專利名稱：葉酸改性殼聚糖親核no供體及其合成方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種醫(yī)藥工程技術(shù)領(lǐng)域的藥物及其合成方法，具體是一種葉酸改 性殼聚糖親核NO供體及其合成方法。
技術(shù)背景一氧化氮NO是內(nèi)皮誘導(dǎo)松弛因子，在調(diào)節(jié)血管緊張度、血壓、平滑肌繁殖 和血小板聚集等方面有重要的作用。目前，NO在損傷部位處的控制釋放已經(jīng)被 確定是防止再狹窄的最有前途的一種途徑。有效治療心血管疾病患者的舉措是使 用抗凝血制劑和抗血小板制劑，這些制劑能夠防止更深入缺血事件的發(fā)生和減少 由血栓導(dǎo)致相關(guān)動脈疾病死亡的概率。含有親核一氧化氮供體[N(0)NO]—官能團(tuán) 的化合物是近幾年發(fā)展起來的一種最重要的NO供體藥物，它既可在生理?xiàng)l件下 自發(fā)的釋放NO分子，經(jīng)02取代后又可在靶器官和靶細(xì)胞中被恃定酶脫離，具有 靶向性的功能，它還具有良好的可調(diào)控性，另外它可制備成各種形態(tài)，根據(jù)需要 應(yīng)用于不同的醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。雖然大量的體外試驗(yàn)已經(jīng)證明了它可有效的預(yù)防成型術(shù) 后再狹窄，提高醫(yī)療裝置的抗血栓性能，減輕肺部高壓和血管痙攣然等用途，但 親核試劑(多胺)的細(xì)胞毒性和致癌性副產(chǎn)物亞硝胺的生成是限制其臨床應(yīng)用的 主要難題。在最近的十年中，國外對基于含有[N(0) NO]—官能團(tuán)的NO供體控釋材料進(jìn)行 了大量的研究。最初的研究集中于將離子型的親核NO供體N0N0ate分散于各種 疏水性聚合物中，通過NO的釋放增強(qiáng)這些材料的血液相容性。但親水性的NO 供體會從聚合物中滲出，在血液中形成致癌性的N-亞硝胺物質(zhì)。將這類材料應(yīng) 用于臨床，還必須考慮作為聚合物基體材料的生物相容性和生物可降解性、親核 試劑的細(xì)胞毒性和生物相容性。因此要選用無毒的有良好生物相容性的NO載體，其中的解決辦法之一就是采用對身體無害的具有仲胺基團(tuán)的親核載體。葉酸(FA)是一種B族維生素，可特異性地與細(xì)胞表面的葉酸受體(FR)作用 形成復(fù)合物，通過受體介導(dǎo)內(nèi)吞被細(xì)胞吸收且順利到達(dá)細(xì)胞核。FR可被許多腫瘤細(xì)胞超量表達(dá)(如卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌、直腸癌、乳腺癌、肺癌、肝癌、神經(jīng) 內(nèi)分泌癌和腦轉(zhuǎn)移癌等)，葉酸已被當(dāng)作抗癌藥物的靶向分子而受到廣泛重視。殼聚糖是唯一天然存在且是陽離子的可生物降解的多糖，具有良好的生物相 容性和生物可降解性，有抗菌消炎、促進(jìn)傷口愈合、抗酸抗?jié)兗爸苯右种颇[瘤 細(xì)胞的作用，與抗癌藥合用可增強(qiáng)抗癌效果。近年來殼聚糖作為一種新型藥用輔 料在緩釋給藥系統(tǒng)中得到了越來越廣泛的應(yīng)用，且殼聚糖來源豐富，價(jià)格低廉。 另外，由于殼聚糖具有良好的生物相容性，生物可降解性，大分子正電性，無毒 性以及生物粘附性，使得殼聚糖可以作為理想的藥物輸送材料。經(jīng)對現(xiàn)有技術(shù)的文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)，Smith等人在美國專利中(USP6261594， Chitosan-based nitric oxide donor compositions ， 2001 ; USP6451337 ， Chitosan-based nitric oxide donor compositions, 2002)提出了將改性殼聚 糖作為親核NO載體，合成出系列殼聚糖-N0加成物。殼聚糖的具體的改性分為 兩類(l)親水基團(tuán)改性N-羧丁基殼聚糖，N-羧乙基殼聚糖，N-羧甲基殼聚糖。 (2)疏水性基團(tuán)改性N-丙基殼聚糖，N-羧乙基殼聚糖甲酯。其不足在于NO 的負(fù)載程度較低，原因有兩點(diǎn)(1) NO的釋放不具有針對性，使得NO的利用度 極地低。(2)這些殼聚糖改性產(chǎn)物同NO的反應(yīng)后生成的親核NO供體的釋放量和 釋放半衰期較低。因此限制了其在醫(yī)學(xué)上的用途。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種葉酸改性殼聚糖親核NO 供體及其合成方法。本發(fā)明通過對殼聚糖進(jìn)行羧基化改性，產(chǎn)生NH親核位點(diǎn)， 同NO反應(yīng)后，得到一系列以殼聚糖葉酸改性產(chǎn)物為載體的含有[N(0)NO]—官能 團(tuán)的新型的NO供體，解決了目前此類親核NO供體應(yīng)用于臨床時(shí)存在的問題(利 用率較低)。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明所涉及的葉酸改性殼聚糖親核NO供體，用殼聚糖作為基體材料，采 用羧化改性產(chǎn)生仲胺親核位點(diǎn)(NH基團(tuán))，與N0反應(yīng)產(chǎn)生[N(0)N0]—官能團(tuán)，親 核NO供體的結(jié)構(gòu)式如下CTNa+ CS-FA-NO其中N[N(0)N0]—基團(tuán)為NH基團(tuán)同NO反應(yīng)形成。而NH基團(tuán)來自于葉酸改性 的殼聚糖和葉酸分子本身；葉酸分子本身就具有NH集團(tuán)，而且葉酸分子上的羧 基基團(tuán)-C00H跟殼聚糖上的NH2基團(tuán)發(fā)生羧基反應(yīng)后就可以直接生成NH基團(tuán)。本發(fā)明所涉及的葉酸改性殼聚糖親核NO供體合成方法，具體為對殼聚糖 上的NH2基團(tuán)進(jìn)行羧化改性，使其產(chǎn)生能夠與NO反應(yīng)的親核NH基團(tuán)。羧化改性 殼聚糖分子同N0氣體分子在甲醇鈉的甲醇溶液中進(jìn)行反應(yīng)，要求Na7NH=2/l， 壓力為5-10atm，室溫反應(yīng)3-7天，產(chǎn)生[N(0)N0]—基團(tuán)。將合成產(chǎn)物用甲醇乙醚 分別清洗多次，室溫真空干燥，儲存于-2(TC的干燥器內(nèi)。所述的對殼聚糖上的NH2基團(tuán)進(jìn)行羧化改性，是采用殼聚糖上的NH2基團(tuán)同 葉酸上的羧基基團(tuán)發(fā)生羧基化反應(yīng)，生成酰胺鍵，從而產(chǎn)生了NH基團(tuán)。具體為稱取殼聚糖(分子量40-188萬)樣品，加醋酸攪拌至溶解完全，將溶液pH 值調(diào)到4.7，用一次性針頭式過濾器將溶液過濾后加入圓底燒瓶中。稱取葉酸溶 于二甲亞砜(DMS0)中，用磁力攪拌至完全溶解后，向葉酸液液中加入二環(huán)己基 碳二亞胺(EDC)，混合至溶解。將加有EDC的葉酸溶液加入上述殼聚糖溶液中， 于37。C下水浴攪拌反應(yīng)7天。調(diào)節(jié)pH值到9.0使反應(yīng)終止，將反應(yīng)產(chǎn)物用pH 值為7. 4的磷酸鹽緩沖溶液(PBS)透析3天，然后用超純水透析4天，除去未 反應(yīng)完全的反應(yīng)物。將透析產(chǎn)物于冷凍干燥機(jī)中凍干，產(chǎn)物于干燥器內(nèi)保存。本發(fā)明NO供體生成反應(yīng)式如下<formula>formula see original document page 7</formula>本發(fā)明得到的葉酸改性殼聚糖親核NO供體為黃色細(xì)粉末，儲存于-2(TC的干 燥器內(nèi)。在室溫下能夠穩(wěn)定存在，在酸性或中性水溶液中能夠自發(fā)分解釋放出 NO和葉酸改性殼聚糖分子。本發(fā)明制備的葉酸改性殼聚糖親核NO供體，具有穩(wěn)定的化學(xué)性質(zhì)和較長的 釋放半衰期，可廣泛的應(yīng)用于治療心血管系統(tǒng)疾病，肺部高壓，促進(jìn)傷口愈合， 有效的預(yù)防成型術(shù)后再狹窄，提高醫(yī)療裝置的抗血栓性能。
具體實(shí)施方式
下面對本發(fā)明的實(shí)施例作詳細(xì)說明本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下 進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限 于下述的實(shí)施例。實(shí)施例l:葉酸(FA)改性40萬分子量殼聚糖(CS) /N0的合成(摩爾比 FA/CS=2/1)準(zhǔn)確稱取1. 61g的殼聚糖(分子量40萬)樣品，加100ml 1%醋酸攪拌至溶解完全，將溶液pH值調(diào)到4.7，用一次性針頭式過濾器將溶液過濾后加入圓底 燒瓶中。稱取2. 17g葉酸溶于30ml二甲亞砜中，用磁力攪拌至完全溶解后，向 葉酸溶液中加入二環(huán)己基碳二亞胺0.5g,混合至溶解。將加有二環(huán)己基碳二亞 胺的葉酸溶液加入上述殼聚糖溶液中，于37'C下水浴攪拌反應(yīng)7天。調(diào)節(jié)pH 值到9. 0使反應(yīng)終止，將反應(yīng)產(chǎn)物用pH值為7. 4的磷酸鹽緩沖溶液透析3天， 然后用超純水透析4天，除去未反應(yīng)完全的反應(yīng)物。將透析產(chǎn)物于冷凍干燥機(jī)中 凍干，最后烘干得到淡黃色細(xì)粉末2. 04g，經(jīng)計(jì)算得接枝率為10%，產(chǎn)物于干燥 器內(nèi)保存。將上述反應(yīng)產(chǎn)物2.04g (O.Olmol)加入到含有2. 15g (0. 02mol)甲醇鈉的 100ml無水甲醇溶液中，在高壓釜中與NO反應(yīng)，維持壓力5atm，反應(yīng)3天，反 應(yīng)結(jié)束后分別用無水甲醇和乙醚洗滌，室溫真空干燥，得到黃色粉末約2. 12g。[N(0)NO]—官能團(tuán)最直觀和有效地表征方法是在230-280處的紫外特征吸收， 合成產(chǎn)物CS-FA/N0中[N(0)N0]—官能團(tuán)的特征吸收在262nm，測定了在磷酸鹽緩 沖液中其吸光率隨時(shí)間的變化，通過釋放曲線的函數(shù)擬合求出其半衰期是20h。實(shí)施例2:葉酸(FA)改性124萬分子量殼聚糖(CS) /N0的合成(摩爾比 FA/CS=1/1)準(zhǔn)確稱取1. 61g的殼聚糖(分子量124萬)樣品，加100ml 1%醋酸攪拌至溶 解完全，將溶液pH值調(diào)到4.7，用一次性針頭式過濾器將溶液過濾后加入圓底 燒瓶中。稱取4.34g葉酸溶于30ml 二甲亞砜中，用磁力攪拌至完全溶解后，向 葉酸溶液中加入二環(huán)己基碳二亞胺0.5g，混合至溶解。將加有二環(huán)己基碳二亞 胺的葉酸溶液加入上述殼聚糖溶液中，于37t:下水浴攪拌反應(yīng)7天。調(diào)節(jié)pH 值到9. 0使反應(yīng)終止，將反應(yīng)產(chǎn)物用pH值為7. 4的磷酸鹽緩沖溶液透析3天， 然后用超純水透析4天，除去未反應(yīng)完全的反應(yīng)物。將透析產(chǎn)物于冷凍干燥機(jī)中 凍干，最后烘干得到黃色細(xì)粉末2. 48g，算得接枝率為20%。產(chǎn)物于干燥器內(nèi)保 存。將上述反應(yīng)產(chǎn)物2.48g (O.Olraol)加入到含有2. 15g (0. 02mol)甲醇鈉的 100ml無水甲醇溶液中，在高壓釜中與NO反應(yīng)，維持壓力7atm，反應(yīng)5天，反 應(yīng)結(jié)束后分別用無水甲醇和乙醚洗滌，室溫真空干燥，得到黃褐色粉末約2. 60g。[N(0)N0]—官能團(tuán)最直觀和有效地表征方法是在230-280處的紫外特征吸收，合成產(chǎn)物CS-FA/N0中[N(0)NO]—官能團(tuán)的特征吸收在262nm，測定了在磷酸鹽緩 沖液中其吸光率隨時(shí)間的變化，通過釋放曲線的函數(shù)擬合求出其半衰期是28h。 實(shí)施例3:葉酸(FA)改性188萬分子量殼聚糖(CS) /N0的合成(摩爾比 FA/CS=l/2)準(zhǔn)確稱取1. 61g的殼聚糖(分子量188萬)樣品，加100ml醋酸攪拌至溶解 完全，將溶液pH值調(diào)到4.7，用一次性針頭式過濾器將溶液過濾后加入圓底燒 瓶中。稱取8.68g葉酸溶于30ml二甲亞砜中，用磁力攪拌至完全溶解后，向葉 酸溶液中加入二環(huán)己基碳二亞胺0.5g，混合至溶解。將加有二環(huán)己基碳二亞胺 的葉酸溶液加入上述殼聚糖溶液中，于37r下水浴攪拌反應(yīng)7天。調(diào)節(jié)pH值 到9.0使反應(yīng)終止，將反應(yīng)產(chǎn)物用pH值為7.4的磷酸鹽緩沖溶液透析3天，然 后用超純水透析4天，除去未反應(yīng)完全的反應(yīng)物。將透析產(chǎn)物于冷凍干燥機(jī)中凍 干，最后烘干得到淡黃色細(xì)粉末2. 94g，算得接枝率為31%。產(chǎn)物于干燥器內(nèi)保 存。將上述反應(yīng)產(chǎn)物2.91g (O.Olmol)加入到含有2. 15g (0. 02mol)甲醇鈉的 100ml無水甲醇溶液中，在高壓釜中與NO反應(yīng)，維持壓力10atm，反應(yīng)7天，反 應(yīng)結(jié)束后分別用無水甲醇和乙醚洗滌，室溫真空干燥，得到黃褐色粉末約3. 16g。[N(0)NO]—官能團(tuán)最直觀和有效地表征方法是在230-280處的紫外特征吸收， 合成產(chǎn)物CS-FA/N0中[N(0)N0]—官能團(tuán)的特征吸收在262mn，測定了在磷酸鹽緩 沖液中其吸光率隨時(shí)間的變化，通過釋放曲線的函數(shù)擬合求出其半衰期是35h。
權(quán)利要求
1、一種葉酸改性殼聚糖親核NO供體，其特征在于，分子結(jié)構(gòu)式如下其中N[N(O)NO]-基團(tuán)為NH基團(tuán)同NO反應(yīng)形成，而NH基團(tuán)來自于葉酸改性的殼聚糖和葉酸分子本身。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的葉酸改性殼聚糖親核N0供體，其特征是，所述親 核N0供體，是在酸性和中性水溶液中能夠自發(fā)的釋放NO分子，殼聚糖分子量大小決定了它們的最大負(fù)載量、釋放半衰期和釋放速率。
3、 一種如權(quán)利要求1所述的葉酸改性殼聚糖親核N0供體的制備方法，其特 征在于對殼聚糖上的NH2基團(tuán)進(jìn)行羧基化改性，使其產(chǎn)生能夠與NO反應(yīng)的親 核NH基團(tuán)，羧基化改性殼聚糖后引入的葉酸分子本身就具有NH基團(tuán)，這兩種來 源的仲胺NH基團(tuán)同N0氣體分子在甲醇鈉的甲醇溶液中進(jìn)行反應(yīng)，其中Na7NH=2 ， 產(chǎn)生[N (0) NO]—基團(tuán)，得到含有[N (0) NO]-基團(tuán)的親核NO供體。
4、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的羧基改性殼聚糖親核N0供體的制備方法，其特征 是，所述反應(yīng)，其壓力為5-10atra。
5、 根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的羧基改性殼聚糖親核NO供體的制備方法，其 特征是，所述反應(yīng)，其溫度為室溫，時(shí)間為3-7天。
6、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的羧基改性殼聚糖親核N0供體的制備方法，其特征 是，所述的對殼聚糖上的NH2基團(tuán)進(jìn)行羧化改性，是采用殼聚糖上的NH2基團(tuán)同 葉酸上的羧基基團(tuán)發(fā)生羧基化反應(yīng)，生成酰胺鍵，從而產(chǎn)生了NH基團(tuán)。
7、 根據(jù)權(quán)利要求3或6所述的葉酸改性殼聚糖親核NO供體的制備方法，其 特征是，所述對殼聚糖上的NH2基團(tuán)進(jìn)行羧化改性后，其產(chǎn)物的分離提純采用磷 酸鹽緩沖溶液和超純水分別透析，除去未反應(yīng)完全的反應(yīng)物，將透析產(chǎn)物于冷 凍干燥機(jī)中凍干，最后烘干得到淡黃色細(xì)粉末。
8、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的葉酸改性殼聚糖親核N0供體的制備方法，其特征 是，所得到的NO供體為黃褐色細(xì)粉末，儲存于-2(TC的干燥器內(nèi)。
全文摘要
一種葉酸改性殼聚糖親核NO供體及其合成方法，屬于醫(yī)藥工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明對殼聚糖上的NH₂基團(tuán)進(jìn)行?；男裕蛊洚a(chǎn)生能夠與NO反應(yīng)的親核NH基團(tuán)。葉酸改性殼聚糖分子上的仲胺NH基團(tuán)同NO氣體分子在甲醇鈉的甲醇溶液中進(jìn)行反應(yīng)，產(chǎn)生[N(O)NO]^-基團(tuán)，其中Na⁺/NH＝2，所得到的葉酸改性殼聚糖親核NO供體分子結(jié)構(gòu)式如上。本發(fā)明親核NO供體具有不同的NO釋放速率和較長的半衰期，可以解決NO釋放的非特意性靶向性的弱點(diǎn)，提高了NO的利用效率，同時(shí)能夠克服親核試劑(多胺)的細(xì)胞毒性和避免致癌性副產(chǎn)物亞硝胺的生成。
文檔編號A61K47/48GK101224305SQ20071017259
公開日2008年7月23日 申請日期2007年12月20日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月20日
發(fā)明者萬錒俊, 燕 孫, 張隱西, 李慧麗 申請人:上海交通大學(xué)