專利名稱：恒河猴爆發(fā)性肝功能衰竭模型的建立的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種恒河猴爆發(fā)性肝功能衰竭模型的制備方法。
背景技術(shù)：
急性肝衰竭(fulminant hepatic failure, FHF)臨床常見，多由病毒感染、廣泛肝組織切除、急性藥物或毒物損傷等引起，其基本病理改變?yōu)楦螌?shí)質(zhì)細(xì)胞大片狀變性壞死。 病人預(yù)后兇險(xiǎn)，死亡率非常高。除肝移植外，尚無更好的辦法對(duì)其進(jìn)行治療。受限于供器官的嚴(yán)重短缺，細(xì)胞移植(成熟肝細(xì)胞或干細(xì)胞移植)、生物人工肝、組織工程肝等成為當(dāng)前研究熱點(diǎn)，但其有效性多是在小動(dòng)物(基本上都是大鼠)上獲得。促進(jìn)肝細(xì)胞再生也是當(dāng)前研究熱點(diǎn)，但遠(yuǎn)未取得讓人滿意的進(jìn)展，尚未找到能短期內(nèi)顯著促進(jìn)肝細(xì)胞再生的理想藥物。大動(dòng)物，尤其是靈長類動(dòng)物的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)極為缺乏，制約了這些新的治療方案向臨床過度。建立最接近于人類的靈長類動(dòng)物AHF模型(急性肝功能衰竭(acute hepatic failure, AHF))，用以評(píng)估這些新的治療方法的有效性和安全性，是將其最終應(yīng)用于臨床治療的必經(jīng)途徑。目前爆發(fā)性肝功能衰竭治療研究最常用模型動(dòng)物是嚙齒類。由于嚙齒類在進(jìn)化關(guān)系上與人類相距甚遠(yuǎn)，以其為研究對(duì)象所獲得的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)對(duì)臨床指導(dǎo)意義不大。所用到的大動(dòng)物模型僅限于豬和犬，同樣與人存在巨大差異。恒河猴的解剖特點(diǎn)、各系統(tǒng)生理功能及對(duì)疾病和治療藥物的反應(yīng)性與人類極為相近，是進(jìn)行免疫學(xué)相關(guān)治療和干細(xì)胞移植、異種移植臨床前有效性和安全性評(píng)價(jià)的敏感動(dòng)物。利用恒河猴FHF模型評(píng)價(jià)新型FHF治療藥物， 研究肝臟干細(xì)胞或肝細(xì)胞移植以及輔助性肝支持措施，如組織工程肝和生物人工肝的治療效果，是國際公認(rèn)的臨床前實(shí)驗(yàn)體系，對(duì)未來這些治療方案的臨床應(yīng)用具有重要的指導(dǎo)意義。因此建立非人靈長類FHF模型成為FHF治療研究和臨床前藥物評(píng)價(jià)的迫切需要。建立大動(dòng)物AHF的有以下基本原則(1)可逆性(Reversibility)給予有效治療措施可使動(dòng)物存活；( 重現(xiàn)性(Iteproducibility):不給予治療，所有動(dòng)物都將死亡； (3)肝衰竭的致死性(Death from liver failure)肝損傷最終將導(dǎo)致動(dòng)物死亡；(4)治療窗(Therapeutic window)在動(dòng)物死亡前有足夠時(shí)間給予治療并能評(píng)估其療效；(5)大動(dòng)物模型(Large animal model):能連續(xù)取樣檢測、更接近人類特點(diǎn)；(6)對(duì)實(shí)驗(yàn)者無害 (Minimal hazard to personnel)藥品須盡可能對(duì)實(shí)驗(yàn)人員無害；(7)接近人的代謝和生理學(xué)(Appropriate metabolism/physiology)以便將實(shí)驗(yàn)結(jié)果推廣至人類；(8)動(dòng)物需有意識(shí)(Conscious animal model)用于觀察肝性腦??；(9)符合倫理(Compliance with ethical standards)必須保證實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的福利和倫理規(guī)范。目前肝毒性藥物是建立FHF模型最常用手段。這些藥物包括醋氨酚 (Acetaminophen)、半乳糖野(D-Galactosamine)、硫代乙酷胺(Thioacetamide, TAA) 等。這些藥物誘導(dǎo)的FHF模型均存在各種缺陷，如醋氨酚，其重現(xiàn)性差，相同劑量下動(dòng)物存活時(shí)間差異巨大；伴發(fā)高鐵血紅蛋白血癥、難治性貧血及其他器官損傷。半乳糖酐 (D-Galactosamine)重現(xiàn)性差(死亡率和至死亡的時(shí)間差異非常大)；費(fèi)用高(l_2g/kg)，不適合在大動(dòng)物中應(yīng)用。硫代乙酰胺(ThioacetamideJAA)易導(dǎo)致嚴(yán)重低血壓、低血糖、低體溫以及腎衰竭，能直接導(dǎo)致神經(jīng)損傷，與肝性腦病無法區(qū)分；對(duì)實(shí)驗(yàn)人員有較大毒性。病毒也可誘導(dǎo)FHF發(fā)生，但其復(fù)制困難，生物安全性差。手術(shù)切除全部或大部分肝臟，或完全去血流化，也可建立!FH模型，但由于手術(shù)耗時(shí)、創(chuàng)傷大，血流動(dòng)力學(xué)干擾大；除非原位肝移植，否則動(dòng)物無法存活；肝臟本身并未受到損傷。這類模型適合研究肝移植及肝支持系統(tǒng)。鵝膏蕈堿是有毒蘑菇的主要毒性物質(zhì)，為環(huán)肽類生物堿，通過抑制RNA聚合酶造成細(xì)胞損傷，其靶器官主要為肝臟和胃腸道。內(nèi)毒素脂多糖為革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁主要成分，本身可引起肝細(xì)胞損傷。同時(shí)，通過激活肝臟內(nèi)單核巨噬細(xì)胞，分泌大量炎性介質(zhì)，弓丨起肝細(xì)胞凋亡。通過門靜脈系統(tǒng)直接給藥，可最大限度降低藥物對(duì)其他組織器官的損傷。目前尚未見以大型靈長類動(dòng)物建立FHF動(dòng)物模型的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的技術(shù)方案是提供了一種鵝膏蕈堿聯(lián)合內(nèi)毒素脂多糖在制備用于篩選治療爆發(fā)性肝功能衰竭藥物和方法的動(dòng)物模型中的用途。本發(fā)明的另一技術(shù)方案是提供了恒河猴爆發(fā)性肝功能衰竭模型的建立。本發(fā)明提供了鵝膏蕈堿聯(lián)合內(nèi)毒素脂多糖在制備用于篩選治療爆發(fā)性肝功能衰竭藥物、評(píng)價(jià)組織工程肝支持系統(tǒng)或肝細(xì)胞、干細(xì)胞移植治療效果的靈長類動(dòng)物模型中的用途，其中鵝膏蕈堿的施用劑量為0. lmg/kg,內(nèi)毒素施用劑量為1 μ g/kg。其中，鵝膏蕈堿與脂多糖內(nèi)毒素同時(shí)施用，施用方法為單次腹腔滴注。本發(fā)明還提供了一種爆發(fā)性肝功能衰竭動(dòng)物模型的制備方法，它是將鵝膏蕈堿和脂多糖內(nèi)毒素施用于靈長類動(dòng)物，鵝膏蕈堿的施用劑量為0. lmg/kg，脂多糖內(nèi)毒素的施用劑量為ι μ g/kg。其中，所述靈長類動(dòng)物為恒河猴。其中，所述的施用方法為單次腹腔滴注。本發(fā)明還提供了該方法制備得到的爆發(fā)性肝功能衰竭動(dòng)物模型。本發(fā)明提供了所述的動(dòng)物模型在篩選治療爆發(fā)性肝功能衰竭的藥物、評(píng)價(jià)組織工程肝支持系統(tǒng)或肝細(xì)胞、干細(xì)胞移植治療效果中的應(yīng)用。一種評(píng)價(jià)組織工程肝支持系統(tǒng)或肝細(xì)胞、干細(xì)胞移植效果的方法，包括如下步驟a、它是將鵝膏蕈堿聯(lián)合脂多糖內(nèi)毒素施用于靈長類動(dòng)物，制備爆發(fā)性肝功能衰竭動(dòng)物模型，鵝膏蕈堿的施用劑量為0. lmg/kg，脂多糖內(nèi)毒素的施用劑量為1 μ g/kg ；b、采用細(xì)胞移植或器官移植于該動(dòng)物模型；C、觀察移植后動(dòng)物的肝功能影響情況，評(píng)價(jià)組織工程肝支持系統(tǒng)或肝細(xì)胞、干細(xì)胞移植效果。其中，a步驟所述靈長類動(dòng)物為恒河猴。其中，所述的鵝膏蕈堿與脂多糖內(nèi)毒素同時(shí)施用，施用方法為單次腹腔滴注。本發(fā)明采用鵝膏蕈堿聯(lián)合內(nèi)毒素脂多糖，通過腹腔給藥，建立恒河猴爆發(fā)性肝功能衰竭模型，本發(fā)明動(dòng)物模型可以用于嚙齒類動(dòng)物模型無法完成的生物技術(shù)新藥的評(píng)價(jià)、以及組織工程肝、生物人工肝和肝細(xì)胞、干細(xì)胞移植治療技術(shù)的評(píng)價(jià)。以下通過具體實(shí)施方式
對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)描述，但并不限制本發(fā)明，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)本發(fā)明作出各種改變和變形，只要不脫離本發(fā)明的精神，均應(yīng)屬于本發(fā)明所附權(quán)利要求的范圍。


圖1本發(fā)明動(dòng)物模型給藥前后肝功能、腎功能、心肌酶譜、血淀粉酶、血糖指標(biāo)的改變。圖IA為谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)的改變；圖IB為膽紅素(總膽紅素 TBIL，直接膽紅素DBIL，間接膽紅素IBIL)的改變；圖IC為PT和APTT改變。圖2本發(fā)明動(dòng)物模型肝臟大體改變。圖2A為正常恒河猴肝臟；圖2B顯示尸檢病變肝臟呈黃色萎縮，肝包膜皺縮，肝邊緣銳利。圖3B為尸檢恒河猴肝臟剖面觀。圖3本發(fā)明動(dòng)物模型肝組織切片油紅0染色及HE染色。圖3A為給藥后3 活檢油紅0染色，顯示肝細(xì)胞嚴(yán)重脂肪變；圖:3B為尸檢肝細(xì)胞呈大片狀壞死，圖4本發(fā)明動(dòng)物模型肝臟超聲及超聲增強(qiáng)造影影像學(xué)改變。圖示給藥4 后肝臟回聲稍增強(qiáng)，特別是左內(nèi)葉局部區(qū)域，超聲造影可觀察到該區(qū)域呈低灌注，門靜脈血流改變不明顯，肝動(dòng)脈阻力指數(shù)增高。給藥60h后肝臟實(shí)質(zhì)回聲稍增強(qiáng)，彩色多普勒顯示門靜脈流速降低，肝動(dòng)脈阻力指數(shù)增高。圖5本發(fā)明動(dòng)物模型肝臟、腦的MRI影像學(xué)改變。給藥后24h肝左葉信號(hào)稍增高， 提示細(xì)胞水腫。給藥后4 肝實(shí)質(zhì)信號(hào)增高，不均勻。增強(qiáng)減弱區(qū)域增多。給藥后66h，肝實(shí)質(zhì)信號(hào)不均勻區(qū)增多，廣泛，造影劑攝取不均勻區(qū)增多廣泛，肝膽期信號(hào)普遍減低。頭部 MRI提示給藥后4 無明顯異常，給藥后6 彌散圖像顯示出雙側(cè)顳葉、額葉片帶狀異常信號(hào)區(qū)，提示有超急性期缺血。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1本發(fā)明動(dòng)物模型的制備1、材料與方法1.1實(shí)驗(yàn)材料3-4歲雌性和雄性恒河猴3只，無B皰疹病毒、猴逆轉(zhuǎn)錄病毒、猴白血病病毒和免疫缺陷病毒感染；購自成都平安動(dòng)物繁育基地。1. 2主要試劑鵝膏蕈堿(α-amanitin)，購自瑞士Alexis Biochemicals 公司；內(nèi)毒素脂多糖(LPS)購自美國SigmaAldrich公司。其他藥品和耗材均購自華西醫(yī)院利康藥房。1. 3主要溶液的配制鵝膏蕈堿溶液的配制A液取原裝Img/支鵝膏蕈堿粉劑，加入5ml生理鹽水溶解，作為儲(chǔ)存液，4°C短期存放。B液根據(jù)猴體重，按照0. lmg/kg體重，吸取A液稀釋至50ml生理鹽水中，作為工作液。CN 102526034 A
內(nèi)毒素脂多糖溶液的配制A液秤取脂多糖100 μ g，溶解于Iml生理鹽水，作為儲(chǔ)存液，4°C短期存放。B液根據(jù)猴體重，按照1 μ g/kg體重，吸取A液，稀釋至鵝膏蕈堿工作液中。工作液現(xiàn)用現(xiàn)配。1. 4主要儀器1)全自動(dòng)生化分析儀2)CT :PHILIPS BRILLIANCE 64 排 /16 排3)磁共振SIEMENS TRIO 3T ；SIEMENS AVANTO 1. 5T(MR 對(duì)比齊[J :莫迪司 (Gd-BOPTA, multihance))4)超聲PHILIPS BRILLIANCE IU22(超聲對(duì)比劑聲諾維(SonoVue，注射用六氟化硫微泡))1. 5實(shí)驗(yàn)方法1. 5. 1恒河猴肝功能、腎功能生化指標(biāo)，心肌酶譜，血淀粉酶指標(biāo)測定通過測定上述指標(biāo)，了解肝、腎、心及胰腺是否存在預(yù)存病變，并獲得試驗(yàn)前動(dòng)物基礎(chǔ)值。1)動(dòng)物禁食10_12h，不禁水；2)根據(jù)動(dòng)物購入時(shí)體重，按15mg/kg肌肉注射氯氨酮(50mg/ml)；3)待動(dòng)物麻醉后，準(zhǔn)確稱量體重，并記錄；4)將恒河猴上下肢固定于手術(shù)臺(tái)上，下肢小腿后側(cè)備皮暴露大隱靜脈，碘氟消毒；5)20G留滯針穿刺大隱靜脈，自動(dòng)采血器采集全血6ml (分別做肝功能、腎功能、血常規(guī)、心肌酶譜、血糖和胰淀粉酶測定，并標(biāo)記為0分鐘數(shù)值)。1. 5. 2恒河猴顱、胸腔、腹腔主要臟器影像學(xué)參數(shù)通過CT、MRI及胸腹部超聲，了解腦、心、肺、肝、腎、胰腺等主要臟器是否有預(yù)存病變，并獲得試驗(yàn)前動(dòng)物基礎(chǔ)值。1)動(dòng)物麻醉同上。2)腹部備皮。3)分別采用 PHILIPS BRILLIANCE 64 排 /16 排 CT、SIEMENS TRIO 3T 和 SIEMENS AVANTO 1.5T (增強(qiáng)磁共振采用MR對(duì)比劑為莫迪司G d-B0PTA, multihance)磁共振進(jìn)行全
身掃描，獲取全身主要臟器影像學(xué)參數(shù)。4)采用PHILIPS BRILLIANCE IU22超聲，獲取心、肝、脾、腎、胰腺等主要臟器影像學(xué)參數(shù)(增強(qiáng)造影采用超聲對(duì)比劑聲諾維SonoVue)。5)圖像采集完畢，待動(dòng)物完全蘇醒，送回籠內(nèi)。1. 5. 3恒河猴肝臟穿刺活檢1)動(dòng)物麻醉同上。2)上腹部以艾力克紗布對(duì)以進(jìn)針點(diǎn)為中心向周圍至少15em皮膚無遺漏地涂擦。 待艾力克涂液自然干燥后，再用70%酒精棉球?qū)瞬寥?。鋪巾?)于劍突下偏右側(cè)肋緣進(jìn)針1. 5cm,扳動(dòng)扳機(jī)，獲取肝組織兩條。4)妥善處理創(chuàng)口。
5)分別對(duì)獲取的肝組織進(jìn)行冰凍切片及石蠟包埋切片。冰凍切片用于油紅0染色，觀察肝脂肪變情況。石蠟包埋切片用于HE染色，獲取組織學(xué)參數(shù)。6)活檢完畢，待動(dòng)物完全蘇醒，送回籠內(nèi)。1. 5. 4鵝膏蕈堿及內(nèi)毒素脂多糖注入恒河猴1)動(dòng)物麻醉同上。2)中上腹部以艾力克紗布對(duì)以進(jìn)針點(diǎn)為中心向周圍至少15cm皮膚無遺漏地涂擦。待艾力克涂液自然干燥后，再用70%酒精棉球?qū)瞬寥ァ?)將輸液針頭插入腹腔，將鵝膏蕈堿及脂多糖混合液50ml滴注到腹腔內(nèi)。滴注過程中多次晃動(dòng)腹部，使藥物均勻分布于腹腔。4)滴注完畢，拔出針頭，妥善處理創(chuàng)口。5)待動(dòng)物完全蘇醒，送回籠內(nèi)。給予正常飲食飲水。6)密切觀察動(dòng)物生命體征。1.5.5恒河猴FHF過程的動(dòng)態(tài)觀測1)采用上述方法，分別于給藥后每1 進(jìn)行靜脈采血，檢測肝功能、腎功能、心肌酶譜、血糖、胰淀粉酶指標(biāo)。2)采用上述方法，分別于給藥后每24h進(jìn)行影像學(xué)(CT、MRI、超聲)檢查。3)采用上述方法，分別于給藥后每24h進(jìn)行肝穿刺活檢，標(biāo)本用于冰凍切片油紅0 染色和石蠟包埋切片用于HE染色。4)觀察恒河猴生命體征、行為異常表現(xiàn)。1.5.6恒河猴尸檢1)采用頸胸腹聯(lián)合切口，從下頌正中向下沿前正中線經(jīng)臍的左側(cè)作一直線切開， 止于恥骨聯(lián)合。依次切開皮膚、皮下組織、肌肉，謹(jǐn)慎切開腹膜，切斷胸壁下緣的肌肉，暴露腹腔各臟器。再將胸壁的皮膚連皮下組織和胸大肌一起自胸部中線起剝離，以充分暴露肋骨，用軟骨刀切開肋骨與肋軟骨交界處至胸鎖關(guān)節(jié)處，用肋骨剪剪斷第1肋骨，暴露胸腔。2)檢查腹腔各臟器腹膜表面性狀，色澤，有無滲出物附著，粘連等。腹腔內(nèi)有否積液及氣體，大網(wǎng)膜的位置與臟器有否粘連。各臟器的位置、大小是否正常。檢查腸系膜同時(shí)注意其淋巴結(jié)是否腫大。3)檢查胸腔各臟器檢查心、肺的位置，大小，彼此間的關(guān)系，以及縱膈內(nèi)淋巴結(jié)的外觀，大小，硬度。胸膜的色澤，有無炎性滲出物附著及粘連，胸腔有無積液及氣體。沿心臟底部在心包壁作“人”字形剪開，檢查有無滲出物附著及粘連等。4)將頭部盡量向后仰，然后將軟骨刀在下頌角內(nèi)側(cè)向上刺入，并沿骨之內(nèi)緣逐漸向前割斷口底組織一直繞至對(duì)側(cè)該處，經(jīng)下頌將舌牽出，沿脊柱前方將頸胸腹臟器聯(lián)合取出ο5)依次取下各臟器，逐一詳細(xì)檢查，稱量，測量體積，并檢查臟器切面有無異常。6)自一側(cè)乳突經(jīng)顱頂向另一側(cè)乳突作一切線，切開皮膚后，剝離皮下軟組織及骨膜。切開顳肌后，用細(xì)齒鋸沿顱前后圓周切線鋸斷顱骨板全部及內(nèi)板大部(但不要完全鋸斷，以免鋸入腦內(nèi))。再用鑿子、錘，輕輕擊破內(nèi)板之相連部分，用丁字鑿掀起顱頂骨，將硬腦膜與骨分開。剪開上矢狀竇檢查其內(nèi)有無血栓，再沿顱頂鋸緣，將硬腦膜之四周剪斷。于大腦縱裂深處，將大腦鐮前端附著處割開，并拉大腦鐮向后，露出兩側(cè)大腦半球全部表面，用左手托住腦頂部，右手指伸入腦額葉前端下方將之扶起，露出腦神經(jīng)、垂體柄及小腦幕，逐一切斷腦神經(jīng)、垂體柄及小腦幕。最后將刀深入脊管內(nèi)，割斷頸髓及椎動(dòng)脈，取出腦髓。然后用小刀將垂體周圍組織分離，取出垂體。7)觀察有無腦出血、腦水腫等改變。8)各臟器作適當(dāng)切割后，即放于10%福爾馬林液內(nèi)固定。2.實(shí)驗(yàn)結(jié)果2. 1鵝膏蕈堿聯(lián)合脂多糖導(dǎo)致肝細(xì)胞大量壞死從而誘導(dǎo)FHF的發(fā)生恒河猴腹腔滴注鵝膏蕈堿和內(nèi)毒素脂多糖溶液后12h即出現(xiàn)肝臟轉(zhuǎn)氨酶10倍以上的升高，肝臟活檢見肝細(xì)胞發(fā)生脂肪變。至Mh，轉(zhuǎn)氨酶升高達(dá)50倍左右，膽紅素水平上升，凝血酶原時(shí)間(PT)和APTT延長；影像學(xué)檢查示肝細(xì)胞水腫，其余改變不明顯。至給藥后36h，轉(zhuǎn)氨酶升高達(dá)到200-300倍，PT和APTT顯著延長，膽紅素水平顯著上升，肝細(xì)胞出現(xiàn)中央靜脈周圍及肝小葉中央?yún)^(qū)大片狀壞死，殘余肝細(xì)胞脂肪變明顯。至48h，轉(zhuǎn)氨酶水平下降，膽紅素持續(xù)升高，PT和APTT顯著延長，影像學(xué)顯示肝臟左內(nèi)葉局部區(qū)域回聲增強(qiáng)，呈低灌注，門靜脈血流阻力升高。至60h，轉(zhuǎn)氨酶水平繼續(xù)下降，膽紅素水平繼續(xù)升高，PT和 APTT顯著延長，影像學(xué)顯示肝臟密度不均，門靜脈血流阻力升高。2. 2鵝膏蕈堿聯(lián)合脂多糖對(duì)肝外器官損傷輕微除肝臟出現(xiàn)顯著病變外，血淀粉酶及心肌酶譜及相應(yīng)的影像學(xué)指標(biāo)顯示腎臟、胰腺、心臟無明顯損傷。肌酐水平在給藥后4 顯著升高，但尿酸和尿素水平并無明顯改變。 給藥后3 起，血糖水平持續(xù)下降。2. 3鵝膏蕈堿聯(lián)合脂多糖導(dǎo)致FHF可表現(xiàn)出嚴(yán)重的肝性腦病給藥后4 有腦水腫表現(xiàn)，恒河猴表現(xiàn)為行為減少、進(jìn)食減少、嗜睡；給藥后60h恒河猴出現(xiàn)昏睡至昏迷狀態(tài)，CT及MRI可見雙側(cè)顳葉、額葉片帶狀異常信號(hào)區(qū)，提示腦急性缺血。2. 4鵝膏蕈堿聯(lián)合脂多糖給藥后恒河猴均發(fā)生死亡3只恒河猴于給藥后66h_96h內(nèi)死亡。2. 5尸檢及病理學(xué)顯示鵝膏蕈堿聯(lián)合脂多糖特異作用于肝細(xì)胞，導(dǎo)致肝細(xì)胞大量壞死，是最終引起動(dòng)物死亡的主要原因尸檢顯示腹腔未見明顯積液。肝臟呈急性黃色萎縮，邊緣銳利，包膜皺縮。未見門靜脈血栓形成。肺門、腎門、腸系膜、胃大彎側(cè)淋巴結(jié)呈腫大，大小約綠豆至黃豆大，呈暗黑色。心、肺、腎、胰腺、胃、小腸、結(jié)腸、膀胱、輸尿管、子宮等未見肉眼可見異常。輕度腦水腫，腦溝變淺，腦回增寬。顱底、硬腦膜外、硬腦膜下及蛛網(wǎng)膜下未見出血，腦實(shí)質(zhì)未見出血， 無腦疝形成。各主要臟器進(jìn)行石蠟包埋，切片，HE染色后鏡下觀察并照相。肝肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，肝竇擴(kuò)張充血，肝細(xì)胞廣泛壞死，殘留少量肝細(xì)胞未見再生現(xiàn)象。小葉內(nèi)和匯管區(qū)可見淋巴細(xì)胞浸潤。腎腎小球的毛細(xì)血管球擴(kuò)張充血，腎小管上皮細(xì)胞水腫，管腔內(nèi)可見蛋白管型， 間質(zhì)血管擴(kuò)張充血。肺肺泡間隔增寬，肺泡壁毛細(xì)血管血管擴(kuò)張充血。淋巴結(jié)肺門、胃大彎側(cè)、腸系膜、腎門處淋巴結(jié)腫大，結(jié)內(nèi)淋巴細(xì)胞大片減少伴出血，組織細(xì)胞增生，部分區(qū)域淋巴濾泡增生，增生的濾泡中央血管壁增厚玻變。腦腦膜下淺層腦組織疏松水腫。結(jié)腸灶性區(qū)域結(jié)腸粘膜上皮細(xì)胞壞死脫落。心臟心肌纖維波浪狀改變。按下表測定各指標(biāo)，結(jié)果顯示，本發(fā)明動(dòng)物模型滿足診斷指標(biāo)要求，證明本發(fā)明造模成功。表1.人與恒河猴爆發(fā)性肝衰模型比較
人FHF診斷指標(biāo)人 恒河猴模型病程(發(fā)病到死亡時(shí)間)_<10-14d__36-66h
Γ PTA (凝血酶原活性)<40%<10%---
TBIL (總膽紅素)>171umol/L>30倍給藥前對(duì)照值
__或>〗0倍正常值上限__
酶膽分離現(xiàn)象有有——本發(fā)明制備的恒河猴爆發(fā)性肝功能衰竭模型具有制作簡單、肝臟損傷的特異性、 肝外毒性小、各項(xiàng)生化指標(biāo)、影像學(xué)指標(biāo)以及疾病過程和轉(zhuǎn)歸高度類似人爆發(fā)性肝功能衰竭的相應(yīng)改變。從給藥到動(dòng)物死亡具有較長的治療時(shí)間窗，可用于篩選促肝細(xì)胞再生藥物， 評(píng)估肝移植、組織工程肝、生物人工肝支持系統(tǒng)、肝細(xì)胞移植以及干細(xì)胞移植的治療效果。實(shí)施例2利用本發(fā)明恒河猴爆發(fā)性肝功能衰竭動(dòng)物模型評(píng)價(jià)組織工程肝支持系統(tǒng)或肝細(xì)胞、干細(xì)胞移植效果并建立相關(guān)的評(píng)價(jià)體系a、按實(shí)施例1的方法制備恒河猴爆發(fā)性肝功能衰竭模型，它是將鵝膏蕈堿聯(lián)合脂多糖內(nèi)毒素施用于靈長類動(dòng)物，鵝膏蕈堿的施用劑量為0. lmg/kg，脂多糖內(nèi)毒素的施用劑量為 ι μ g/kg ；b、采用細(xì)胞移植或器官移植于該動(dòng)物模型；C、觀察移植后動(dòng)物的肝功能的量化指標(biāo)影響情況，評(píng)價(jià)組織工程肝支持系統(tǒng)或肝細(xì)胞、干細(xì)胞移植效果。經(jīng)過步驟c的評(píng)價(jià)，如果移植后的動(dòng)物肝功能指標(biāo)有明顯改善的，則可以證明采用細(xì)胞移植或器官肝移植、組織工程肝、生物人工肝方式治療爆發(fā)性肝功能衰竭的可行性。綜上所述，本發(fā)明制備的爆發(fā)性肝功能衰竭動(dòng)物模型建模成功，可以用于嚙齒類動(dòng)物模型無法完成的生物技術(shù)新藥的評(píng)價(jià)和肝移植、組織工程肝、生物人工肝支持系統(tǒng)、肝細(xì)胞移植以及干細(xì)胞移植的治療效果的評(píng)價(jià)。
權(quán)利要求
1.鵝膏蕈堿聯(lián)合內(nèi)毒素脂多糖在制備用于篩選治療爆發(fā)性肝功能衰竭藥物、評(píng)價(jià)組織工程肝支持系統(tǒng)或肝細(xì)胞、干細(xì)胞移植治療效果的靈長類動(dòng)物模型中的用途，其中鵝膏蕈堿的施用劑量為0. lmg/kg,內(nèi)毒素施用劑量為1 μ g/kg。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于鵝膏蕈堿與脂多糖內(nèi)毒素同時(shí)施用，施用方法為單次腹腔滴注。
3.一種爆發(fā)性肝功能衰竭動(dòng)物模型的制備方法，其特征在于它是將鵝膏蕈堿和脂多糖內(nèi)毒素施用于靈長類動(dòng)物，鵝膏蕈堿的施用劑量為0. lmg/kg，脂多糖內(nèi)毒素的施用劑量為 ι μ g/kg。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的爆發(fā)性肝功能衰竭動(dòng)物模型的制備方法，其特征在于所述靈長類動(dòng)物為恒河猴。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的爆發(fā)性肝功能衰竭動(dòng)物模型的制備方法，其特征在于 所述的施用方法為單次腹腔滴注。
6.權(quán)利要求3-5任一一項(xiàng)所述的方法制備得到的爆發(fā)性肝功能衰竭動(dòng)物模型。
7.權(quán)利要求6所述的動(dòng)物模型在評(píng)價(jià)組織工程肝支持系統(tǒng)或肝細(xì)胞、干細(xì)胞移植治療效果中的應(yīng)用。
8.一種評(píng)價(jià)組織工程肝支持系統(tǒng)或肝細(xì)胞、干細(xì)胞移植效果的方法，包括如下步驟a、它是將鵝膏蕈堿聯(lián)合脂多糖內(nèi)毒素施用于靈長類動(dòng)物，制備爆發(fā)性肝功能衰竭動(dòng)物模型，鵝膏蕈堿的施用劑量為0. lmg/kg，脂多糖內(nèi)毒素的施用劑量為lyg/kg;b、采用細(xì)胞移植或器官移植于該動(dòng)物模型；c、觀察移植后動(dòng)物的肝功能影響情況，評(píng)價(jià)組織工程肝支持系統(tǒng)或肝細(xì)胞、干細(xì)胞移植效果。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的篩選藥物的方法，其特征在于a步驟所述靈長類動(dòng)物為恒河猴。
10.根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的篩選藥物的方法，其特征在于所述的鵝膏蕈堿與脂多糖內(nèi)毒素同時(shí)施用，施用方法為單次腹腔滴注。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種鵝膏蕈堿聯(lián)合內(nèi)毒素脂多糖在制備用于篩選治療爆發(fā)性肝功能衰竭時(shí)促肝細(xì)胞再生藥物以及評(píng)價(jià)組織工程肝支持系統(tǒng)或肝細(xì)胞、干細(xì)胞移植治療效果的動(dòng)物模型。其中鵝膏蕈堿的施用方法和劑量為單次腹腔滴注，0.1mg/kg，內(nèi)毒素為1μg/kg。本發(fā)明還提供了一種制備恒河猴爆發(fā)性肝功能衰竭的方法，及該方法制備的爆發(fā)性肝功能衰竭動(dòng)物模型。本發(fā)明動(dòng)物模型可以用于嚙齒類動(dòng)物模型無法完成的生物技術(shù)新藥的評(píng)價(jià)，還可以用于組織工程肝臟、生物人工肝、肝細(xì)胞及干細(xì)胞移植治療技術(shù)的評(píng)價(jià)。
文檔編號(hào)A61K31/739GK102526034SQ20101060444
公開日2012年7月4日 申請日期2010年12月24日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月24日
發(fā)明者周萍, 夏杰, 張 杰, 李宏霞, 步宏, 王莉, 石毓君, 郭崗 申請人:四川大學(xué)華西醫(yī)院, 國家成都中藥安全性評(píng)價(jià)中心, 成都華西海圻醫(yī)藥科技有限公司