專利名稱：Hbv治療方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明的領(lǐng)域是乙肝病毒的免疫療法。
背景技術(shù)：
乙肝病毒(HBV)是一種感染人類的非細(xì)胞病變的DNA病毒，它可導(dǎo)致兩種臨床后果。在大多數(shù)成年人的臨床感染病例(90-95％)中，病毒在幾個星期或幾個月后被清除，病人發(fā)展出一種終生的抗再次感染的免疫力。然而在其它病例中，病毒并沒從組織中消除，病人仍處于慢性感染之中。慢性感染的后遺癥相當(dāng)嚴(yán)重，這些個體的肝組織非?？赡馨l(fā)展成瘢痕化(肝硬化)并最終可能發(fā)展為肝細(xì)胞癌。
針對HBV已有預(yù)防性疫苗，許多發(fā)達(dá)國家已經(jīng)進行了兒童接種計劃以降低感染的總風(fēng)險。不幸的是，因為由慢性HBV感染引起的發(fā)病和死亡時間跨度可達(dá)幾十年，預(yù)防接種的影響要到將來才能實現(xiàn)。事實上，成年人HBV感染的年發(fā)生率在今后的八年中預(yù)計減少5％以下。到2008年，每年僅在美國就將新增150,000例感染，而在歐洲和日本預(yù)計有更多的病例。這些個體將構(gòu)成一個巨大的病毒庫，其中每年將出現(xiàn)多達(dá)20,000到40,000例慢性感染?？梢郧宄乜吹?，盡管已有疫苗可用，慢性HBV感染在今后許多年仍將繼續(xù)是一個嚴(yán)重的健康難題。
現(xiàn)有的慢性HBV治療方法包括α-干擾素(IFN-α)和拉米夫定(lamivudine)。評判這些療法可根據(jù)它們減少病毒攜帶量以及引起血清轉(zhuǎn)變或減少HBe抗原的能力，HBe抗原是HBV復(fù)制和高滴度病毒血癥的標(biāo)志。α-干擾素可以消除HBe，但是只在大約三分之一的病人中有效，這些病人所帶病毒量較少。這種治療方法價格昂貴，并有顯著的令人討厭的副作用。拉米夫定是一種小分子抗病毒劑，口服時具有良好的耐藥性。這種化合物可以有效減少病人的病毒攜帶量，但是只有相對極少的病人能夠減少HBe，而且治療中斷后病毒攜帶量經(jīng)常會增加。另一方面，連續(xù)的治療可能導(dǎo)致篩選出抗拉米夫定的突變株。使用α-干擾素和拉米夫定的組合療法并沒顯示出增強的療效。顯然，一種成功的治療HBV感染的免疫療法非常值得期待。
發(fā)明概述本發(fā)明的特征是組合物，這些組合物中包含應(yīng)激蛋白或其部分，以及HBV抗原。這些組合物將在下面進行詳細(xì)討論。在此我們應(yīng)注意的是，它們的成分可以有廣泛的來源，它們的長度和成分可以變化。例如，該應(yīng)激蛋白可以是由任何哺乳動物(如人或非人的靈長類動物)或任何其它能夠表達(dá)應(yīng)激蛋白的生物(如細(xì)菌或分枝桿菌)所天然表達(dá)的一種；該應(yīng)激蛋白和/或HBV抗原可以是全長的、截短的或通過添加一個或多個氨基酸殘基而延長的；此外，該應(yīng)激蛋白或HBV抗原的組成可以變化(例如，應(yīng)激蛋白或其部分，以及HBV抗原可以含有一個或多個氨基酸替代)。然而，任何變化必須仍然能夠?qū)е庐a(chǎn)生一種組合物，它在哺乳動物中可以誘導(dǎo)或增強針對HBV的免疫應(yīng)答。在優(yōu)選情況下，免疫應(yīng)答足夠強，從而使得HBV感染的病人在感染的癥狀中能夠經(jīng)歷增強的過程(主動或被動的)。因此，抗原既包括全長和天然存在的抗原，也包括它的片段和其它變體，當(dāng)給個體施用后(例如采用在此描述的方法)，可以引發(fā)針對該片段或變體中存在的一個或多個抗原決定簇的免疫應(yīng)答。
同樣地，除了全長的或天然存在的應(yīng)激蛋白外，本發(fā)明的組合物也可以含有具有免疫刺激性的應(yīng)激蛋白的片段(即可以促進針對抗原的免疫應(yīng)答的片段)。應(yīng)激蛋白或其片段可以促進免疫應(yīng)答，此時免疫應(yīng)答強于或總之優(yōu)于HBV抗原單獨給藥時通常產(chǎn)生的免疫應(yīng)答。
免疫應(yīng)答可以是體液介導(dǎo)的也可以是細(xì)胞介導(dǎo)的反應(yīng)。例如，抗原片段可以含有一個或多個HLA I型肽抗原，如在此所述。細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答包括免疫系統(tǒng)的抗原特異性細(xì)胞，如細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)，可能還有輔助性T淋巴細(xì)胞(Th)，以及天生的免疫系統(tǒng)的細(xì)胞，如單核細(xì)胞、巨嗜細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、自然殺傷性細(xì)胞和γδT細(xì)胞。本領(lǐng)域一名普通專業(yè)技術(shù)人員能夠充分檢測或評估免疫應(yīng)答，其通過例如細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的誘導(dǎo)(參見下面的實施例)、細(xì)胞增殖反應(yīng)、細(xì)胞因子的誘導(dǎo)或這些事件的組合是顯而易見的。
在特定的實施方案中，HBV抗原可以是HBV核心抗原或其片段或衍生物。HBV抗原的衍生物包括HBV的變體，比如那些含有一個或多個氨基酸替代的變體(例如保守的氨基酸替代)。例如，HBV抗原的變體可以含有1-2、2-5、5-10、10-25或更多個替代的氨基酸殘基?；蛘撸娲蚱渌耐蛔?，比如缺失或截短，可以占全長HBV抗原序列的1-2％、2-5％、5-10％或10-25％。如同組合物中的抗原部分，應(yīng)激蛋白的變體也可以含有一個或多個氨基酸替代(例如保守的氨基酸替代)。例如，應(yīng)激蛋白的變體可以含有1-2、2-5、5-10、10-25或更多個保守的氨基酸替代。這里的替代或其它突變，比如缺失或截短，仍然可以占全長應(yīng)激蛋白序列的1-2％、2-5％、5-10％或10-25％。
在本發(fā)明的范疇內(nèi)，應(yīng)激蛋白和HBV抗原也有多種組合方式。例如，本發(fā)明的組合物包括了那些組合，其中全長的HBV抗原與全長的應(yīng)激蛋白相結(jié)合；由HBV抗原的片段或其它變體組成的抗原與全長的應(yīng)激蛋白相結(jié)合；全長的HBV抗原與應(yīng)激蛋白的片段或其它變體相結(jié)合；以及HBV抗原的片段或其它變體與應(yīng)激蛋白的片段或其他變體相結(jié)合。當(dāng)然，如在此所述，可以存在一個以上的每種這些成分(即多于一個的HBV抗原和多于一個的應(yīng)激蛋白)，并且每一個成分可以以全長的蛋白或其具有免疫活性的片段或變體的形式存在。
此外，在此所述的任何排列方式中，HBV抗原和應(yīng)激蛋白可以以任何形式相結(jié)合。例如，應(yīng)激蛋白和HBV抗原可以以融合多肽的形式存在(其中在融合的可讀框進行翻譯的過程中應(yīng)激蛋白和HBV抗原是共價連接的?；蛘?，應(yīng)激蛋白和HBV抗原也可以在分別翻譯或合成后通過化學(xué)結(jié)合作用相連接。這些組分也可以是非共價結(jié)合的(例如以混合物或更有序的組成方式)。術(shù)語“多肽”和“蛋白”在此可以互換使用用于描述一條氨基酸殘基組成的鏈，除非從上下文中可明顯看出是為了表明截然不同的意義。
應(yīng)激蛋白將在后面進一步討論，在此我們應(yīng)注意到應(yīng)激蛋白可以是熱休克蛋白(Hsp)。此外，熱休克蛋白可以是分枝桿菌的熱休克蛋白，如Hsp65(例如牛分枝桿菌(Mycobacterium bovis)的Hsp65)，或來自任何物種的熱休克蛋白家族的任何成員。
本發(fā)明的組合物可以以多種方式配制給個體施用，并可任選添加佐劑。在本發(fā)明組合物中可隨意添加的成分包括在藥物上可接受的稀釋劑、賦形劑和載體。
本發(fā)明的特征還包括通過將本發(fā)明的組合物施用給被HBV感染的個體(例如哺乳動物，比如人)以治療該個體的HBV感染的方法，以及在個體(例如哺乳動物，比如人)感染HBV以前將本發(fā)明的組合物施用給個體以防止HBV對該個體的感染(或減少其可能性)的方法。
該組合物的成分不必以多肽的形式直接施用給個體。相反，為應(yīng)激蛋白、HBV抗原或含有一個或多個每種組分的融合蛋白編碼的核酸也可以施用，蛋白、抗原或融合蛋白將在個體中體內(nèi)表達(dá)。該核酸可以是病毒載體的一部分，例如病毒載體基因組的一部分，或包埋于例如脂質(zhì)體中?；蛘撸怂徇€可以以裸核酸的形式遞送，例如由可以在真核或哺乳動物細(xì)胞中可操作的調(diào)控序列所驅(qū)動的質(zhì)粒DNA。給藥核酸分子的方法在本領(lǐng)域內(nèi)眾所周知。
本發(fā)明進一步包括了本發(fā)明組合物(如含有HBV抗原的融合蛋白、編碼它們的核酸分子以及包含它們的藥物組合物)在生產(chǎn)用于按照在此描述的方法治療HBV感染的藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明的其它特點和優(yōu)點將從發(fā)明詳述、附圖和權(quán)利要求中變得一目了然。所有在此引用的專利申請、專利和出版物在此以其全文引作參考。
附圖簡述

圖1是編碼HBV(adw亞型)核心抗原(HBc)的DNA序列(SEQ IDNO1)。
圖2是HBV(adw亞型)核心抗原(HBc)的氨基酸序列(SEQ IDNO2)。
圖3是構(gòu)建體hisHepCorT(149/87S97F)的DNA序列，它編碼組氨酸標(biāo)記的截短的HBV核心抗原(第1-149位氨基酸；SEQ ID NO3)。
圖4是由圖3所示的DNA序列所編碼的氨基酸序列(SEQ IDNO4)。
圖5是構(gòu)建體hisHepCor(97F)Hsp65的DNA序列，它編碼組氨酸標(biāo)記的融合蛋白，包括全長的HBV核心抗原和Hsp65蛋白(SEQ IDNO5)。
圖6是由圖5所示的DNA序列所編碼的氨基酸序列(SEQ IDNO6)。
圖7是構(gòu)建體hisHepCorT(149/87S97F)Hsp65的DNA序列，它編碼組氨酸標(biāo)記的融合蛋白，包括與Hsp65蛋白融合的截短的HBV核心抗原(第1-149位氨基酸)(SEQ ID NO7)。
圖8是由圖7所示的DNA序列所編碼的氨基酸序列(SEQ IDNO8)。
圖9是構(gòu)建體HepCorT(151/97F)Hsp65的DNA序列，它編碼一個融合蛋白，包括與Hsp65蛋白融合的截短的HBV核心抗原(第1-151位氨基酸)(SEQ ID NO9)。
圖10是由圖9所示的DNA序列所編碼的氨基酸序列(SEQ IDNO10)。
圖11是構(gòu)建體HepCor(97F)Hsp65的DNA序列，它編碼一個融合蛋白，包括與Hsp65蛋白融合的全長的HBV核心抗原(SEQ IDNO11)。
圖12是由圖11所示的DNA序列所編碼的氨基酸序列(SEQ IDNO12)。
圖13示出了在用不同的免疫原(HepCorT(151/97F)Hsp65；HepCor(97F)Hsp65；HepCorT(151/97F)；HepCor(97F)；以及hisHepCorT(149/87S97F)Hsp65)免疫的C57BL/6小鼠中CTL的引發(fā)活性(校正的溶胞百分?jǐn)?shù)對效應(yīng)物靶比率)。對比用對照多肽MUT-1.52-59.Kb預(yù)脈沖的EL4細(xì)胞分析所得的CTL溶胞活性。對照小鼠用安慰劑(緩沖液)注射。
圖14示出了在用不同的免疫原(同圖13)免疫的C57BL/6小鼠中CTL的引發(fā)活性(校正的溶胞百分?jǐn)?shù)對效應(yīng)物靶比率)。對比用HBc抗原特異性多肽HBc.93-100.Kb預(yù)脈沖的EL4細(xì)胞分析所得的CTL溶胞活性。對照小鼠用安慰劑(緩沖液)注射。
圖15示出了在用不同的免疫原(同圖13)免疫的C57BL/6小鼠中CTL的引發(fā)活性(校正的溶胞百分?jǐn)?shù)對效應(yīng)物靶比率)。對比能夠表達(dá)HBV核心抗原的EL4.HBc.1D7細(xì)胞分析所得的CTL溶胞活性。對照小鼠用安慰劑(緩沖液)注射。
圖16示出了在用不同的免疫原(同圖13)免疫的C57BL/6小鼠中CTL的引發(fā)活性(γ-干擾素(pg/ml)對效應(yīng)物靶比率)。對比與HBc抗原特異性肽HBc.93-100.Kb共培養(yǎng)的EL4細(xì)胞分析生成的CTL分泌γ-干擾素(IFN-γ)的能力。對照小鼠用安慰劑(緩沖液)注射。
圖17示出了在用不同的免疫原(同圖13)免疫的C57BL/6小鼠中CTL的引發(fā)活性(腫瘤壞死因子-α(OD410))。對比與HBc抗原特異性肽HBc.93-100.Kb共培養(yǎng)的EL4細(xì)胞分析生成的CTL分泌腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的能力。對照小鼠用安慰劑(緩沖液)注射。
發(fā)明詳述本發(fā)明涉及含HBV抗原的組合物，可用于治療或預(yù)防HBV感染。正如在此所描述的，所述組合物的成分可以變化，但其中包含了應(yīng)激蛋白，或它的一部分(如片段)或衍生物，以及HBV抗原。適用于本發(fā)明方法的各種各樣材料和步驟將在下面討論。
因為編碼應(yīng)激蛋白和HBV蛋白的核酸序列已知并且可用，利用本領(lǐng)域常用方法可以很容易地制備為它們編碼的核酸構(gòu)建體(單獨或融合構(gòu)建體的形式)。例如為與抗原隨意偶聯(lián)的一種應(yīng)激蛋白(熱休克蛋白Hsp)編碼的核酸可參見WO 89/12455、WO 94/29459、WO 98/23735、WO 99/07860，在此引用為參考。融合蛋白不僅可以通過重組技術(shù)來生產(chǎn)，也可以通過對應(yīng)激蛋白(如熱休克蛋白)和HBV抗原進行翻譯后連接來產(chǎn)生。連接技術(shù)已有描述，如Hermanson(BioconjugateTechniques，Academic Press，San Diego，CA，1996)、Lussow等(Eur.J.Immun.212297-2302，1991)和Barrios等(Eur.J.Immun.221365-1372，1992)。這些連接方法包括使用偶聯(lián)劑如戊二醛、碳二亞胺和雙重氮聯(lián)苯胺；使用異雙功能交聯(lián)劑如M-馬來酰亞胺苯甲酸-N-羥基琥珀酰亞胺酯；或利用應(yīng)激蛋白和抗原中的半胱氨酸殘基(天然存在和/或重組插入的那些殘基)來促進分子間二硫鍵的形成。
任何HBV抗原均適合于包括在本發(fā)明的融合蛋白或組合物中。優(yōu)選的HBV抗原是HBV核心抗原或其片段或衍生物。為了便于檢測，對HBV抗原可進行隨意修飾使其包含已知的小鼠MHC限制性CTL抗原決定簇，例如小鼠H-2Kb限制性CTL抗原決定簇。一個這樣修飾的例子在實施例中進行了描述(例如在HBV adw亞型中，第97位的殘基是異亮氨酸，將其用苯丙氨酸取代后就產(chǎn)生了小鼠H-2Kb限制性CTL抗原決定簇)。此外，抗原還可以修飾成包含來自一個以上HBV亞型(例如adw、ayw、adr或ayr)的人HLA抗原決定簇。例如，將圖2所示的HBV核心抗原第91位的蘇氨酸進行單一氨基酸替代為纈氨酸，就可以復(fù)制在adw和adrHBV亞型中發(fā)現(xiàn)的已知HLA-A11-限制性CTL抗原決定簇。其它的HBV核心抗原的衍生物包括截短。這樣的截短包括移除全部或部分富含精氨酸的C端結(jié)構(gòu)域(HBc的第150-185位氨基酸)，但并不以此為限。適當(dāng)截短的HBc片段包括僅由HBc的N端前149個氨基酸或前151個氨基酸組成的片段，但并不以此為限。不論在哪種情況下，適當(dāng)?shù)腍Bc抗原片段(或任何適當(dāng)?shù)腍BV抗原)應(yīng)該包括一個或多個B或T細(xì)胞抗原決定簇(或一個或多個B細(xì)胞抗原決定簇和一個或多個T細(xì)胞抗原決定簇)，優(yōu)選是一個或多個CTL抗原決定簇。此外，HBV核心抗原末端的半胱氨酸可以被移除或用不同的氨基酸替代。對氨基酸序列還可以進行其它修飾。另一個例子是在一個已知的HLA限制性CTL抗原決定簇的錨定殘基上進行替代，以增強肽與I型MHC分子的結(jié)合親和性。盡管這些修飾的HBV核心抗原適合于包含在融合蛋白中，但他們也可以單獨使用(用佐劑隨意配制)以產(chǎn)生針對HBV的免疫應(yīng)答。
其它適用于本發(fā)明的HBV抗原包括HBV核心抗原、HBVe抗原(HbeAg)、x蛋白(HBx)、聚合酶多肽以及HBV包膜蛋白S、M和L及其片段(Seeger和Mason，Microbiol.Mol.Biol.Rev.6451-68，2000；Ganem和Schneider，HepadnavirdaeThe viruses and their replication.InKnipe，DM和Howley，PM主編Fields Virology，PhiladelphiaLippincottWilliams&Wilkins，20012923-2969)。
如上所述，HBV抗原、應(yīng)激蛋白或兩者可以含有一個或多個氨基酸替代(例如保守的氨基酸替代)。這些替代可以發(fā)生在一個或多個預(yù)測的非必需氨基酸殘基上，但這并不是必須的?！氨Ｊ氐陌被崽娲笔侵敢粋€氨基酸殘基被另一個具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基取代。具有相似側(cè)鏈的氨基酸家族在本領(lǐng)域內(nèi)已經(jīng)定義。這些家族包括具有堿性側(cè)鏈的氨基酸(例如賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、酸性側(cè)鏈的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不帶電荷的極性側(cè)鏈的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非極性側(cè)鏈的氨基酸(例如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-支鏈的氨基酸(例如蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和芳族側(cè)鏈的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)。不論替代是被設(shè)計發(fā)生在預(yù)測的非必需位點上還是隨機引入到HBV抗原或應(yīng)激蛋白編碼序列的全部或部分中的(例如通過飽和誘變)，所得到的突變體可分別篩選它們的抗原性和免疫刺激活性，以鑒定出保留了生物活性的突變體。誘變后，所編碼的蛋白可以重組表達(dá)，蛋白的活性可得以測定。
HBV抗原既可以與應(yīng)激蛋白的N-端又可以與其C-端融合，可以帶也可以不帶接頭或介入的外源序列。在另一個實施方案中，兩個HBV抗原(如此所述，可以是天然存在的或變體)可以同時連接在應(yīng)激蛋白上(一個在應(yīng)激蛋白的N-端，另一個在C-端；同時在N-端；或同時在C-端)。此外，一個或多個HBV抗原(天然存在的或其片段或其它變體，來自同一或不同的HBV抗原)可以被連接在應(yīng)激蛋白的N-端或C-端或兩端。如果包括了一個以上的應(yīng)激蛋白，還可以作出其它的排列，這對于熟悉本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說是顯而易見的。
應(yīng)激蛋白和HBV抗原(或其組合，例如一個應(yīng)激蛋白和兩個或多個HBV抗原)可以在它們每一個單獨翻譯或合成后通過化學(xué)結(jié)合的方法連接起來。如前所述，這些成分也可以是非共價結(jié)合的(如以混合物或更有序的組成方式)。含有與HPV抗原非共價結(jié)合的應(yīng)激蛋白或其免疫刺激性片段的組合物的生產(chǎn)可以參照美國專利6,048,530、6,017,544、6,017,540、6,007,821、5,985,270、5,948,646、5,935,576、5,837,251、5,830,464或5,750,119。也參見美國專利5,997,873、5,961,979、6,030,618、6,139,841、6,156,302、6,168,793和國際公開號WO 97/06821。
此外，在該組合物中可以包含一種以上類型的病毒抗原。例如，除了HBV抗原外，本發(fā)明的組合物還可以包括(或編碼；任何在此描述的蛋白都可以直接給藥或以核酸的方式給藥)來自其它病原體的抗原。因此，除了HBV抗原，組合物可以包括(或編碼)丙肝病毒抗原、單一皰疹病毒(HSV)抗原、人免疫缺陷病毒(HIV)抗原、細(xì)胞肥大病毒(CMV)抗原、EB病毒(EBV)抗原、呼吸道合胞病毒(RSV)抗原、人乳頭瘤病毒(HPV)抗原、皰疹病毒抗原或其組合。在組合物只含有HBV作為病毒抗原的實施方案中已經(jīng)描述的變化方式(例如與應(yīng)激蛋白結(jié)合的方法，包含全長、片段或變體蛋白，組分?jǐn)?shù)量及其排列方式的可變性)，同樣適用于組合物中存在(或編碼)至少一個HBV抗原和至少一個其它病毒抗原的實施方案。
令人吃驚的是，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)除去核心抗原C-端富含精氨酸的結(jié)構(gòu)域后產(chǎn)生的多肽能夠引發(fā)針對核心抗原的免疫應(yīng)答，特別是細(xì)胞和/或CTL免疫應(yīng)答。核心抗原富含精氨酸的結(jié)構(gòu)域位于核心抗原的第150-183位氨基酸之間(Nassal，J.Virol.664107-4116，1992)。適合的核心抗原片段包括缺失了全部或部分這一區(qū)域的片段，但并不以此為限。例如，適合的核心抗原片段可以含有前149個或151個氨基酸(或少于149個或151個氨基酸)。
本發(fā)明的組合物可以隨意添加佐劑。有效的佐劑的例子包括弗氏完全佐劑(FCA)、弗氏不完全佐劑(FIA)、SAF、胞壁酰二肽(MDP)、脂多糖(LPS)、脂質(zhì)A、單磷酸脂A(MPL)、百日咳毒素(PT)、硬脂基酪氨酸、γ-菊粉、RIBI(含有從細(xì)菌中提取的三種成分)、Quil-A、皂角甙(QS21)、明礬(氫氧化鋁、磷酸鋁)、磷酸鈣、MF-59、免疫刺激性復(fù)合物(ISCOMS)、CpG寡聚核苷酸和細(xì)胞因子(Gupta和Siber，Vaccine131263-1276，1995；Singh和O’Hagan，Nature Biotechnology 171075-1081，1999)，但并不以此為限。
適合的HBV抗原片段或衍生物理想地應(yīng)包括至少一個B或T細(xì)胞抗原決定簇(或兩者皆有)。在優(yōu)選的實施方案中，該片段或衍生物應(yīng)包含至少一個CTL抗原決定簇。
已經(jīng)從多種生物體內(nèi)分離、克隆和表征了多種應(yīng)激蛋白(Mizzen，Biotherapy 10173-189，1998)。任何具有免疫刺激性Hsp或其具有免疫刺激性片段都適用于融合多肽和組合物中。例如Hsp70、Hsp60、Hsp20-30(低分子量熱休克蛋白)和Hsp10(GroES同源物)都屬于結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)和麻風(fēng)分枝桿菌(Mycobacteriumleprae)感染時被宿主免疫應(yīng)答識別的主要決定簇。此外，卡介苗(BacilleCalmette Guerin)(BCG)，一株牛分枝桿菌(Mycobacterium bovis)，它的Hsp65發(fā)現(xiàn)是一種有效的免疫刺激劑，如下面的實施例所描述。
用于本發(fā)明的應(yīng)激蛋白和基因家族在本領(lǐng)域已廣為人知，包括例如Hsp100-200、Hsp100、Hsp90、Lon、Hsp70、Hsp60、TF55、Hsp40、FKBPs、親環(huán)蛋白、Hsp20-30、ClpP、GrpE、Hsp10、泛素、鈣聯(lián)接蛋白和蛋白二硫鍵異構(gòu)酶。參見例如Macario，Cold Spring HarborLaboratory Res.2559-70，1995；Parsell等，Rev.Genet.27437-496，1993；和美國專利5,232,833。
Hsp100-200蛋白的例子包括Grp170(葡萄糖調(diào)控蛋白)。Grp170駐留于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中和前高爾基體隔室內(nèi)，可能在免疫球蛋白折疊和裝配中發(fā)揮作用。
Hsp100蛋白的例子包括哺乳動物Hsp110、酵母Hsp104、以及大腸桿菌ClpA、ClpB、ClpC、ClpX和ClpY。
Hsp90蛋白的例子包括大腸桿菌HtpG、酵母Hsp83和Hsc83、以及人Hsp90α、Hsp90β和Grp94(小gp96)。Hsp90與通常是細(xì)胞調(diào)控分子的蛋白組結(jié)合，例如甾體激素受體(如糖皮質(zhì)激素、雌激素、黃體酮和睪酮受體)、轉(zhuǎn)錄因子以及在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制中發(fā)揮作用的蛋白激酶。Hsp90蛋白也參與形成包含其它應(yīng)激蛋白的大的、高豐度的蛋白復(fù)合物。
Lon是一種四聚體的ATP依賴性蛋白酶，在大腸桿菌中降解非本源蛋白。
Hsp70蛋白的例子包括哺乳動物細(xì)胞的Hsp72和Hsc73、細(xì)菌或分枝桿菌如麻風(fēng)分枝桿菌、結(jié)核分枝桿菌和牛分枝桿菌的DnaK(如卡介苗，在此是指Hsp71)、大腸桿菌、酵母和其它原核生物的DnaK、以及BiP和Grp78。Hsp70能夠特異性結(jié)合ATP和未折疊的多肽和肽，參與蛋白的折疊和去折疊以及蛋白復(fù)合物的裝配和解裝配。
Hsp60蛋白的例子包括分枝桿菌的Hsp65。細(xì)菌的Hsp60通常也稱為GroEL。Hsp60形成大的同源寡聚復(fù)合物，似乎在蛋白折疊中發(fā)揮作用。在真核生物的線粒體和葉綠體中也存在Hsp60的同源物。
TF55蛋白的例子包括Tcp1、TriC和熱體(thermosome)。這些蛋白通常存在于真核生物和一些古細(xì)菌的細(xì)胞質(zhì)中，形成多元環(huán)，促進蛋白折疊。它們與Hsp60有弱的同源性。
Hsp40蛋白的例子包括原核生物如大腸桿菌(E.coli)和分枝桿菌的DnaJ、以及HSJ1、HDJ1和Hsp40。Hsp40作為分子伴侶在蛋白折疊、耐熱性、DNA復(fù)制和其它細(xì)胞活動中發(fā)揮作用。
FKBP的例子包括FKBP12、FKBP13、FKBP25和FKBP59、Fpr1和Nep1。這些蛋白通常具有肽酰脯氨酰異構(gòu)酶活性，可以與免疫抑制劑如FK506和雷帕霉素(rapamycin)相互作用。這些蛋白通常發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞質(zhì)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中。
親環(huán)蛋白的例子包括親環(huán)蛋白A、B和C。這些蛋白具有肽酰脯氨酰異構(gòu)酶活性，可以與免疫抑制劑如環(huán)孢菌素A相互作用。
Hsp20-30也稱為小熱休克蛋白。Hsp20-30通常發(fā)現(xiàn)在大的同源寡聚復(fù)合物或可能在異源寡聚復(fù)合物中。一種類型的生物或細(xì)胞可以表達(dá)幾種不同類型的小熱休克蛋白。Hsp20-30與細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)相互作用，可能在肌動蛋白的聚合和解聚中發(fā)揮調(diào)控作用。在靜息細(xì)胞受到刺激或接觸到生長因子后，Hsp20-30被快速磷酸化。Hsp20-30的同源物包括α-晶體蛋白。
ClpP是一種大腸桿菌蛋白酶，參與異常蛋白的降解。在葉綠體中發(fā)現(xiàn)了ClpP的同源物。ClpP與ClpA形成異源寡聚復(fù)合物。
GrpE是一種大腸桿菌的蛋白，大約20kDa，它參與應(yīng)激損傷的蛋白的拯救以及受損蛋白的降解。GrpE在大腸桿菌的應(yīng)激基因表達(dá)的調(diào)控中發(fā)揮作用。
Hsp10的例子包括GroES和Cpn10。Hsp10發(fā)現(xiàn)于大腸桿菌中以及真核細(xì)胞的線粒體和葉綠體中。Hsp10形成一個七元環(huán)，與Hsp60寡聚體相結(jié)合。Hsp10也參與蛋白折疊。
泛素發(fā)現(xiàn)能夠與蛋白結(jié)合，協(xié)助通過ATP依賴性細(xì)胞溶膠蛋白酶的蛋白水解作用除去蛋白。
除了全長的應(yīng)激蛋白，任何具有免疫刺激性片段或衍生物都可用于本發(fā)明。免疫刺激性片段或衍生物(例如Hsp的免疫刺激性片段)是能夠促進針對抗原的免疫應(yīng)答的片段或衍生物。該片段或衍生物可以以多種方式促進免疫應(yīng)答。例如，該片段可以誘導(dǎo)一個本來不會發(fā)生的免疫應(yīng)答或增強一個本來會發(fā)生的免疫應(yīng)答。已經(jīng)描述了多種免疫刺激性片段。適合的片段包括含有下列部分的片段，但并不以此為限(a)分枝桿菌Hsp70(特別是結(jié)核分枝桿菌Hsp70)的第161-370位氨基酸(Huang等，J.Exp.Med.191403-408，2000；美國專利申請09/761,534，2001年1月16日提交)；(b)分枝桿菌Hsp70(特別是結(jié)核分枝桿菌Hsp70)的ATP酶結(jié)構(gòu)域或肽結(jié)合結(jié)構(gòu)域(Young，美國專利申請序列號09/025178，1997年11月25日提交)；(c)鼠Hsc70(Hsp70家族的組成成員)的第280-385位氨基酸(Udono等，Int.Immunol.131233-1242，2001)；(d)結(jié)核分枝桿菌Hsp70的第359-610位氨基酸(Wand等，Immunity 15971-983，2001)；(e)來自其它物種的Hsp同源物的(a)到(d)中的相應(yīng)區(qū)段；以及(f)分枝桿菌Hsp65(特別是牛分枝桿菌的Hsp65)的第1-200位氨基酸(Chu等，美國專利申請序列號09/613,303，2000年7月10日提交)。
可用于本發(fā)明的應(yīng)激蛋白可以從任何適當(dāng)?shù)纳矬w獲得，包括革蘭氏陽性細(xì)菌、革蘭氏陰性細(xì)菌、腸細(xì)菌(如大腸桿菌)、分枝桿菌(特別是麻風(fēng)分枝桿菌、結(jié)核分枝桿菌、母牛分枝桿菌(M.vaccae)、恥垢分枝桿菌(M.smegmatis)和牛分枝桿菌)、酵母、果蠅、脊椎動物(例如鳥類如雞，或哺乳動物如大鼠、小鼠，或靈長類動物包括人)，但并不以此為限。
為了制備包含融合多肽的治療(如免疫治療)組合物，可以在細(xì)菌、酵母、植物或植物細(xì)胞、或動物或動物細(xì)胞中重組生產(chǎn)該多肽。例如，本發(fā)明的融合多肽可以通過將帶有為融合多肽編碼的DNA片段的適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體轉(zhuǎn)化(轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)或侵染)宿主細(xì)胞而生產(chǎn)。適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體包括質(zhì)粒、病毒粒子和噬菌體。對于昆蟲細(xì)胞，桿狀病毒表達(dá)載體是適用的。完整的表達(dá)載體或其一部分可以整合到宿主細(xì)胞的基因組中。在某些情況下，希望使用可誘導(dǎo)的表達(dá)載體，例如LACSWITCH誘導(dǎo)型表達(dá)系統(tǒng)(Stratagene；La Jolla，CA)。
分子生物學(xué)領(lǐng)域的專業(yè)人士都會明白眾多表達(dá)系統(tǒng)中的任何一種都可用于提供重組融合多肽。明確所用的宿主和載體對本發(fā)明來說不是關(guān)鍵。
蛋白和多肽也可以用植物細(xì)胞來生產(chǎn)。對于植物細(xì)胞，病毒表達(dá)載體(例如花椰菜花葉病毒和煙草花葉病毒)和質(zhì)粒表達(dá)載體(如Ti質(zhì)粒)是適用的。這些細(xì)胞和載體有廣泛的來源(例如美國典型培養(yǎng)物保藏中心，Manassas，VA；也可參見例如Ausubel等，Current Protocols inMolecular Biology，John Wiley&Sons，New York，1994)。轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染以及選擇表達(dá)載體的方法依賴于選用的宿主系統(tǒng)。轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)染的方法描述在例如Ausubel等，同上中。表達(dá)載體可以從例如在Pouwels等，Cloning VectorsA Laboratory Manual，1985，Supp.1987中所提供的載體中選擇。帶有表達(dá)載體的宿主細(xì)胞可以在常規(guī)營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，視激活或抑制所選基因、篩選轉(zhuǎn)化子或擴增所選基因的不同需要而調(diào)節(jié)。
如果合適或有利，編碼融合多肽的核酸可以包含一個信號序列以便分泌融合多肽，例如有利于從細(xì)胞培養(yǎng)物中分離多肽。為了有效翻譯插入的核酸序列，也可能需要特定的起始信號。這些信號包括ATG起始密碼子和鄰近的序列。在一些情況下，必須提供外源的翻譯控制信號，其中可能包括ATG起始密碼子。另外，起始密碼子必須與所需的編碼序列的閱讀框架協(xié)調(diào)一致，以確保翻譯完整的插入序列。這些外源的翻譯控制信號和起始密碼子可以有廣泛的來源，包括天然和合成的。表達(dá)的效率可以通過加入適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)錄或翻譯增強子元件(例如在Bittner等，Methods in Enzymol.153516，1987中公開的元件)來增強。此外，基因序列可以根據(jù)適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)系統(tǒng)中所用的最適密碼子進行修飾，或者，也可以對表達(dá)宿主進行修飾，使其表達(dá)特定的tRNA分子以促進所需基因的表達(dá)。
如果融合多肽在正常生理條件下是可溶的，這將會非常有用。本發(fā)明中還包括了使用融合蛋白(或其它構(gòu)型的蛋白，包括共價和非共價的復(fù)合物和混合物)的方法，其中應(yīng)激蛋白(或其免疫刺激性片段)和HBV抗原與無關(guān)的第三個蛋白或多肽融合(或結(jié)合)，從而產(chǎn)生了至少一個三重的蛋白或蛋白混合物。第三個蛋白可以促進融合物或其它復(fù)合物的純化、檢測或溶解，或者可以提供其它一些功能。例如，pUR278表達(dá)載體(Ruther等，EMBO J.21791，1983)可用于創(chuàng)建lacZ融合蛋白。pGEX載體可用于將外源多肽表達(dá)為含有谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)的融合蛋白。一般來說，這樣的融合蛋白是可溶的，并可以通過吸附到谷胱甘肽-瓊脂糖珠上，然后在存在游離的谷胱甘肽的條件下洗脫，從而容易地從裂解細(xì)胞中得到純化。pGEX載體被設(shè)計成包括了凝血酶或因子Xa蛋白酶切割位點，以便所克隆的靶基因產(chǎn)物可以從GST基團上釋放出來。
融合蛋白或共價復(fù)合物可以使用能特異性結(jié)合融合物或復(fù)合物的一部分的抗體進行純化?；蛘?，所含蛋白的其它性質(zhì)(例如金屬結(jié)合)也可用于純化。例如，Janknecht等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.888972，1981)描述了一個系統(tǒng)可以容易地純化在人細(xì)胞系中表達(dá)的非變性的融合蛋白。在這個系統(tǒng)中，將目的基因亞克隆在一個牛痘重組質(zhì)粒中，以便該基因的可讀框翻譯后融合由六個組氨酸殘基組成的氨基末端標(biāo)記。將感染有重組的牛痘病毒的細(xì)胞的提取物上樣到Ni2+氮川乙酸-瓊脂糖柱上，組氨酸標(biāo)記的蛋白可以用含咪唑的緩沖液選擇性地洗脫下來。同樣的步驟可用于細(xì)菌培養(yǎng)物。
或者，第三個蛋白可以是一個免疫球蛋白Fc結(jié)構(gòu)域。這樣的融合蛋白可以使用親和柱容易地純化。
融合多肽，特別是那些含有短的抗原片段的多肽，也可以用化學(xué)合成的方法生產(chǎn)(例如通過在《固相肽類合成》(Solid Phase PeptideSynthesis)第2版，1984 The Pierce Chemical Co.，Rockford，IL中描述的方法)。
一旦分離后，如果需要，融合多肽可以被進一步純化和/或濃縮，只要進一步的處理不會損害其引發(fā)(例如誘導(dǎo)或增強)足夠?qū)嵤┍景l(fā)明方法的免疫應(yīng)答的能力。在本領(lǐng)域有許多為人熟知的純化和濃縮的方法(參見例如Fisher，Laboratory Techniques In Biochemistry AndMolecular Biology，Work和Burdon主編，Elsevier，1980)，包括超速離心和/或沉淀(例如用硫酸銨)、微濾(例如通過0.45μm的乙酸纖維素濾膜)、超濾(例如使用大小分級的膜和再循環(huán)過濾器)、凝膠過濾(例如填充有Sepharose CL-6B、CL-4B、CL-2B、6B、4B或2B、Sephacryl S-400或S-300、Superose 6或Ultrogel A2、A4或A6的柱子，所有都可以從Pharmacia Corp.購得)、快速蛋白液相色譜(FPLC)和高效液相色譜(HPLC)。
本發(fā)明組合物中的多肽可以含有多于一個應(yīng)激蛋白和/或多于一個HBV蛋白的抗原性或免疫刺激性決定簇，或完整蛋白。肽中還可以隨意包括其它免疫應(yīng)答所需的序列。
本發(fā)明還包括免疫治療組合物，它們含有至少一種在此所述的融合多肽，以及可隨意添加的可藥用載體，例如稀釋劑，如鹽、磷酸緩沖的鹽、或碳酸氫鹽溶液(如0.24M NaHCO3)。在組合物中使用的載體的選擇是基于給藥的方式和途徑，以及標(biāo)準(zhǔn)的藥物實踐。適合的藥物載體和稀釋劑，以及使用它們的藥物必要成分，在Remington的藥物學(xué)(Remington’s Pharmaceutical Sciences)中有描述。佐劑，例如霍亂毒素、大腸桿菌的熱不穩(wěn)定腸毒素(LT)、脂質(zhì)體或免疫刺激性復(fù)合物(ISCOM)，也可包含于免疫治療組合物中。
該組合物可以配制成溶液(適合于肌內(nèi)、皮內(nèi)或靜脈內(nèi)給藥)、懸浮液、栓劑、片劑、顆粒、粉末、膠囊、軟膏或乳膏劑。在制備這些組合物時，可以添加一種或多種藥物載體。可藥用載體或其它添加劑的例子包括溶劑(如水或生理鹽水)、溶解劑(如乙醇、聚山梨酸酯、或Cremophor EL)、賦予等滲性的試劑、防腐劑、抗氧化劑、賦形劑(例如乳糖、淀粉、結(jié)晶纖維素、甘露醇、麥芽糖、海藻糖、磷酸氫鈣、輕硅酸酐或碳酸鈣)、粘合劑(如淀粉、聚乙烯吡咯烷酮、羥丙基纖維素、乙基纖維素、羧甲基纖維素或阿拉伯樹膠)、潤滑劑(如硬脂酸鎂、滑石、硬化油脂)或穩(wěn)定劑(如乳糖、甘露醇、麥芽糖、聚山梨酸酯、大粒凝膠或聚氧乙烯硬化的海貍油)。如果需要，還可以添加甘油、二甲基乙酰胺、乳酸鈉、表面活性劑、氫氧化鈉、乙二胺、乙醇胺、碳酸氫鈉、精氨酸、甲基葡萄糖胺或三氨基甲烷。如果希望組合物能夠緩慢釋放，可以使用可生物降解的聚合物如聚D，L-丙交酯-共聚-乙交酯或聚乙交酯作為主體基質(zhì)(參見例如美國專利5,417,986、4,675,381和4,450,150)。如前所述，藥物制劑如溶液、片劑、顆?；蚰z囊可以與這些成分一起形成。如果這些組合物需要口服，香料和色素也可以添加。
該免疫治療組合物可以以任何適合的途徑給藥，例如靜脈內(nèi)、動脈內(nèi)或局部注射(如腹膜內(nèi)、胸膜內(nèi)、皮下或肌內(nèi)注射)、口服、皮內(nèi)、舌下、表皮內(nèi)、鼻內(nèi)(如吸入)、肺內(nèi)、或直腸給藥。
免疫治療組合物的施用量依賴于例如特定的應(yīng)激蛋白/抗原組合物、是否有佐劑與組合物共同給藥、共給藥佐劑類型、給藥的方式和頻率、以及所希望的效果(如預(yù)防或治療)，可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員確定。免疫治療組合物的給藥量對成年人每次劑量來說，一般范圍在1μg到100mg之間。優(yōu)選情況是施用50-10,000μg融合蛋白(如大約100-5000μg，特別是大約500、1000、1500或2000μg)。如果佐劑與免疫治療成分一起施用，成年人每次劑量通常在1ng到100mg之間。當(dāng)需要重復(fù)給藥時，可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員確定。例如，在使用引發(fā)劑量后可以使用一次或多次加強注射，時間間隔以周或月計。在第一次免疫后3到12周可以使用一次加強注射，而在第一次加強注射后3到12周可以使用第二次加強注射，使用同樣的制劑或不同的制劑?？蓮膫€體中采集血清、PBL或PBMC，以檢測該免疫治療劑引發(fā)的針對含在融合蛋白中的HBV抗原的免疫應(yīng)答。分析針對特異性抗原的抗體或細(xì)胞毒性T細(xì)胞或分泌細(xì)胞因子的細(xì)胞的方法，在本領(lǐng)域已是眾所周知。如果需要，可以再次使用加強注射。通過改變組合物中的融合多肽的量，可以將免疫方案最適化以引發(fā)最強的免疫應(yīng)答。
當(dāng)然，多肽(單獨或作為融合蛋白的一部分)也可以通過給藥核酸，如病毒載體(如逆轉(zhuǎn)錄病毒或腺病毒載體)的方式遞送。
本發(fā)明的免疫治療劑也可以與一種或多種有抗HBV活性的化合物或組合物(HBV抗病毒劑)結(jié)合使用。例如，病人可以首先使用一種HBV抗病毒劑進行治療以降低HBV感染的嚴(yán)重性(其度量可以根據(jù)例如循環(huán)系統(tǒng)中的HBe抗原(HBV復(fù)制和高滴度病毒血癥的標(biāo)志)的減少或失去、抗HBe抗體的出現(xiàn)、血清HBVDNA的減少或消失或丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)水平的降低)。一旦癥狀適當(dāng)減輕，就可以對病人施用本發(fā)明的免疫治療劑?；蛘?，HBV抗病毒劑和免疫治療劑也可以基本上同時給藥(需要記住抗病毒劑和免疫治療劑可能有不同的給藥途徑)，或先給藥免疫治療劑，再用抗病毒劑治療。適合與免疫治療劑結(jié)合使用的抗病毒化合物或組合物包括干擾素-α2b(內(nèi)含子A，ScheringPlough)、聚乙二醇化的(pegylated)干擾素-α2b以及核苷類似物如拉米夫定[(-)-β-L-3’-硫-2’，3’-雙脫氧胞嘧啶核苷或3TC](Epivir-HBV，GlaxoWelcome)和病毒唑(RebetronTM，ICN Pharmaceuticals)，但并不以此為限。還有一些其它處于試驗階段的化合物也可能適用，包括hemtricitabine(2′，3′-雙脫氧-5′-氟-3′-硫基胞嘧啶核苷，F(xiàn)TC，coviracil，Triangle Pharmaceuticals)、克萊夫定(clevudine)(2′-氟-5-甲基-β-L-阿拉伯糖呋喃糖基尿嘧啶，L-FMAU，Triangle)、阿德福韋(adefovir)(9-(2-膦酰甲基)-腺嘌呤、PMEA、Gilead Sciences)、恩地卡韋(entecavir)(Bristol-Myers Squibb)、(-)-β-D-2，6-二氨基嘌呤二氧戊烷(DAPD)、β-L-2′，3′-雙脫氧-5-氟胞嘧啶(β-L-FddC)、β-L-2′，3′-雙脫氫-雙脫氧-5-氟胞嘧啶(β-L-Fd4C)和泛昔洛韋(famciclovir)。
可以相信，一個本領(lǐng)域技術(shù)人員基于上面公公開的內(nèi)容和下述的實施例，無需更多的精心研究，就可以充分地使用本發(fā)明。下面的實施例僅僅為了說明一個本領(lǐng)域技術(shù)人員如何能夠分離和使用融合多肽，并不以任何方式限制公開內(nèi)容的其它部分。所有在此公開內(nèi)容中引用的出版物在此引作參考。
實施例實施例1、HBV核心抗原-Hsp融合蛋白的構(gòu)建常用的構(gòu)建融合蛋白的方法和步驟可以參見W/O 94/29459、WO98/23735、WO 99/07860及其引用的參考文獻。
為HBV adw亞型編碼的基因獲自質(zhì)粒pBR/HBV(購白ATCC，ATCC 45020)。為全長蛋白編碼的序列示于圖1，全長蛋白的氨基酸序列示于圖2。
為全長牛分枝桿菌BCG的Hsp65蛋白編碼的基因獲自質(zhì)粒pET65(參見WO 99/07860)。
使用這些起始材料和適當(dāng)?shù)囊?，制備了下述的?gòu)建體并克隆到pET28a(Novagen)中用于蛋白生產(chǎn)1.1、hisHepCorT(149/87S97F)其DNA編碼截短的HBV核心抗原(第1-149位氨基酸)。該構(gòu)建體也包括含組氨酸標(biāo)記的N-端20個氨基酸序列。與野生型蛋白相比，該構(gòu)建體有兩個氨基酸改變第87位的天冬酰胺變?yōu)榻z氨酸，以及第97位的異亮氨酸變?yōu)楸奖彼帷８淖冞@兩個氨基酸是為了重現(xiàn)已知的小鼠CTL抗原決定簇。在截短的蛋白的C-端還添加了一個外源的天冬酰胺殘基。該DNA序列示于圖3，它編碼的氨基酸序列示于圖4。
1.2、hisHepCor(97F)Hsp65其DNA編碼一個融合蛋白，包含的全長HBV核心蛋白氨基酸與牛分枝桿菌BCG的Hsp65的N-端融合。該構(gòu)建體也包括一個含組氨酸標(biāo)記的N-端20個氨基酸序列以及第97位的異亮氨酸變?yōu)楸奖彼?。在HBV核心蛋白和Hsp65蛋白之間插入了兩個附加的殘基一個天冬酰胺和一個纈氨酸。該DNA序列示于圖5，它編碼的氨基酸序列示于圖6。
1.3、hisHepCorT(149/87S97F)Hsp65其DNA編碼一個融合蛋白，包含的HBV核心蛋白第1-149位的氨基酸與牛分枝桿菌BCG的Hsp65的N-端融合。該構(gòu)建體也包括一個含組氨酸標(biāo)記的N-端20個氨基酸序列，以及在HBV核心蛋白和Hsp65蛋白之間插入了一個附加的天冬酰胺殘基。該DNA序列示于圖7，它編碼的氨基酸序列示于圖8。
1.4、HepCorT(151/97F)Hsp65其DNA編碼一個融合蛋白，包含的HBV核心蛋白第1-151位的氨基酸與牛分枝桿菌BCG的Hsp65的N-端融合(在兩個序列之間沒有插入額外的氨基酸)。根據(jù)野生型序列對HBV核心序列進行了如下修飾第97位的異亮氨酸變?yōu)楸奖彼?。該DNA序列示于圖9，它編碼的氨基酸序列示于圖10。
1.5、HepCor(97F)Hsp65其DNA編碼一個融合蛋白，包含的全長HBV核心蛋白與牛分枝桿菌BCG的Hsp65的N-端融合(在兩個序列之間沒有插入額外的氨基酸)。同1.4的構(gòu)建體一樣，HBV核心蛋白第97位的異亮氨酸變?yōu)楸奖彼?。該DNA序列示于圖11，它編碼的氨基酸序列示于圖12。
1.6、HepCorT(151/97F)其DNA編碼一個截短的HBV核心抗原(第1-151位氨基酸)。該構(gòu)建體除了在第151位氨基酸截短了之外，與圖2所示的野生型adw蛋白相比有一個氨基酸變化第97位的異亮氨酸變?yōu)楸奖彼嵋灾噩F(xiàn)已知的小鼠CTL抗原決定簇。
1.7、HepCor(97F)其DNA編碼全長的HBV核心抗原。該構(gòu)建體與圖2所示的野生型adw蛋白相比有一個氨基酸變化第97位的異亮氨酸變?yōu)楸奖彼嵋灾噩F(xiàn)已知的小鼠CTL抗原決定簇。
使用其它的應(yīng)激蛋白，如結(jié)核分枝桿菌的Hsp70，也可以構(gòu)建其它構(gòu)建體。
在一些情況下可以對HBc分子進行修飾，在HBc基因產(chǎn)物中引入一個或多個氨基酸替代以重現(xiàn)已知的小鼠特異的CTL抗原決定簇。一個替代是第87位的氨基酸，天冬酰胺被絲氨酸替代。這個替代產(chǎn)生了被H-2Kd(HBc.Kd)限制的小鼠CTL抗原決定簇(87SYVNTNMGL95)(Kuhrober等，Int.Immunol.91203-1212，1997)。第二個替代是第97位的氨基酸，異亮氨酸被苯丙氨酸替代。這個替代產(chǎn)生了被H-2Kb(HBc.Kb)限制的鼠CTL抗原決定簇(93MGLKFRQL100)(Kuhober等，J.Immunol.1563687-3695，1996)。一個編碼了20個氨基酸，其中含有6個組氨酸殘基(組氨酸標(biāo)記)的DNA片段被加到一些構(gòu)建體的N-端以便于純化。沒有這些修飾的融合蛋白很容易制備。
實施例2、蛋白純化采用下列縮寫B(tài)CG指牛分枝桿菌變體卡介苗；CV指柱體積；ET指內(nèi)毒素；EU指內(nèi)毒素單位；IB指一種或多種包含體；MT指結(jié)核分枝桿菌；以及PBS指磷酸鹽緩沖液。
所有的構(gòu)建體在15升發(fā)酵罐(Braun ED)中培養(yǎng)。在用于蛋白純化前，細(xì)菌細(xì)胞糊儲存于-70℃。
2.1、hisHepCorT(149/87S97F)的純化細(xì)胞裂解大約277克冷凍的細(xì)胞糊與800mL裂解緩沖液(30mMTRIS、10mM 2-巰基乙醇、2mM EDTA、0.2mM PMSF、pH8.5)混合。然后加入溶菌酶至200μg/mL，再加入50μL BenzonaseTM。細(xì)胞在-70℃冷凍過夜，然后融化1小時，等分樣品于50mL離心管中，置于冰上，使用配有0.5英寸尖頭的BRANSON Sonifier II型超聲破碎器按照設(shè)置9進行超聲破壁，45秒破碎6次。
在4℃以17000RPM離心(Beckman，Avanti J-30，JA30.50轉(zhuǎn)頭)20分鐘從而將細(xì)胞碎片和IB與上清液分開。每管中的沉淀重懸浮于25mL洗滌緩沖液(30mM TRIS、10mM 2-巰基乙醇、2％(v/v)Triton X-100、pH8.5)中。4℃以22000 RPM離心20分鐘后，棄去上清液，加入20mL含8M尿素、30mM TRIS、10mM 2-巰基乙醇、1mM EDTA、0.2mMPMSF、pH 8.5的溶液，4℃保溫過夜。20000RPM離心30分鐘收獲含有溶解的IB的上清液，然后分成兩份冷凍于-70℃。
鎳螯合層析將250mL螯合的Sepharose Fast Flow(Amersham-Pharmacia)裝入XK50/30柱(Amersham-Pharmacia)。樹脂用3倍CV的下述每種溶液洗滌50mM EDTA、Milli-QTM級水、0.5M NaOH、2MNaCI、Milli-QTM級水、70％(v/v)乙醇和Milli-QTM級水。然后，樹脂用200mM NiSO4載荷，用Milli-QTM級水洗滌，并用5倍CV的起始緩沖液(6M鹽酸胍、30mM TRIS、2mM 2-巰基乙醇、20mM咪唑、pH8.5)平衡。
將一部分樣品以5mL/min速度上柱，然后用起始緩沖液以10mL/min速度洗滌直到在280nm處監(jiān)測的吸收達(dá)到基線。為了除去ET，柱子用5倍CV的含6M鹽酸胍、30mM TRIS、2mM 2-巰基乙醇、20mM咪唑、2％(v/v)Triton X-100、pH8.5的溶液洗滌。隨后柱子用含6M尿素、30mM TRIS、2mM 2-巰基乙醇、20mM咪唑、pH8.5的溶液洗滌，然后用5倍CV梯度為0-500mM咪唑的6M尿素、30mMTRIS、2mM 2-巰基乙醇、20mM咪唑、pH8.5溶液洗脫蛋白，流速5mL/min。
將第二部分樣品重復(fù)這個層析步驟，并把含有相對純的蛋白的級分合并。
Source 15Q陰離子交換層析將60mL Source 15Q樹脂(Amersham-Pharmacia)裝入XK26/40柱(Amersham-Pharmacia)。樹脂用下述溶液以5mL/min的流速洗滌2倍CV Milli-QTM級水、3倍CV 1MNaOH、3倍CV Milli-QTM級水、2倍CV NaCl、2倍CV Milli-QTM級水、2倍CV 10％(v/v)乙酸和40％(v/v)異丙醇的混合液，、2倍CVMilli-QTM級水，然后用3倍CV的起始緩沖液(6M尿素、30mM TRIS、10mM 2-巰基乙醇、1mM EDTA、pH8.5)平衡。
上一步中合并的樣品以0.5mL/min流速上柱，然后用起始緩沖液以6mL/min速度洗滌直到在280nm處監(jiān)測的吸收達(dá)到基線。然后柱子用10倍CV含2％(v/v)Triton X-100的起始緩沖液洗滌。用11倍CV梯度為0-600mM NaCl的起始緩沖液洗脫蛋白。
重復(fù)這一層析步驟，并將含有相對純的蛋白的級分合并。
Source 15S陽離子交換層析將50mL Source 15S樹脂(Amersham-Pharmacia)裝入XK26/40柱(Amersham-Pharmacia)。樹脂用下述溶液以5mL/min的流速洗滌2倍CV 1M NaOH、3倍CVMilli-QTM級水、2倍CV NaCl、2倍CV Milli-QTM級水、2倍CV 10％(v/v)乙酸和40％(v/v)異丙醇的混合液、2倍CV Milli-QTM級水，然后用3倍CV的起始緩沖液(6M尿素、23mM乙酸鈉、10mM 2-巰基乙醇、1mMEDTA、pH4.8)平衡。
上一步中合并的樣品以3mL/min流速上柱，然后用起始緩沖液以3mL/min速度洗滌直到在280nm處監(jiān)測的吸收達(dá)到基線。然后用15倍CV梯度為0-1000mM NaCl的起始緩沖液以6mL/min流速將蛋白部分洗脫，剩余部分用含6M鹽酸胍、30mM TRIS、10mM 2-巰基乙醇、1mM EDTA、pH8.5的溶液洗脫。
透析和樣品配制然后，合并的樣品用下述溶液依次透析1、4L的6M尿素、30mM TRIS-HCl pH8.5、10mM 2-巰基乙醇、1mM EDTA、0.8M精氨酸，4℃過夜。
2、4L的3M尿素、30mM TRIS-HCl pH8.5、2mM 2-巰基乙醇、1mM EDTA、25％(w/v)蔗糖，4℃過夜。
3、2L的30mM TRIS-HCl pH8.5、4.5mM還原型谷胱甘肽、0.5mM氧化型谷胱甘肽、0.8M精氨酸、25％(w/v)蔗糖，4℃過夜。
4、2L的10mM PBS pH7.4、4.5mM還原型谷胱甘肽、0.5mM氧化型谷胱甘肽、25％(w/v)蔗糖，4℃過夜。
5、重復(fù)步驟4。
假設(shè)每一個透析步驟完成時平衡已經(jīng)達(dá)到，各種成分的終濃度是PBS 10mM、還原型谷胱甘肽4.5mM、氧化型谷胱甘肽0.5mM、精氨酸≤1.48mM、尿素≤0.25mM、蔗糖730mM或25％(w/v)。
2.2、hisHepCorT(149/87S97F)Hsp65的純化細(xì)胞裂解將79克冷凍的細(xì)胞糊與1000mL裂解緩沖液(30mMTRIS、10mM 2-巰基乙醇、pH7.5)混合。裂解液在-70℃冷凍過夜。然后融化1小時，加入溶菌酶至200μg/mL，細(xì)胞溫育1小時。加入幾種蛋白酶抑制劑的混合液(抑肽酶、亮抑酶肽和抑胃酶肽各40mg/mL)和15μL BenzonaseTM。裂解液置于一個250mL的Rosette細(xì)胞冷卻池(Fisher)中，使用配有0.5英寸尖頭的BRANSON Sonifier II型超聲破碎器按照設(shè)置7進行超聲破壁，60秒破碎6次。
在4℃以23000RPM離心20分鐘(Beckman，Avanti J-30，JA30.50轉(zhuǎn)頭)從而將細(xì)胞碎片和IB與上清液分開。在上清液中加入鹽酸胍至濃度為6M，總體積1,400mL。樣品分成一份400mL和兩份500mL。
鎳螯合層析將187mL螯合的Sepharose Fast Flow(Amersham-Pharmacia)裝入XK50/30柱(Amersham-Pharmacia)。樹脂預(yù)先已按照制造商推薦的方法再生，用5倍CV的起始緩沖液(6M鹽酸胍、50mM咪唑、30mM TRIS、1mM 2-巰基乙醇、pH7.5)平衡。
將400mL樣品以10mL/min速度上柱，然后用起始緩沖液以洗滌直到在280nm處監(jiān)測的吸收達(dá)到基線。為了除去ET，柱子用5倍CV的含6M鹽酸胍、30mM TRIS、1mM 2-巰基乙醇、2％(v/v)Triton X-100、pH7.5的溶液洗滌。隨后柱子用含8M尿素、30mM TRIS、pH8.5的溶液洗滌。接著用梯度為0-500mM咪唑的8M尿素、30mM TRIS、1mM 2-巰基乙醇、pH7.5的溶液洗脫蛋白。
將從上一步得到的兩個500mL樣品組分重復(fù)這個層析步驟。從這三次操作中的獲得的級分合并。
Source 30Q陰離子交換層析將167mL Source 15Q樹脂(Amersham-Pharmacia)裝入XK50/30柱(Amersham-Pharmacia)。樹脂用5倍CV下述溶液洗滌以獲得再生2M NaCl、1M NaOH、Milli-QTM級水、40％(v/v)異丙醇、10％(v/v)乙酸和Milli-QTM級水。然后柱子用3倍CV的起始緩沖液(6M尿素、30mM TRIS、10mM 2-巰基乙醇、pH7.5)平衡。
上一步中合并的級分以10mL/min流速上柱，然后用起始緩沖液洗滌直到在214nm、254nm和280nm處監(jiān)測的吸收達(dá)到基線。以6mL/min流速用梯度為0-500mM NaCl的起始緩沖液洗脫蛋白。將含有所需蛋白的級分合并。
陶瓷羥基磷灰石層析將53mL陶瓷羥基磷灰石樹脂裝入XK26/40柱(Amersham-Pharmacia)，樹脂用3倍CV含1M NaOH和0.5M磷酸鈉、pH6.8的溶液再生。柱子然后用含6M尿素、20mM磷酸鈉、pH6.8的溶液平衡。
前一柱中合并的級分以5mL/min流速上柱，然后用含6M尿素、20mM磷酸鈉、pH6.8的溶液洗滌直到在214nm、254nm和280nm處監(jiān)測的吸收達(dá)到穩(wěn)定的基線。不純物結(jié)合于柱子上，而hisHepCorT(149/87S97F)Hsp65則在穿透液中。
透析和樣品配制將上一層析中的穿透液合并(250mL)，用下述溶液依次透析1、4L的3M鹽酸胍、10mM磷酸鈉、0.8M精氨酸、4.5mM還原型谷胱甘肽、0.5mM氧化型谷胱甘肽、25％(w/v)蔗糖，4℃過夜。
2、4L的10mM磷酸鈉、4.5mM還原型谷胱甘肽、0.5mM氧化型谷胱甘肽、25％(w/v)蔗糖，4℃過夜。
3、重復(fù)上一步驟。
假設(shè)每一個透析步驟完成時平衡已經(jīng)達(dá)到，各種成分的終濃度是磷酸鈉10mM、尿素1.85mM、還原型谷胱甘肽4.5mM、氧化型谷胱甘肽0.5mM、蔗糖730mM或25％(w/v)。
凝膠過濾層析HiLoad 26/60 Superdex 200(Amersham-Pharmacia)凝膠過濾柱，由制造商預(yù)裝，用1M NaOH再生，然后用含10mM磷酸鈉、4.5mM還原型谷胱甘肽、0.5mM氧化型谷胱甘肽、25％(w/v)蔗糖、pH7.4的溶液平衡。
透析后的樣品分成三份(30mL、20mL和20mL)，使用平衡緩沖液分別上柱進行層析，流速1.5或2mL/min，并將含有蛋白的級分合并。
2.3、HepCorT(151/97F)Hsp65的純化細(xì)胞裂解將500克冷凍的細(xì)胞糊與2500mL裂解緩沖液(30mMTRIS、10mM 2-巰基乙醇、2mM EDTA、0.1mM PMSF、10mg/mL抑肽酶、10mg/mL亮抑酶肽、5mM對氨基苯甲脒、0.2mg/mL溶菌酶、pH7.5)混合，然后在-70℃冷凍至少2小時。
冷凍的細(xì)胞懸浮液在37℃融化，置于冰上，進行超聲(BransonSonifier 450，3/4英寸尖頭)破壁4次，共1分鐘。裂解液以15,000g離心，可溶組分在64,000g離心使其澄清，保留可溶性樣品。在可溶組分中加入6M尿素后，將其分為三等份。
Source 30Q層析將190mL Source 15Q樹脂(Amersham-Pharmacia)裝入XK50/30柱(Amersham-Pharmacia)，柱子再生后用3倍CV的起始緩沖液(6M尿素、30mM TRIS、10mM 2-巰基乙醇、1mM EDTA、pH7.5)平衡。
將一份樣品上柱。樹脂用起始緩沖液洗滌直到在280nm、254nm和214nm處監(jiān)測的吸收達(dá)到基線，然后用5倍CV線性梯度為0-500mMNaCl的起始緩沖液洗脫蛋白。將含有HepCorT(151/97F)Hsp65的級分合并。
將其它兩份樣品重復(fù)上述層析步驟。所有三部分樣品的合并液合在一起，用含6M尿素、25mM乙酸鈉、10mM 2-巰基乙醇、1mM EDTA、pH5.5的溶液透析。然后將樣品分為兩部分。
Source 15S層析pH5.5將50mL Source 15S樹脂(Amersham-Pharmacia)裝入XK26/40柱(Amersham-Pharmacia)，柱子再生后用S1起始緩沖液(6M尿素、25mM乙酸鈉、10mM 2-巰基乙醇、1mM EDTA、pH5.5)平衡。
將一份Source 30Q樣品上柱，a)用S1起始緩沖液洗滌直到在280nm處的基線穩(wěn)定，b)用10倍CV含有2％(v/v)Triton X-100的S1起始緩沖液洗滌，以及c)用S1起始緩沖液洗滌直到在280nm處的基線穩(wěn)定。最后用18倍CV梯度為0-230mM NaCl洗脫蛋白。殘留在柱上的蛋白用1M NaCl清洗步驟除去。
將第二份Source 30Q樣品重復(fù)上述層析步驟。把含有HepCorT(151/97F)Hsp65的級分合并，用濃乙酸將pH調(diào)整到4.8，分成兩份。
Source 15S層析pH4.8將Source 15S柱再生，然后用S2起始緩沖液(6M尿素、25mM乙酸鈉、10mM 2-巰基乙醇、1mM EDTA、pH4.8)平衡。
將一份Source 15S樣品上柱，a)用S2起始緩沖液洗滌直到在280nm處的基線穩(wěn)定，b)用10倍CV含有2％(v/v)Triton X-100的S2起始緩沖液洗滌，以及c)用S2起始緩沖液洗滌直到在280nm處的基線穩(wěn)定。
用10倍CV線性梯度為0-500mM NaCl的S2起始緩沖液洗脫蛋白。殘留在柱上的蛋白用2倍CV 1M NaCl和3倍CV 6M鹽酸胍清洗液洗滌步驟除去。將含有HepCorT(151/97F)Hsp65的級分合并。
Source 15S層析pH4.8-除去ET將上一步合并的級分以S2起始緩沖液中透析，再次上樣至Source 15S柱。
將Source 15S柱再生，并用S2起始緩沖液平衡。將一半Source 15S樣品上柱，首先用S2起始緩沖液洗滌直到在280nm處的基線穩(wěn)定，再用10倍CV含有2％(v/v)Triton X-100的S2起始緩沖液洗滌，然后再用S2起始緩沖液洗滌直到在280nm處的基線穩(wěn)定。
用4倍CV 1M NaCl和3倍CV 6M鹽酸胍清洗液將蛋白洗脫。將含有HepCorT(151/97F)Hsp65的級分合并，在DPBS、10％(w/v)蔗糖中分三步透析。
2.4、HepCor(97F)Hsp65的純化細(xì)胞裂解將200克冷凍的細(xì)胞糊與600mL裂解緩沖液(30mMTRIS、20mM 2-巰基乙醇、5mM EDTA、0.1mM PMSF、0.2mg/mL溶菌酶、pH7.5)混合，然后在4℃攪動大約30分鐘。
細(xì)胞懸浮液進行超聲破壁(Branson Sonifier 450，3/4英寸尖頭，設(shè)置9)1分鐘，共4次。裂解液在18,500g離心，保留可溶性樣品。蛋白溶液在4℃以108,850g離心20分鐘使其澄清。
硫酸銨沉淀在澄清的蛋白溶液中加入硫酸銨至飽和度為25％，10,000g離心收集蛋白。將蛋白沉淀重懸浮于裂解緩沖液中。
乙酸沉淀將蛋白溶液用1M乙酸仔細(xì)調(diào)整到pH4.5，然后在4℃攪動20分鐘。4℃以10,000g離心10分鐘收集蛋白沉淀。將蛋白沉淀重懸浮于Q緩沖液A(6M尿素、30mM TRIS、10mM 2-巰基乙醇、5mM EDTA、0.1mM PMSF、pH8.5)中。
Q瓊脂糖高效色譜將含有150mL Q瓊脂糖高效樹脂(Amersham-Pharmacia)的XK50/30柱(Amersham-Pharmacia)再生，然后用3-5倍CV的Q緩沖液A平衡。將樣品上柱，收集穿透液。加入2-巰基乙醇至150mM，合并的蛋自在4℃放置1小時。
第二次Q瓊脂糖高效色譜將Q瓊脂糖高效柱再生，然后用Q緩沖液A平衡。
將第一次Q瓊脂糖快速柱中的穿透液上柱，再次收集穿透液。加入2-巰基乙醇至300mM。加入鹽酸胍至6M。然后將蛋白樣品在室溫放置72小時，然后用0.22μM過濾器過濾。
Superdex 200凝膠過濾層析將含有1800mL Superdex 200樹脂(Amersham-Pharmacia)的XK50/90柱(Amersham-Pharmacia)用2倍CV的GF緩沖液(6M尿素、30mM TRIS、20mM 2-巰基乙醇、2mM EDTA、pH7.5)平衡。
將70mL樣品分為10等份。然后分別上柱處理，將含有HepCor(97F)Hsp65的級分合并。
Sephadex 25脫鹽凝膠過濾層析將含有300mL Sephadex 25樹脂(Amersham-Pharmacia)的XK50/30柱(Amersham-Pharmacia)再生，然后用GF25緩沖液(6M尿素、50mM乙酸、5mM NaOH、1mM EDTA、10mM 2-巰基乙醇、pH4.7)平衡。
將樣品分為75mL的部分，然后分別上柱處理。將含有蛋白的級分合并。
SP瓊脂糖高效色譜將275mL SP瓊脂糖高效樹脂(Amersham-Pharmacia)再生，然后用SP緩沖液A(6M尿素、50mM乙酸、5mMNaOH、1mM EDTA、10mM 2-巰基乙醇、pH4.7)平衡。
上一步獲得的合并的樣品與樹脂混合，于室溫在水平搖床上震蕩30分鐘。然后將漿液裝入XK50/30柱(Amersham-Pharmacia)，用2倍CV SP緩沖液A洗滌。然后用15倍CV含2％(v/v)Triton X-100的SP緩沖液A洗滌柱子。用5倍CV SP緩沖液A和2倍CV含1M NaCl的SP緩沖液A洗滌柱子以除去去污劑。最后用含6M尿素、10mMTRIS、pH7.5的溶液將蛋白無梯度洗脫。
銅螯合瓊脂糖快速色譜將含有180mL銅螯合瓊脂糖快速樹脂(Amersham-Pharmacia)的XK50/30柱(Amersham-Pharmacia)再生，用硫酸銅負(fù)載，然后用2倍CV Cu緩沖液A(6M鹽酸胍、30mM磷酸鈉、pH7.0)平衡。
將樣品上柱，用3倍CV Cu緩沖液A洗滌，然后用5倍CV含2％(v/v)Triton X-100的Cu緩沖液A洗滌，最后用3倍CV Cu緩沖液A洗滌以除去去污劑。用含300mM咪唑的Cu緩沖液A洗脫蛋白。然后將蛋白在DPBS中分五步進行透析。
2.5、HepCorT(151/97F)的純化細(xì)胞裂解將425克冷凍的細(xì)胞糊與2.5L冰冷的含10mM EDTA、100mM NaCl、1mM 2-巰基乙醇、pH8.0的溶液混合。細(xì)胞懸浮液混合后，以10,500g離心10分鐘收集細(xì)胞。然后將細(xì)胞重懸浮于含有50mM NaCl、1mM EDTA、1mM 2-巰基乙醇、0.2g/mL溶菌酶、pH8.0的溶液中，混合，在冰上放置1小時。
將細(xì)胞懸浮液進行超聲破壁(Branson Sonifier 450，3/4英寸尖頭，設(shè)置8)2分鐘，共2次。裂解液以18,500g離心，保留可溶性樣品。
硫酸銨沉淀在可溶性級分中加入硫酸銨至飽和度為25％，10,000g離心40分鐘使雜質(zhì)沉淀。在上清液中繼續(xù)加入硫酸銨至飽和度為35％?；旌?0分鐘后，10,000g離心30分鐘收集沉淀蛋白。將蛋白沉淀重懸浮于含有1mM EDTA、1mM 2-巰基乙醇、pH8.0的溶液中，以76,500g離心20分鐘使其澄清。
第二次硫酸銨沉淀第一次沉淀得到的樣品溶解于含有1mMEDTA、1mM 2-巰基乙醇、pH8.0的溶液中，按照上述的同樣步驟再處理一遍。
苯基瓊脂糖快速色譜將含有200mL苯基瓊脂糖快速樹脂(Amersham-Pharmacia)的XK50/30柱(Amersham-Pharmacia)再生，然后用含有0.85M硫酸銨、20mM磷酸鈉、1mM EDTA、1mM 2-巰基乙醇、pH6.8的溶液平衡。
在樣品中加入含1M磷酸鈉、1mM EDTA、1mM BME、pH6.8的溶液直至磷酸鈉為10mM，加入硫酸銨至20％飽和度。將一半樣品上柱，用平衡緩沖液洗滌直到在280nm處的吸收達(dá)到基線。然后將蛋白用300mL溶液進行負(fù)線性梯度洗脫，下限溶液為20mM磷酸鈉、1mMEDTA、1mM 2-巰基乙醇、pH6.8。將含有HepCorT(151/97F)的級分合并。
第二次苯基瓊脂糖快速層析將柱子再生，并用含有0.85M硫酸銨、20mM磷酸鈉、1mM EDTA、ImM 2-巰基乙醇、pH6.8的溶液平衡。
從第一次苯基瓊脂糖快速柱獲得的合并樣品用平衡緩沖液稀釋到2.5mg蛋白/mL。然后將稀釋的樣品上柱，用平衡緩沖液洗滌直到在280nm處的基線穩(wěn)定，然后將蛋白用300mL溶液進行負(fù)線性梯度洗脫，下限溶液為20mM磷酸鈉、1mM EDTA、1mM 2-巰基乙醇、pH6.8。
將含有HepCorT(151/97F)的級分合并，加入硫酸銨至35％飽和度，然后以12,000g離心50分鐘收集蛋白沉淀。將沉淀蛋白重新溶解在700mL含8M尿素、10mM乙酸鈉、30mM乙酸、25mM NaCl、0.5mMEDTA、5mM 2-巰基乙醇、pH8.0的溶液中。
SP瓊脂糖快速色譜將含有180mL SP瓊脂糖快速樹脂(Amersham-Pharmacia)的XK50/30柱(Amersham-Pharmacia)再生，然后用5倍CV的含8M尿素、10mM乙酸鈉、30mM乙酸、25mM NaCl、0.5mM EDTA、5mM 2-巰基乙醇、pH8.0的溶液平衡。
將一半樣品上柱，用平衡緩沖液洗滌直到在280nm處的吸收達(dá)到基線。然后將蛋白用600mL體積進行線性梯度洗脫，從平衡緩沖液洗脫到10mM乙酸鈉、30mM乙酸、1M NaCl、5mM 2-巰基乙醇、0.5mMEDTA。最后用6M鹽酸胍、50mM TRIS、pH8.5的溶液將柱子洗凈。
將另一半樣品重復(fù)上述步驟，然后將含有HepCorT的級分合并，并用含6M尿素、20mM TRIS、pH8.5、0.5mM EDTA、5mM 2-巰基乙醇、pH8.5的溶液透析，最后用含6M尿素、20mM TRIS、5mM 2-巰基乙醇、pH8.5的溶液透析。
Source 30Q層析將含有150mL Source 30Q樹脂(Amersham-Pharmacia)的XK50/30柱(Amersham-Pharmacia)再生，然后用4倍CV的平衡緩沖液(6M尿素、20mM TRIS、5mM 2-巰基乙醇、pH8.5)平衡。
將三分之一樣品上柱，用95％平衡緩沖液和5％洗脫緩沖液(6M尿素、1M NaCl、20mM TRIS、5mM 2-巰基乙醇、pH8.5)洗滌，然后將蛋白用1L溶液進行線性梯度洗脫，直至100％洗脫緩沖液。
將第二和第三部分樣品進行相應(yīng)處理。將含有HepCorT的級分合并，用含6M尿素、20mM乙酸鈉、20mM乙酸、0.5mM EDTA、1mM2-巰基乙醇、pH8.0的溶液透析。
SP瓊脂糖高效色譜將含有180mL SP瓊脂糖高效樹脂(Amersham-Pharmacia)的XK50/30柱(Amersham-Pharmacia)再生，然后用5倍CV的含6M尿素、20mM乙酸鈉、20mM乙酸、0.5mM EDTA、1mM 2-巰基乙醇、pH8.0的溶液平衡。
將一半樣品上柱，用平衡緩沖液洗滌直到在280nm處的吸收達(dá)到基線。
雜質(zhì)用兩種線性梯度洗脫下來，即梯度為0-1M NaCl的平衡緩沖液，然后以線性梯度洗脫至洗脫緩沖液2(6M尿素、40mM乙酸鈉、10mM乙酸、0.5mM EDTA、1mM 2-巰基乙醇、pH8.0)中。柱子用含2％(v/v)Triton X-100的洗脫緩沖液2洗滌，然后用10倍CV的洗脫緩沖液除去去污劑。將蛋白進行線性梯度洗脫，直到含6M尿素、50mMTRIS、0.5mM EDTA、5mM 2-巰基乙醇、pH8.0的溶液。
將另一半樣品重復(fù)上述步驟，把含有HepCorT(151/9F)的級分合并，蛋白用含5mM磷酸鈉、50mM NaCl、3.1mM尿素、20％蔗糖、pH8.5的溶液分兩步透析。
2.6、HepCor(97F)的純化細(xì)胞裂解將100克冷凍的細(xì)胞糊與400mL冰冷的含5mMEDTA、5mM 2-巰基乙醇、pH8.0的溶液混合。細(xì)胞懸浮液混合后，加入0.2g/mL溶菌酶，將懸浮液混合，在冰上放置1小時。
細(xì)胞懸浮液進行超聲破壁(Branson Sonifier 450，3/4英寸尖頭，設(shè)置8)2次，共2分鐘。然后加入200mL冰冷的含20mM乙酸鈉、5mM乙酸、3M硫酸銨的溶液并充分混合。懸浮液超聲(Branson Sonifier450，3/4英寸尖頭，設(shè)置8)破碎3分鐘。最后，將裂解液以18,500g離心，保留可溶性樣品。
硫酸銨沉淀可溶性級分用1L的0.85M硫酸銨稀釋。按70g/L的量一邊混合一邊緩慢加入固體硫酸銨。繼續(xù)混合30分鐘后，將懸浮液以18,500g離心60分鐘。其后，將沉淀重新懸浮于500mL含1mMEDTA、5mM 2-巰基乙醇的溶液中。按113.4g/L的量一邊混合一邊緩慢加入硫酸銨；將溶液繼續(xù)混合30分鐘。以76,500g離心20分鐘收集蛋白沉淀。
加入含1M磷酸鈉、1mM EDTA、5mM 2-巰基乙醇、20％飽和的硫酸銨的溶液重新溶解沉淀，直到磷酸鈉終濃度為5mM。
苯基瓊脂糖快速色譜將含有200mL苯基瓊脂糖快速樹脂(Amersham-Pharmacia)的XK50/30柱(Amersham-Pharmacia)再生，然后用含有0.85M硫酸銨、5mM磷酸鈉、1mM EDTA、5mM 2-巰基乙醇、pH6.8的溶液平衡。
將樣品上柱，用平衡緩沖液洗滌直到在280nm處的吸收達(dá)到基線。然后將蛋白用階段梯度進行洗脫，直到6M尿素。將含有HepCorT的級分合并，加入硫酸銨到32％飽和度使蛋白沉淀。以12,100g離心50分鐘收集蛋白后，將其重新溶解在500mL含8M尿素、5mM TRIS、5mM 2-巰基乙醇、pH7.5的溶液中。
Source 30Q層析將含有150mL Source 30Q樹脂(Amersham-Pharmacia)的XK50/30柱(Amersham-Pharmacia)再生，然后用4倍CV的平衡緩沖液(6M尿素、5mM TRIS、5mM 2-巰基乙醇、pH7.5)平衡。
將樣品上柱，用平衡緩沖液洗滌。用線性梯度從平衡緩沖液到含6M尿素、1M NaCl、5mM TRIS、5mM 2-巰基乙醇、pH7.5的溶液將蛋白洗脫。把含有HepCor(97F)的級分合并，分成三份。
SP瓊脂糖高效色譜將含有190mL SP瓊脂糖高效樹脂(Amersham-Pharmacia)的XK50/30柱(Amersham-Pharmacia)再生，然后用5倍CV的含6M尿素、30mM乙酸鈉、10mM乙酸、1mM EDTA、5mM 2-巰基乙醇、pH8.0的溶液平衡。
將一部分樣品上柱，用20倍CV含6M尿素、40mM乙酸鈉、10mM乙酸、0.5mM EDTA、1mM 2-巰基乙醇、2％(v/v)Triton X-100、pH8.0的溶液洗滌。然后為了除去Triton X-100，用10倍CV含6M尿素、40mM乙酸鈉、10mM乙酸、0.5mM EDTA、1mM 2-巰基乙醇、pH8.0的溶液洗滌柱子。
讓蛋白以600mL的線性梯度洗脫到含6M尿素、20mM TRIS、1MNaCl、1mM 2-巰基乙醇、0.5mM EDTA、pH8.5的溶液。
將其它兩部分樣品重復(fù)上述步驟，然后將含有HepCor(97F)的級分合并。將蛋白用含40mM乙酸鈉、0.05mM DTT、pH6.5的溶液分5步透析。
實施例3、小鼠CTL活性的引發(fā)小鼠C57BL/6(H-2b)小鼠購自Charles River Laboratories(St.Constant，PQ)。
細(xì)胞系EL4胸腺瘤細(xì)胞系(H-2b)來自ATCC，培養(yǎng)在含有10％FBS和2mM L-谷氨酰胺的Dulbecco修飾Eagles培養(yǎng)基(DMEM-10)。表達(dá)HBc抗原的EL4.HBc.1D7細(xì)胞來自Stressgen，是通過用編碼全長HBc基因和新霉素抗性標(biāo)記的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染EL4細(xì)胞得到的。全長HBc抗原基因從HBV adw亞型克隆得到，并修飾成編碼已知的鼠H-2Kb和H-2Kd限制性CTL抗原決定簇序列(對野生型adw蛋白的兩個氨基酸進行了改變第87位的氨基酸從天冬酰胺變?yōu)榻z氨酸，以及第97位的氨基酸從異亮氨酸變?yōu)楸奖彼?。這兩個改變能夠重現(xiàn)已知的小鼠CTL抗原決定簇)。轉(zhuǎn)染的細(xì)胞在含有1500μg/mL G418的DMEM-10中篩選，通過有限稀釋克隆獲得了EL4.HBc.1D7克隆。使用HBc特異性抗體通過Western免疫印跡分析證實了HBc蛋白在該細(xì)胞系中的表達(dá)。H-2Kb限制性CTL抗原決定簇對I型MHC的呈遞通過對該抗原決定簇特異的CTL系的溶胞作用加以證實。FACS分析表明在轉(zhuǎn)染子中有高水平的I型MHC表達(dá)，與親本細(xì)胞系相似。
小鼠CTL活性的引發(fā)用緩沖液或2.9nmol下列成分之一免疫(通過在頸背或肩胛間的部位皮下注射)小鼠HepCorT(151/97F)Hsp65、HepCorT(97F)Hsp65、hisHepCorT(149/87S97F)Hsp65、HepCorT(151/97F)或HepCorT(97F)。在免疫7天后，使用吸入CO2或頸錯位的方法無痛處死小鼠，并將脾臟取出。在CTL培養(yǎng)基(RPMI-1640、10％FBS、2mML-谷氨酰胺、1mM丙酮酸鈉、50μM 2-ME和45μg/mL慶大霉素)中制備脾細(xì)胞的單細(xì)胞懸浮液。在存在1μM HBc CTL抗原決定簇肽HBc.93-100.Kb、MGLKFRQL(Kuhober等，J.Immunol.1563687-95，1996)的情況下通過在37℃/5％CO2下培養(yǎng)，使30×106個活的淋巴細(xì)胞重新刺激。用于重新刺激作用的這個合成肽(由Research Genetics，Huntsville，AL合成)含有由H-2Kb限制的鼠CTL抗原決定簇。
效應(yīng)細(xì)胞在7天后收獲，與51Cr標(biāo)記的靶細(xì)胞一起共同培養(yǎng)在U形底的96孔微量滴定板中。對照EL4靶細(xì)胞是用一個無關(guān)的H-2Kb(MUT-1.52-59.Kb)限制性肽(參見圖13)預(yù)脈沖的細(xì)胞。靶細(xì)胞是用HBc.93-100.Kb肽(參見圖14)預(yù)脈沖的EL4細(xì)胞或用EL4.HBc.1D7細(xì)胞預(yù)脈沖的EL4細(xì)胞(參見圖15)。CTL(100μL)是與5×103或1×104個靶細(xì)胞(100μL)以各種各樣的效應(yīng)物靶細(xì)胞比率(100∶1、33∶1或11∶1)進行培養(yǎng)的。為了確定自發(fā)釋放標(biāo)記，在總體積200μL的CTL培養(yǎng)基中培養(yǎng)了同樣數(shù)量的靶細(xì)胞，但不含效應(yīng)細(xì)胞。通過向同樣數(shù)量的靶細(xì)胞中加入100μL Triton X-100(2％v/v水溶液)確定總的釋放標(biāo)記。培養(yǎng)4小時后，微量滴定板以200×g離心5分鐘，收集100μL培養(yǎng)的上清液。用閃爍計數(shù)器測定釋放的放射性。按照下述公式計算校正的溶胞百分?jǐn)?shù)校正的溶胞百分?jǐn)?shù)(CL)＝100×(CPM測試-CPM自發(fā))/(CPM總-CPM自發(fā))。
細(xì)胞因子分析為了定量測定重新刺激的CTL釋放的γ-干擾素(INF-γ)和腫瘤壞死因子α(TNF-α)，將效應(yīng)細(xì)胞接種于U形底的96孔微量滴定板中，并與1μM HBc.93-100.Kb肽和靶細(xì)胞以效應(yīng)物靶為100∶1、33∶1或11∶1的比率共同培養(yǎng)。培養(yǎng)4小時或24小時后收集上清液，通過三明治酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)方法分析INF-γ(圖16)或TNF-α(圖17)。
權(quán)利要求
1.一種分離的融合蛋白，其含有應(yīng)激蛋白或其部分以及乙肝病毒(HBV)核心抗原，其中所述融合蛋白當(dāng)施用給個體時，誘導(dǎo)或增強針對HBV核心抗原的免疫應(yīng)答。
2.權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其中應(yīng)激蛋白是熱休克蛋白。
3.權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其中應(yīng)激蛋白選自Hsp10、Hsp40、Hsp60、Hsp70、Hsp90、Hsp100-200、Hsp100、Lon、TF55、Hsp40、FKBPs、親環(huán)蛋白、Hsp20-30、ClpP、GrpE、泛素、鈣聯(lián)接蛋白或蛋白二硫鍵異構(gòu)酶或小分子量應(yīng)激蛋白家族。
4.權(quán)利要求3所述的融合蛋白，其中應(yīng)激蛋白是牛分枝桿菌(M.bovis)BCG的hsp65。
5.權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其中HBV核心抗原包含HBV核心抗原片段，該片段缺失了全部或部分C-末端富含精氨酸的結(jié)構(gòu)域。
6.權(quán)利要求5所述的融合蛋白，其中HBV核心抗原片段含有HBVadw株核心抗原的第1-149位氨基酸或第1-151位氨基酸。
7.一種融合蛋白，其含有圖6、8、10或12任何一個所示的序列。
8.一種藥物組合物，其含有權(quán)利要求1-7中任一項所述的融合蛋白。
9.權(quán)利要求8所述的藥物組合物，其進一步含有可藥用載體或賦形劑。
10.一種分離的核酸，其包含的序列編碼權(quán)利要求1-7中任一項所述的融合蛋白。
11.一種分離的核酸，其含有圖5、7、9或11中任何一個所示的序列。
12.一種表達(dá)載體，其含有權(quán)利要求10或11所述的核酸。
13.一種逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，其含有權(quán)利要求10或11所述的核酸。
14.一種細(xì)胞，其含有權(quán)利要求12所述的表達(dá)載體。
15.一種制備權(quán)利要求1-7中任一項所述的融合蛋白的方法，該方法包括(a)提供權(quán)利要求14所述的細(xì)胞，以及(b)在允許核酸表達(dá)的條件下培養(yǎng)該細(xì)胞。
16.一種誘導(dǎo)或增強個體針對HBV核心抗原的免疫應(yīng)答的方法，該方法包括給個體施用有效量的權(quán)利要求1-7中任一項所述的融合蛋白。
17.一種誘導(dǎo)或增強個體針對HBV核心抗原的免疫應(yīng)答的方法，該方法包括給個體施用有效量的權(quán)利要求8所述的藥物組合物。
18.權(quán)利要求17所述的方法，其中藥物組合物進一步含有可藥用載體或賦形劑。
19.一種誘導(dǎo)或增強針對HBV核心抗原的免疫應(yīng)答的方法，該方法包括給個體施用有效量的權(quán)利要求12所述的表達(dá)載體。
20.一種誘導(dǎo)或增強針對HBV核心抗原的免疫應(yīng)答的方法，該方法包括給個體施用有效量的權(quán)利要求13所述的表達(dá)載體。
全文摘要
本發(fā)明涉及含HBV抗原的組合物，其可用于治療或預(yù)防HBV感染。正如在此所描述的，該組合物的成分可以變化，但其中包含了應(yīng)激蛋白或其部分(如片段)或衍生物，以及HBV抗原。
文檔編號A61K48/00GK1491116SQ02804576
公開日2004年4月21日 申請日期2002年2月5日 優(yōu)先權(quán)日2001年2月5日
發(fā)明者李·米茲恩, 劉宏偉, 馬文·西格爾, 李 米茲恩, 西格爾 申請人:斯特雷斯根生物技術(shù)公司