專利名稱：一種在骨損傷修復(fù)材料表面制備載生長因子涂層的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種在骨損傷修復(fù)材料表面制備載生長因子涂層的方法。
背景技術(shù)：
金屬醫(yī)用材料合金因其良好的機(jī)械性能和生物相容性常作為骨損傷修復(fù)材料，也即骨組織的替代材料植入人體內(nèi)。骨損傷修復(fù)材料植入人體后和體內(nèi)周圍環(huán)境的相互作用首先發(fā)生在表面，而金屬材料是生物惰性材料，因此對植入物進(jìn)行表面改性相當(dāng)重要。近年來對骨損傷修復(fù)材料表面進(jìn)行改性的方法已經(jīng)得到廣泛的臨床應(yīng)用，尤其在材料表面采用自組裝法固載生長因子賦予材料骨誘導(dǎo)性的方式的得到廣泛研究。材料表面通過層層自組裝的方式構(gòu)建聚電解質(zhì)膜，無論材料表面形貌如何，最后均能在其表面得到物理化學(xué)性質(zhì)均一的膜。沉積的聚電解質(zhì)膜具有良好的生物相容性，且能將具有生物活性的大分子 (蛋白、酶、肽段)或者其他有機(jī)物固定在聚電解質(zhì)多層膜中，既能實(shí)現(xiàn)特定的誘導(dǎo)還能實(shí)現(xiàn)生物分子的緩慢釋放，從而提高骨/植入物界面的骨再生能力。通常聚電解質(zhì)多層膜的構(gòu)建是依靠正負(fù)電性交替沉積，分子層間是通過靜電吸附組裝的，這種非交聯(lián)自組裝膜會導(dǎo)致原本電性就很弱的聚電解質(zhì)在材料表面沉積的力度不夠，膜單元層在生物環(huán)境中易降解和發(fā)生相互擴(kuò)散，穩(wěn)定性不高，另一方面，生長因子和其他生物活性分子通過自身電性與聚電解質(zhì)層通過靜電作用組裝在膜層間或者直接與自組裝膜化學(xué)接枝，也使這些生物分子隨著聚電解質(zhì)膜的降解而迅速釋放。從而使生物分子的骨誘導(dǎo)作用時(shí)間短，效果差。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的提供一種在骨損傷修復(fù)材料表面制備載生長因子涂層的方法，該法在骨損傷修復(fù)材料表面制備出的涂層降解緩慢，能實(shí)現(xiàn)生長因子的釋放控制，其骨誘導(dǎo)作用時(shí)間長而可控，骨誘導(dǎo)效果好。本發(fā)明實(shí)現(xiàn)其發(fā)明目的所采用的技術(shù)方案是，一種在骨損傷修復(fù)材料表面制備載生長因子涂層的方法，包括如下步驟:A、將生長因子溶解于濃度為l_3mg/ml的顯負(fù)電性的聚多糖溶液，得到生長因子濃度為0.5-10 μ g/ml的混合液,再將混合液與濃度為l_3mg/ml的帶氨基的聚陽離子溶液按1: 2-10的體積比混合，并攪拌、離心、冷凍干燥，再溶于水制得濃度為0.5-2mg/ml的帶正電荷的載生長因子的微納球溶液；B、將在溶液中顯負(fù)電性且含鄰二醇的聚多糖配制成濃度為20mg/ml的溶液，再將該溶液在避光條件下與等體積的高碘酸鈉水溶液混合、攪拌6h，其中加入的高碘酸鈉與聚多糖單體單元的摩爾比為1: 1-2.5;隨后再加入與高碘酸鈉等摩爾的乙二醇，反應(yīng)2h;反應(yīng)后將溶液進(jìn)行透析、取透析袋中的液體冷凍干燥，再溶于水制得濃度為0.5-2mg/ml的多醛基聚多糖溶液；C、將骨損傷修復(fù)材料依次用多巴胺溶液、戊二醛溶液浸泡，使材料表面通過多巴胺接枝戊二醛；D、將C步得到的接枝有戊二醛的骨損傷修復(fù)材料浸泡于帶氨基的聚陽離子溶液5-10分鐘，溶液的聚陽離子濃度為0.5mg/ml-2mg/ml，清洗、干燥后得到外表面層為帶氨基的聚陽離子層的骨損傷修復(fù)材料；E、將外表面層為表面層為帶氨基的聚陽離子層的骨損傷修復(fù)材料在B步的多醛基聚多糖溶液中浸泡5-10分鐘，清洗、干燥后得到外表面層為多醛基聚多糖層的骨損傷修復(fù)材料；F、將E步的骨損傷修復(fù)材料在A步得到的微納球溶液中浸泡5-10分鐘，清洗、干燥后得到外表面層為載生長因子微納球?qū)拥墓菗p傷修復(fù)材料；G、將F步得到的骨損傷修復(fù)材料在B步的多醛基聚多糖溶液中浸泡5-10分鐘，清洗、干燥后得到外表面 層為多醛基聚多糖層的骨損傷修復(fù)材料；H、將G步得到的骨損傷修復(fù)材料浸泡于C步中的帶氨基的聚陽離子溶液5-10分鐘，清洗、干燥后得到外表面層為帶氨基的聚陽離子層的骨損傷修復(fù)材料；重復(fù)E-H步的操作5-100次，即在骨損傷修復(fù)材料表面制備出載生長因子涂層。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是:一、本發(fā)明方法制得的涂層中每一自組裝單元膜由里到外有四層，分別為帶正電的聚電解質(zhì)層(帶氨基的聚陽離子層)、氧化聚多糖層(帶負(fù)電)、帶正電荷的微納顆粒、氧化聚多糖層(帶負(fù)電)；自組裝單元膜共有5-100個(gè)。相鄰單元膜之間通過帶氨基的聚陽離子與帶有醛基的氧化聚多糖共價(jià)結(jié)合，而在單元膜間形成交聯(lián)，同時(shí)帶氨基的聚陽離子與氧化聚多糖帶相反電性，能夠發(fā)生靜電吸附，使得單元膜之間的結(jié)合力強(qiáng)，穩(wěn)定性好，涂層的降解緩慢，能實(shí)現(xiàn)生長因子的釋放控制，其骨誘導(dǎo)作用時(shí)間長而可控，骨誘導(dǎo)效果好。二、單元膜內(nèi)帶正電荷的微納顆粒通過靜電吸附的作用被夾在帶負(fù)電的兩層氧化聚多糖層之間；同時(shí)，微納顆粒上帶有氨基，能夠與氧化聚多糖上的醛基發(fā)生共價(jià)結(jié)合，使包埋生長因子的微納顆粒更好地固載于單元膜內(nèi)。微納顆粒穩(wěn)定性好，降解緩慢粒，也使得生長因子的骨誘導(dǎo)作用時(shí)間長，骨誘導(dǎo)效果好。三、生長因子-聚陰離子-帶氨基的聚陽離子組成微納球，生長因子包裹于微納球中，避免了生長因子和氧化聚多糖層或體內(nèi)的酶的接觸與作用，既使其作用時(shí)間更長，也能更好地其保持活性保持，使其骨誘導(dǎo)效果更好。四、整個(gè)體系由5-100個(gè)自組裝單元膜構(gòu)成，可以通過不同的自組裝單元膜的聚陽離子、聚陰離子、生長因子的種類和量的不同及其不同的組裝順序等多個(gè)因素的調(diào)節(jié)，實(shí)現(xiàn)多生長因子的各種方式的可控釋放。上述A步中在溶液中顯負(fù)電性的聚多糖為海藻酸鹽、硫酸軟骨素或透明質(zhì)酸或肝素；B步中在溶液中顯負(fù)電性且含鄰二醇的聚多糖為海藻酸鹽、硫酸軟骨素或透明質(zhì)酸。上述A步和D步中的帶氨基的聚陽離子為殼聚糖或聚賴氨酸。上述A步中的生長因子為骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)或血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)。上述C步中的骨損傷修復(fù)材料為純鈦、鈦合金或不銹鋼制成的骨損傷修復(fù)材料。下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的描述。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1一種在骨損傷修復(fù)材料表面制備載生長因子涂層的方法，包括如下步驟:A、將生長因子一骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)溶解于濃度為lmg/ml的硫酸軟骨素溶液中，得到骨形態(tài)發(fā)生蛋白濃度為0.5 μ g/ml的混合液,再將混合液與濃度為lmg/ml的殼聚糖溶液按1: 2的體積比混合，并攪拌、離心、冷凍干燥，再溶于水制得濃度為lmg/ml的帶正電荷的載骨形態(tài)發(fā)生蛋白的微納球溶液；B、將在溶液中顯負(fù)電性且含鄰二醇的海藻酸鈉配制成濃度為20mg/ml的溶液，在避光條件下將該溶液與等體積的高碘酸鈉水溶液混合、攪拌6h，其中高碘酸鈉與海藻酸鈉單體單元的摩爾比為1: 2.5，隨后再加入與高碘酸鈉等摩爾的乙二醇、反應(yīng)2h ;反應(yīng)后將溶液進(jìn)行透析、取透析袋中的液體冷凍干燥，再溶解于水制得濃度為0.5mg/ml的多醛基海藻酸鈉溶液；C、將純鈦制成的骨損傷修復(fù)材料依次用多巴胺溶液、戊二醛溶液侵泡，使材料表面通過多巴胺接枝戊二醛；D、將C步的接枝有戊二醛的骨損傷修復(fù)材料浸泡于濃度為0.5mg/ml殼聚糖溶液5分鐘，清洗、干燥后得到外表面層為殼聚糖層的骨損傷修復(fù)材料；E、將外表面層為殼聚糖層的骨損傷修復(fù)材料在B步的多醛基海藻酸鈉溶液中浸泡5分鐘，清洗、干燥后得到外表面層為多醛基海藻酸鈉層的骨損傷修復(fù)材料；F、將E步的骨損傷修復(fù)材料在A步制備的微納球溶液中浸泡5分鐘，清洗、干燥后得到外表面層為載骨形態(tài)發(fā)生蛋白微納球?qū)拥墓菗p傷修復(fù)材料；G、將F步得到的骨損傷修復(fù)材料在B步的多醛基海藻酸鈉溶液中浸泡5分鐘，清洗、干燥后得到外表面層為多醛基海藻酸鈉層的骨損傷修復(fù)材料；H、將G步得到的骨損傷修復(fù)材料浸泡于C步中的殼聚糖溶液5分鐘，清洗、干燥后得到外表面層為殼聚糖層的骨損傷修復(fù)材料；重復(fù)E-H步的操作5次，即在骨損傷修復(fù)材料表面制備出載骨形態(tài)發(fā)生蛋白涂層。涂層中含5個(gè)自組裝單元膜，每一自組裝單元膜中均有一層載骨形態(tài)發(fā)生蛋白的微納球涂層。實(shí)施例2—種在骨損傷修復(fù)材料表面制備載生長因子涂層的方法，包括如下步驟:A、將生長因子一血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)溶解于濃度為2mg/ml的肝素溶液中，得到血管內(nèi)皮生長因子濃度為10μ g/ml的混合液，再將混合液與濃度為3mg/ml的聚賴氨酸溶液按1: 10的體積比混合，并攪拌、離心、冷凍干燥，再溶于水制得濃度為0.5mg/ml的帶正電荷的載血管內(nèi)皮生長因子的微納球溶液；B、將在溶液中顯負(fù)電性且含鄰二醇的透明質(zhì)酸配制成濃度為20mg/ml的溶液，在避光條件下將該溶液與等體積的高碘酸鈉水溶液混合、攪拌6h，其中高碘酸鈉與透明質(zhì)酸單體單元的摩爾比為1: 1，隨后再加入與高碘酸鈉等摩爾的乙二醇、反應(yīng)2h ;反應(yīng)后將溶液進(jìn)行透析、取透析袋中的液 體冷凍干燥，再溶解于水制得濃度為2mg/ml的多醛基透明質(zhì)酸溶液；C、將鈦合金制成的骨損傷修復(fù)材料依次用多巴胺溶液、戊二醛溶液侵泡，使材料表面通過多巴胺接枝戊二醛；
D、將C步的接枝有戊二醛的骨損傷修復(fù)材料浸泡于濃度為2mg/ml聚賴氨酸溶液10分鐘，清洗、干燥后得到外表面層為聚賴氨酸層的骨損傷修復(fù)材料；E、將外表面層為聚賴氨酸層的骨損傷修復(fù)材料在B步的多醛基透明質(zhì)酸溶液中浸泡10分鐘，清洗、干燥后得到外表面層為多醛基透明質(zhì)酸層的骨損傷修復(fù)材料；F、將E步的骨損傷修復(fù)材料在A步制備的微納球溶液中浸泡10分鐘，清洗、干燥后得到外表面層為載血管內(nèi)皮生長因子微納球?qū)拥墓菗p傷修復(fù)材料；G、將F步得到的骨損傷修復(fù)材料在B步的多醛基透明質(zhì)酸溶液中浸泡10分鐘，清洗、干燥后得到外表面層為多醛基透明質(zhì)酸層的骨損傷修復(fù)材料；H、將G步得到的骨損傷修復(fù)材料浸泡于C步中的聚賴氨酸溶液10分鐘，清洗、干燥后得到外表面層為聚賴氨酸層的骨損傷修復(fù)材料；重復(fù)E-H步的操作50次，即在骨損傷修復(fù)材料表面制備出載血管內(nèi)皮生長因子涂層。再次重復(fù)E-H步的操作50次，將A步中的血管內(nèi)皮生長因子換成骨形態(tài)發(fā)生蛋白，得到載骨形態(tài)發(fā)生蛋白及血管內(nèi)皮生長因兩種生長因子的涂層。涂層中含100個(gè)自組裝單元膜，由里到外前50個(gè)自組裝單元膜的每個(gè)單元膜中均有一層載血管內(nèi)皮生長因子的微納球涂層，而后50個(gè)自組裝單元膜的每個(gè)單元膜中均有一層載骨形態(tài)發(fā)生蛋白的微納球涂層。實(shí)施例3一種在骨損傷修復(fù)材料表面制備載生長因子涂層的方法，包括如下步驟:A、將生長因子一骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)溶解于濃度為3mg/ml的海藻酸鈉溶液中，得到骨形態(tài)發(fā)生蛋白濃度為0.7 μ g/ml的混合液,再將混合液與濃度為2mg/ml的聚賴氨酸溶液按1: 6的體積 比混合，并攪拌、離心、冷凍干燥，再溶于水制得濃度為2mg/ml的帶正電荷的載骨形態(tài)發(fā)生蛋白的微納球溶液；B、將在溶液中顯負(fù)電性且含鄰二醇的硫酸軟骨素配制成濃度為20mg/ml的溶液，在避光條件下將該溶液與等體積的高碘酸鈉水溶液混合、攪拌6h，其中高碘酸鈉與硫酸軟骨素單體單元的摩爾比為1: 2,隨后再加入與高碘酸鈉等摩爾的乙二醇、反應(yīng)2h ;反應(yīng)后將溶液進(jìn)行透析、取透析袋中的液體冷凍干燥，再溶解于水制得濃度為1.5mg/ml的多醛基硫酸軟骨溶液；C、將不銹鋼制成的骨損傷修復(fù)材料依次用多巴胺溶液、戊二醛溶液侵泡，使材料表面通過多巴胺接枝戊二醛；D、將C步的接枝有戊二醛的骨損傷修復(fù)材料浸泡于濃度為1.5mg/ml聚賴氨酸溶液7分鐘，清洗、干燥后得到外表面層為聚賴氨酸層的骨損傷修復(fù)材料；E、將外表面層為殼聚糖層的骨損傷修復(fù)材料在B步的多醛基硫酸軟骨素溶液中浸泡7分鐘，清洗、干燥后得到外表面層為多醛基硫酸軟骨素層的骨損傷修復(fù)材料；F、將E步的骨損傷修復(fù)材料在A步制備的微納球溶液中浸泡7分鐘，清洗、干燥后得到外表面層為載骨形態(tài)發(fā)生蛋白微納球?qū)拥墓菗p傷修復(fù)材料；G、將F步得到的骨損傷修復(fù)材料在B步的多醛基硫酸軟骨素溶液中浸泡7分鐘，清洗、干燥后得到外表面層為多醛基硫酸軟骨素層的骨損傷修復(fù)材料；H、將G步得到的骨損傷修復(fù)材料浸泡于C步中的聚賴氨酸溶液7分鐘，清洗、干燥后得到外表面層為聚賴氨酸層的骨損傷修復(fù)材料；
重復(fù)E-H步的操作25次，即在骨損傷修復(fù)材料表面制備出載骨形態(tài)發(fā)生蛋白涂層。涂層中含25個(gè)自組裝單元膜，每一自組裝單元膜中均有一層載骨形態(tài)發(fā)生蛋白的微納球涂層。實(shí)施例4
本例與實(shí)施例3基本相同，不同的是所述A步中在溶液中顯負(fù)電性的聚多糖為海藻酸鈣步中在溶液中顯負(fù)電性且含鄰二醇的聚多糖為海藻酸鈣。
權(quán)利要求
1.一種在骨損傷修復(fù)材料表面制備載生長因子涂層的方法，包括如下步驟: A、將生長因子溶解于濃度為l-3mg/ml的顯負(fù)電性的聚多糖溶液，得到生長因子濃度為0.5-10 μ g/ml的混合液，再將混合液與濃度為l_3mg/ml的帶氨基的聚陽離子溶液按I: 2-10的體積比混合，并攪拌、離心、冷凍干燥，再溶于水制得濃度為0.5-2mg/ml的帶正電荷的載生長因子的微納球溶液； B、將在溶液中顯負(fù)電性且含鄰二醇的聚多糖配制成濃度為20mg/ml的溶液，再將該溶液在避光條件下與等體積的高碘酸鈉水溶液混合、攪拌6h，其中加入的高碘酸鈉與聚多糖單體單元的摩爾比為1: 1-2.5 ;隨后再加入與高碘酸鈉等摩爾的乙二醇，反應(yīng)2h ;反應(yīng)后將溶液進(jìn)行透析、取透析袋中的液體冷凍干燥，再溶于水制得濃度為0.5-2mg/ml的多醛基聚多糖溶液； C、將骨損傷修復(fù)材料依次用多巴胺溶液、戊二醛溶液浸泡，使材料表面通過多巴胺接枝戊二醛； D、將C步得到的接枝有戊二醛的骨損傷修復(fù)材料浸泡于帶氨基的聚陽離子溶液5-10分鐘，溶液的聚陽離子濃度為0.5mg/ml-2mg/ml，清洗、干燥后得到外表面層為帶氨基的聚陽離子層的骨損傷修復(fù)材料； E、將外表面層為表面層為帶氨基的聚陽離子層的骨損傷修復(fù)材料在B步的多醛基聚多糖溶液中浸泡5-10分鐘，清洗、干燥后得到外表面層為多醛基聚多糖層的骨損傷修復(fù)材料； F、將E步的骨損傷修復(fù)材料在A步得到的微納球溶液中浸泡5-10分鐘，清洗、干燥后得到外表面層為載生長因子微納球?qū)拥墓菗p傷修復(fù)材料； G、將F步得到的骨損傷修復(fù)材料在B步的多醛基聚多糖溶液中浸泡5-10分鐘，清洗、干燥后得到外表面層為多醛基聚多糖層的骨損傷修復(fù)材料； H、將G步得到的骨損傷修復(fù)材料浸泡于C步中的帶氨基的聚陽離子溶液5-10分鐘，清洗、干燥后得到外表面層為帶氨基的聚陽離子層的骨損傷修復(fù)材料； 重復(fù)E-H步的操作5-100次，即在骨損傷修復(fù)材料表面制備出載生長因子涂層。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種在骨損傷修復(fù)材料表面制備載生長因子涂層的方法，其特征在于:所述A步中在溶液中顯負(fù)電性的聚多糖為海藻酸鹽、硫酸軟骨素或透明質(zhì)酸或肝素步中在溶液中顯負(fù)電性且含鄰二醇的聚多糖為海藻酸鹽、硫酸軟骨素或透明質(zhì)酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種在骨損傷修復(fù)材料表面制備載生長因子涂層的方法，其特征在于:所述A步和D步中的帶氨基的聚陽離子為殼聚糖或聚賴氨酸。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種在骨損傷修復(fù)材料表面制備載生長因子涂層的方法，其特征在于，所述A步中的的生長因子為骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)或血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種在骨損傷修復(fù)材料表面制備載生長因子涂層的方法，其特征在于，所述C步中的骨損傷修復(fù)材料為純鈦、鈦合金或不銹鋼制成的骨損傷修復(fù)材料。
全文摘要
一種在骨損傷修復(fù)金屬材料表面制備載生長因子涂層的方法。它通過層層自組裝的方法在材料表面形成5-100個(gè)單元膜；單元膜由里到外有四層，分別為帶正電的聚電解質(zhì)層(帶氨基的聚陽離子層)、氧化聚多糖層(帶負(fù)電)、帶正電荷的包埋生長因子的微納顆粒層、氧化聚多糖層(帶負(fù)電)。單元膜內(nèi)帶正電的微納顆粒通過靜電吸附被夾在帶負(fù)電的兩層氧化聚多糖層之間，其帶的氨基，又能與氧化聚多糖的醛基發(fā)生共價(jià)結(jié)合，使微納顆粒更好地固載于單元膜內(nèi)。單元膜之間通過帶氨基的聚陽離子與帶醛基的氧化聚多糖既能共價(jià)結(jié)合、交聯(lián)，同時(shí)又帶相反電性，有靜電吸附作用，單元膜間結(jié)合力強(qiáng)；涂層穩(wěn)定性好，降解緩慢，骨誘導(dǎo)作用時(shí)間長而可控，骨誘導(dǎo)效果好。
文檔編號A61L27/28GK103191469SQ20131011978
公開日2013年7月10日 申請日期2013年4月8日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月8日
發(fā)明者魯雄, 董麗, 王振銘, 謝超鳴, 韓璐, 劉敏 申請人:西南交通大學(xué)