以形成-O-CH2-O-或-0-(CH2)2-0-。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的化合物或其鹽，其中， R1, R4, R5, RdPR9 是氫原子， R2和R3是甲氧基，乙氧基或丙氧基，并且 RlO和Rn是氫原子。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的化合物或其鹽，其中， X是硫原子，并且 η是3。
24.根據(jù)權(quán)利要求19所述的化合物或其鹽，其中， R1, R4, R5, R6和R9各自獨(dú)立地是氫原子；鹵素原子；輕基；具有I至5個(gè)碳原子的直鏈或支鏈烷氧基；或是未取代的或被鹵素原子取代的具有I至5個(gè)碳原子的直鏈或支鏈烷基，R7是被基團(tuán)-C (O) A取代的具有I至5個(gè)碳原子的直鏈或支鏈烷氧基，其中A是飽和或不飽和的5元或6元環(huán),所述5元或6元環(huán)是未取代的或被具有I至5個(gè)碳原子的直鏈或支鏈烷基取代并且所述環(huán)能夠含有I個(gè)或2個(gè)獨(dú)立地選自氮原子、氧原子和硫原子中的原子。
25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的化合物或其鹽，其中，R1, R4, R5, R6, R8 和 R9 是氫原子， R2和R3是甲氧基，乙氧基或丙氧基， R10和R11是氫原子， X是硫原子， A是哌啶基，哌嗪基或嗎啉基，其是未取代的或被具有I至5個(gè)碳原子的直鏈或支鏈烷基取代，并且 η是O至4的整數(shù)。
26.根據(jù)權(quán)利要求19所述的化合物或其鹽，所述化合物由以下化學(xué)式表示:S0087 [式 22]
全文摘要
本發(fā)明涉及多能干細(xì)胞的心肌細(xì)胞分化促進(jìn)劑，所述分化促進(jìn)劑包含由下式(I)表示的化合物或其鹽成心肌細(xì)胞的方法；和用于制備心肌細(xì)胞的方法。
文檔編號(hào)A61P43/00GK103209968SQ20118005157
公開(kāi)日2013年7月17日 申請(qǐng)日期2011年8月24日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月26日
發(fā)明者中辻憲夫, 上杉志成, 山田耕平, 南一成, 尾辻智美 申請(qǐng)人:國(guó)立大學(xué)法人京都大學(xué)