專利名稱：亞單位抗原微乳劑疫苗的制造方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物制品一疫苗制造領(lǐng)域，一種用于亞單位抗原的微乳劑疫苗制造技術(shù)。
亞單位抗原是指由病原微生物提取或通過(guò)生物工程技術(shù)制備的一種有效保護(hù)性抗原成份。由于在制備過(guò)程中除去了對(duì)保護(hù)性免疫無(wú)效的成份，用其制備的疫苗能夠產(chǎn)生更為特異的免疫反應(yīng)，是目前疫苗研究的方向之一。但是，由于亞單位抗原一般是分子量較小的純化抗原成份，雖然能夠產(chǎn)生更為特異的免疫反應(yīng)，但由于抗原性較弱，必須與有效的佐劑配合使用，才能獲得理想的免疫效果。目前對(duì)亞單位蛋白抗原效果較好的佐劑是用Qui/A制備的免疫刺激復(fù)合物。這種佐劑雖然有良好的佐劑效果，但由于其原材料Qui/A來(lái)源于南美的一種樹皮，產(chǎn)量有限，而且價(jià)格昂貴。另外在制備免疫刺激復(fù)合物疫苗時(shí)，必須加入去污劑，而且要經(jīng)超速離心進(jìn)行純化，工藝過(guò)程繁雜，不適于大批量工業(yè)化生產(chǎn)。
本發(fā)明的目的是為了研制更為有效、而且來(lái)源方便、制造工藝簡(jiǎn)便的亞單位疫苗佐劑用于生產(chǎn)疫苗。
本發(fā)明的實(shí)施方案是采用由中國(guó)的一種植物提取的植物糖苷作為主要成份與膽固醇經(jīng)超聲處理制備成功一種微乳劑佐劑。將該微乳劑與提取的病原微生物亞單位抗原按一定比例混合，制成亞單位微乳劑疫苗，并通過(guò)對(duì)新城疫病毒外膜蛋白及禽巴氏桿菌亞單位抗原的試驗(yàn)，來(lái)驗(yàn)證其免疫增強(qiáng)和佐劑作用。
本發(fā)明的具體實(shí)施步驟為，由中國(guó)草藥皂角用水浸法提取皂角苷，經(jīng)澄清后，經(jīng)噴霧干燥(出口溫度為80～120℃)為皂角苷粉。在制備微乳劑基質(zhì)時(shí)，將皂角苷粉用蒸鎦水配成5mg/ml的皂角苷溶液；將膽固醇用氯仿配成100mg/ml的膽固醇溶液。在超聲過(guò)程下，按照1∶100(V/V)將以上膽固醇溶液緩慢加到皂角苷溶液中，繼續(xù)超聲至混合液呈白色乳狀液。再于減壓條件下抽除氯仿，并以5000r/min離心20min，除去沉淀物后的上部液體再經(jīng)20000r/min離心1h，去其上清液，用pH7.2 PBS溶液將沉淀稀釋至原溶液體積而成微乳劑，按終濃度1/萬(wàn)加入硫柳汞防腐。
在制備亞單位微乳劑疫苗時(shí)，將提取的亞單位抗原按2mg/ml的濃度加入微乳劑中，即成為亞單位微乳劑疫苗。
在對(duì)新城疫病毒外膜蛋白制備的新城疫亞單位微乳劑疫苗的試驗(yàn)中，將新城疫病毒外膜蛋白加入制備的微乳劑中，使蛋白(即亞單位抗原)濃度為2mg/ml，免疫小白鼠，免疫后90天，亞單位微乳劑疫苗組，HI抗體效價(jià)仍可達(dá)到1∶128。而僅注射同樣劑量外膜蛋白組，在免疫后20天HI抗體效價(jià)只有1∶8，30天后即轉(zhuǎn)為陰性。
在3批禽霍亂亞單位微乳劑疫苗的安全實(shí)驗(yàn)中注射10日齡無(wú)特定病原(SPF)雞，每只胸部肌肉注射1ml禽霍亂亞單位微乳劑疫苗，未見任何不良反應(yīng)。在效力試驗(yàn)中，用該禽霍亂亞單位微乳劑疫苗免疫1月齡SPF雞，每只肌肉注射1ml，并于10天后再用相同劑量和方法進(jìn)行第二次免疫接種。經(jīng)第二次免疫后30天，用禽源多殺性巴氏桿菌強(qiáng)毒進(jìn)行攻擊，保護(hù)率可達(dá)到100％，而同樣劑量的油佐劑滅活疫苗免疫組只有60％。在免疫期試驗(yàn)中，經(jīng)兩次免疫的雞，于第二次免疫后60天用禽源多殺性巴氏桿菌強(qiáng)毒攻擊，保護(hù)率為80％～100％，免疫后6個(gè)月，保護(hù)率仍可達(dá)到60％。
在對(duì)禽源大腸桿菌的試驗(yàn)中，將禽源大腸菌菌毛抗原與制備的微乳劑基質(zhì)制成亞單位微乳劑疫苗。用此疫苗免疫SPF雞后15天采血測(cè)定凝集抗體，免疫組100％轉(zhuǎn)為陽(yáng)性，而油佐劑免疫組只有66％轉(zhuǎn)為陽(yáng)性。
微乳狀液是一種具有高度穩(wěn)定性的溶液，其物理性狀介于乳狀液與膠團(tuán)溶液之間，其質(zhì)點(diǎn)直徑小于0.1μm，除穩(wěn)定性高外，由于表面積的增加，對(duì)溶液中的溶質(zhì)有更高的分散能力和吸附性。采用的皂角苷本身具有免疫增強(qiáng)作用，將其與膽固醇經(jīng)超聲處理制成微乳劑后，對(duì)于蛋白抗原具有很強(qiáng)的吸附性能，從而使蛋白抗原分子聚集成具有多個(gè)抗原決定簇的顆粒、增加對(duì)免疫細(xì)胞的有效刺激。在本發(fā)明的有關(guān)驗(yàn)證試驗(yàn)中將新城疫病毒外膜蛋白抗原、禽源多殺性巴氏桿菌裂解后的可溶性蛋白抗原及禽源大腸桿菌菌毛抗原分別加入該微乳劑溶液中制備成的各自亞單位微乳劑疫苗均取得安全有效的結(jié)果即形成的新城疫病毒外膜蛋白微乳劑免疫小白鼠后，直至90天，HI抗體價(jià)仍可達(dá)到1∶128，而蛋白抗原單獨(dú)免疫鼠在免疫后30天HI抗體即轉(zhuǎn)為陰性。禽源多殺性巴氏桿菌是一種免疫原性較弱的致病菌，目前使用的氫氧化鋁膠滅活疫苗和油佐劑滅活疫苗的免疫效果均不理想，免疫保護(hù)率僅為50％～80％。將禽霍亂微乳劑疫苗免疫雞，二次免疫攻毒保護(hù)率可達(dá)到80％以上。免疫期已測(cè)到2個(gè)月。大腸桿菌微乳劑疫苗免疫SPF雞后15天采血測(cè)定凝集抗體，免疫組100％轉(zhuǎn)為陽(yáng)性。而油佐劑免疫組只有66％轉(zhuǎn)為陽(yáng)性。根據(jù)以上對(duì)不同亞單位抗原的試驗(yàn)，可以認(rèn)為發(fā)明的微乳劑佐劑對(duì)于亞單位抗原有良好的免疫增強(qiáng)作用，是一種完全新型的佐劑。
實(shí)施例及實(shí)驗(yàn)實(shí)施例1 微乳劑基質(zhì)的制備將皂角苷粉用蒸鎦水配成5mg/ml的皂角苷溶液；將膽固醇用氯仿配成100mg/ml的膽固醇溶液。將1ml 100mg/ml膽固醇氯仿溶液在超聲過(guò)程中(250W)逐滴加到100ml 5mg/ml皂角苷溶液中，繼續(xù)超聲(約10min)至混合液呈白色乳狀液。再于減壓條件下抽除氯仿，并以5000r/min離心20min，除去沉淀物后的上部液體再經(jīng)20000r/min離心1h，去其上清液，用pH7.2 PBS溶液將沉淀稀釋至100ml而成為半透明的微乳劑，按終濃度1/萬(wàn)加入硫柳汞防腐。實(shí)施例2 新城疫(ND)微乳劑疫苗的制備將新城疫病毒(NDV)以40000r/min離心3h，棄上清，將沉淀病毒用1/400原病毒液體積的pH7.2 PBS溶解成濃縮400倍的病毒液，加入2％Triton X100室溫作用30min，將裂解病毒液置于40％蔗糖溶液上以40000r/min超速離心10h。收取上層蛋白帶，即為NDV外膜蛋白，紫外法測(cè)定蛋白濃度為60mg/ml。
取100ml微乳劑基質(zhì)，分別加入提取的蛋白抗原，使終濃度為2mg/ml，即為新城疫微乳劑疫苗。實(shí)施例3 禽霍亂微乳劑疫苗的制備將禽巴氏桿菌C48-1株強(qiáng)毒菌馬丁瓊脂培養(yǎng)菌膜用pH7.2 PBS洗下，配制成100億/ml菌液，經(jīng)超聲處理30min破碎菌體后，再反復(fù)凍融2次，使菌體充分裂解；以5000r/min離心30min，收取上清蛋白溶液，即為禽源多殺性巴氏桿菌裂解亞單位抗原。蛋白濃度為20mg/ml。
取100ml微乳劑基質(zhì)，分別加入提取的禽源多殺性巴氏桿菌裂解亞單位抗原，使終濃度為2mg/ml，即為微乳劑疫苗。實(shí)驗(yàn)1 新城疫微乳劑疫苗免疫試驗(yàn)將新城疫微乳劑疫苗免疫10只小白鼠，每只肌肉注射0.5ml，同時(shí)將NDV外膜蛋白溶液配制成2mg/ml，也注射10只小白鼠作為對(duì)照組。免疫后20天、30天、60天采血測(cè)定其血凝(HI)抗體價(jià)。
新城疫病毒外膜蛋白微乳劑苗免疫小白鼠后20天、30天、90天，HI抗體價(jià)均達(dá)到1∶128，而同批外膜蛋白抗原免疫組，免疫后20天HI抗體價(jià)僅為1∶8，免疫后30天以后一直為陰性，結(jié)果見表1。
表1新城疫病毒外膜蛋白微乳劑苗對(duì)小鼠的免疫
禽巴氏桿菌微乳劑苗的安全試驗(yàn)將3批禽霍亂微乳劑疫苗各肌肉注射5只小白鼠，每只0.5ml；各注射10只10日齡SPF雞，每只1ml，觀察10天進(jìn)行安檢。試驗(yàn)結(jié)果表明以上3批禽霍亂微乳劑疫苗接種10日齡SPF雞和小白鼠后，均未見任何不良反應(yīng)，說(shuō)明該疫苗安全性好。實(shí)驗(yàn)3 禽巴氏桿菌微乳劑苗效力試驗(yàn)將3批禽巴氏桿菌微乳劑苗與9801批同批抗原的油佐劑苗分別免疫1月齡SPF雞，每只肌肉注射疫苗1ml。10天后第二次免疫，每只肌肉注射1ml，第二次免疫后30天每組取5只雞，用C48-1強(qiáng)毒菌進(jìn)行攻擊。
經(jīng)3批微乳劑苗二次免疫的免疫組雞，在免疫后30天，攻毒保護(hù)率均達(dá)到100％，而同批抗原的油佐劑苗免疫組為60％，對(duì)照組100％發(fā)病死亡，結(jié)果見表2。
表2三批禽巴氏桿菌微乳劑苗的效力試
實(shí)驗(yàn)4 禽巴氏桿菌微乳劑苗免疫劑量測(cè)定將9803批微乳劑苗按2ml/只、0.5ml/只、0.2ml/只免疫1月令SPF雞，進(jìn)行免疫劑量測(cè)定，免疫后30天用禽源多殺性巴氏桿菌C48-1強(qiáng)毒菌株進(jìn)行攻擊。其試驗(yàn)攻毒保護(hù)率分別為100％、100％、50％，說(shuō)明最小有效免疫劑量為0.5ml/只，使用劑量采用1ml/只比較合理，結(jié)果見表3。
表3禽巴氏桿菌微乳劑苗免疫劑量測(cè)定
實(shí)驗(yàn)5 禽霍亂微乳劑苗的免疫程序及免疫期試驗(yàn)將3批禽霍亂微乳劑苗分別免疫20日齡未經(jīng)任何禽霍亂疫苗免疫過(guò)的雞(以下稱非免疫雞)，每只胸肌注射1ml，第一次免疫(以下或稱首免)后30天每組取5只進(jìn)行強(qiáng)毒攻擊，剩余雞每只胸肌注射1ml同批微乳劑苗進(jìn)行第二次免疫(以下可稱二免)。二免后60天，每組取5只用禽源多殺性巴氏桿菌強(qiáng)毒菌進(jìn)行攻擊試驗(yàn)。結(jié)果為首免后30天，攻毒保護(hù)率9801、9802、9803批苗分別為80％、80％、100％，二免后60天攻毒保護(hù)率分別為100％、80％、100％，結(jié)果見表4。
表4禽巴氏桿菌微乳劑苗免疫程序及免疫期試驗(yàn)
權(quán)利要求
1.一種亞單位抗原微乳劑疫苗制造方法，其特征在于用由中國(guó)皂角提取皂角苷作為主要成份與膽固醇經(jīng)超聲處理制備成一種微乳劑。將該微乳劑作為佐劑與制備疫苗用微生物亞單位抗原按一定比例混合，制成免疫用亞單位微乳劑疫苗。
2.權(quán)利要求1所述的亞單位抗原微乳劑疫苗制造方法，其特征在于微乳劑是由中國(guó)草藥皂角提取制成的皂角苷粉為其主要成分之一。
3.權(quán)利要求1所述的亞單位抗原微乳劑疫苗制造方法，其特征在于制備疫苗用微生物亞單位抗原是復(fù)制后的疫苗病毒經(jīng)處理制成的具有免疫活性的成分——即亞單位抗原。
4.權(quán)利要求1所述的亞單位抗原微乳劑疫苗制造方法，其特征在于制備疫苗用微生物亞單位抗原是繁殖后的制苗用細(xì)菌經(jīng)處理制成的具有免疫活性的成分——即亞單位抗原。
全文摘要
本發(fā)明涉及的是一種亞單位抗原微乳劑疫苗制備技術(shù),用提取的皂角苷和膽固醇制成微乳劑,經(jīng)分別與提取的新城疫病毒外膜蛋白、禽源多殺性巴氏桿菌裂解產(chǎn)物和禽源大腸桿菌菌毛抗原制成亞單位微乳劑疫苗,免疫鼠和雞。新城疫病毒外膜蛋白微乳劑疫苗免疫鼠HI抗體可達(dá)到1∶128。顯著高于外膜蛋白單獨(dú)免疫鼠的1∶8。禽霍亂微乳劑疫苗免疫雞,經(jīng)兩次免疫接種,免疫后30天和60天,攻毒保護(hù)率可達(dá)到80%以上。用大腸桿菌亞單位微乳劑疫苗免疫SPF雞后15天采血測(cè)定凝集抗體,免疫組100%轉(zhuǎn)為陽(yáng)性,而油佐劑免疫組只有66%轉(zhuǎn)為陽(yáng)性。
文檔編號(hào)A61K47/46GK1265327SQ99126278
公開日2000年9月6日 申請(qǐng)日期1999年12月23日 優(yōu)先權(quán)日1999年12月23日
發(fā)明者支海兵, 劉倩, 宋立 申請(qǐng)人:中國(guó)獸藥監(jiān)察所