專利名稱：一種對酒精性肝損傷具有保護作用的透骨草提取物的制作方法
一種對酒精性肝損傷具有保護作用的透骨草提取物技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明所屬醫(yī)藥產(chǎn)品研究開發(fā)技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明涉及一種對酒精性肝損傷具有保護作用的透骨草提取物。
背景技術(shù)：
透骨草(Phrymaleptostachya L. var. asiatica Hara)又稱老婆子針線、接生草等，屬于透骨草科(Phrymaceae)透骨草屬(Phryma)多年生草本植物，生長于山坡、林下、路旁、溝岸及草地的陰濕處。透骨草味苦、歸心經(jīng)。我國很多地區(qū)都有分布。透骨草全草均可藥用，具有清熱利濕、活血消腫、催產(chǎn)等功效，能治跌打損傷、濕疹、骨折、黃水瘡等疾病。透骨草還具有抗腫瘤作用、抗菌活性、殺蟲活性。目前，藥典并沒有收錄有關(guān)透骨草科透骨草屬透骨草的相關(guān)記載，但是民間常用它來治療“風(fēng)濕痹痛”等疾病。透骨草富含豐富的木脂素類化合物。日本學(xué)者Eiji Tan-iguchi和^suyoshi Oshima先后從北美透骨草根中分離得到了透骨草靈-I (phrymalin-I)、透骨草靈-II (phrymalin-II)和乙酰透骨草脂素 (leptostachyol acetate)。隨后，Eiji Taniguchi 禾口 Fumito Ishibashi 合成了透骨草靈-I和透骨草靈-II及其立體異構(gòu)體。Eiji Taniquchi和Fumito Ishibashi等人還從北美透骨草根中分離得到倍半木脂素haedoxao A，并對haedoxan A進行了合成，但該合成的方法包括20個反應(yīng)步驟，且反應(yīng)條件苛刻，合成效率低。韓國學(xué)者SangMyimg Zee等從北美透骨草干燥地上部分的乙酸乙酯提取物中分離出了透骨草靈-II和熊果酸；此外，韓國學(xué)者IL-kwon park等從亞洲透骨草干燥根的氯仿提取液中分離得到乙酰透骨草脂素和去甲氧基乙酰透骨草脂素。從透骨草中分離得到的化合物，除熊果酸為三萜類化合物外，其余均為木脂素類化合物。發(fā)明內(nèi)容
1、一種對酒精性肝損傷具有保護作用的透骨草提取物，其特征在于該提取物的制備包括以下過程
步驟(1)稱取透骨草全草干燥粗粉，加入以粗粉8-10倍量的水浸泡他-lOh，煎煮 1. 5h-2h,煎煮后真空抽濾，收集濾液；
步驟O)將步驟(1)中的透骨草全草干燥粗粉的濾渣再加水煎煮lh-1. 5h，煎煮后真空抽濾，收集濾液；
步驟(3)將步驟⑴和O)中的濾液合并，將濾液濃縮至浸膏狀，烘干浸膏，粉碎，得到透骨草提取物。
2、該提取物用于制備對酒精性肝損傷具有保護作用的制劑。
根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明中的“ ％，，是重量百分比。
具體實施方式
本發(fā)明所述的一種對酒精性肝損傷具有保護作用的透骨草提取物包括以下實施例，下面的實施例可進一步說明本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。
實施例1
1、一種對酒精性肝損傷具有保護作用的透骨草提取物，其特征在于該提取物的制備包括以下過程
步驟(1)稱取透骨草全草干燥粗粉100g，加入以粗粉8倍量的水浸泡他，煎煮 1. 5，煎煮后真空抽濾，收集濾液；
步驟O)將步驟(1)中的透骨草全草干燥粗粉的濾渣再加水煎煮lh，煎煮后真空抽濾，收集濾液；
步驟(3):將步驟(1)和O)中的濾液合并，將濾液濃縮至浸膏狀，烘干浸膏，粉碎，得到透骨草提取物8. 6g。
2、該提取物用于制備對酒精性肝損傷具有保護作用的制劑。
實施例2:
1、一種對酒精性肝損傷具有保護作用的透骨草提取物，其特征在于該提取物的制備包括以下過程
步驟(1)稱取透骨草全草干燥粗粉200g，加入以粗粉10倍量的水浸泡10h，煎煮 2h,煎煮后真空抽濾，收集濾液；
步驟O)將步驟(1)中的透骨草全草干燥粗粉的濾渣再加水煎煮1. 5h，煎煮后真空抽濾，收集濾液；
步驟(3):將步驟(1)和O)中的濾液合并，將濾液濃縮至浸膏狀，烘干浸膏，粉碎，得到透骨草提取物17g。
2、該提取物用于制備對酒精性肝損傷具有保護作用的制劑。
透骨草提取物對小鼠酒精性肝損傷保護作用的實驗
1實驗材料、試劑及儀器
1. 1實驗材料
1. 1. 1實驗藥材與試劑
透骨草采自吉林省臨江市三公里基地，經(jīng)吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院胡全德教授鑒定為透骨草禾斗植物透骨草(Phryma leptostachya L. var. asiatica Hara)全草。
丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)試劑盒、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)試劑盒、丙二醛(MDA)試劑盒 (南京建成生物工程研究所)；56% (V/V)北京二鍋頭白酒(北京紅星公司)；冰醋酸、無水乙醇(北京化工廠)；護肝片(吉林修正藥業(yè))。
1. 1. 2實驗動物
美國國立腫瘤研究所(Institute for Cancer Research, ICR)品系小鼠，雌雄各半，體重(20 士 l)g，購自吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心，合格證號 SCXK(吉)2011-0001。
1.1.3 儀器
LPZ5-2型離心機北京醫(yī)用離心機廠
型號76新世紀(jì)紫外可見分光光度計北京普析通用儀器有限責(zé)任公司
百靈LA114型電子天平(110g/0.0001g) 常熟市百靈天平儀器有限公司
KQ-250DB型超聲波清洗器昆山市超聲儀器有限公司
高速冷凍離心機GI-20B上海安亭科學(xué)儀器廠
微量進樣器(50μ 1X2 ;100μ 1X2)。
2實驗方法
2. 1透骨草提取物的制備
步驟(1)稱取透骨草全草干燥粗粉100g，加入以粗粉8倍量的水浸泡他，煎煮 1. 5，煎煮后真空抽濾，收集濾液；
步驟O)將步驟(1)中的透骨草全草干燥粗粉的濾渣再加水煎煮lh，煎煮后真空抽濾，收集濾液；
步驟(3)將步驟⑴和O)中的濾液合并，將濾液濃縮至浸膏狀，烘干浸膏，粉碎，得到透骨草提取物8. 6g，用水溶解，使其每克相當(dāng)于Ig原藥材(透骨草粗粉)。
2. 2動物分組及給藥
2. 2. 1動物分組
小鼠60只適應(yīng)性喂養(yǎng)3d后，隨機分為正常組、陰性(模型)對照組、陽性對照組， 透骨草水提物高、中、低劑量組，每組10只，雌雄各半，按鼠體重給藥。
2. 2. 2給藥設(shè)計
正常組正常喂食、喂水。
陰性(模型)對照組只給酒精，不給藥。
陽性對照組將陽性藥護肝片的成人劑量，按成人體重與小鼠體重的比例折合成小鼠的劑量。每天給小鼠灌胃。
透骨草低劑量每天按5g透骨草提取物/kg小鼠的給藥量給小鼠灌胃。
透骨草中劑量每天按IOg透骨草提取物/kg小鼠的給藥量給小鼠灌胃。
透骨草高劑量每天按20g透骨草提取物/kg小鼠的給藥量給小鼠灌胃。
2. 2. 3動物給藥
除正常對照組外，其余各組每日均于給藥Ih后灌胃56% (V/V) 二鍋頭白酒16mL/ kg(陰性對照組只給酒精，不給藥)，連續(xù)7d。自造模第1日起，每日給酒4h前灌胃相應(yīng)的水煎液1次，共7d。末次給酒24h后(禁食不禁水12h)，摘除小鼠眼球取血，靜置Ih后， 3500r/min離心IOmin分離血清，檢測血清ALT、AST活性。小鼠脫臼處死，迅速取出肝臟， 勻漿，3500r/min離心lOmin，取肝臟上清液，測定MDA活性。
2. 3 測定
2. 3. 1透骨草提取物對小鼠體重的影響
檢查透骨草提取物對小鼠體重的影響與初始體重相比，3d后正常組和陽性對照組小鼠體重。
2. 3. 2ALT、AST 活性測定
小鼠眼球取血后，靜置lh，3500r/min離心IOmin分離血清，測定管用移液槍加入待測血清0. Iml加入試管中，對照管不加待測血清。將試劑盒中的基質(zhì)液先于37°C的水浴鍋中預(yù)熱5min后，取出0. 5ml加入測定管和對照管中，充分混勻后，于37°C水浴30min。然后測定管和對照管同時加入0.5ml的2，4-二硝基苯胼液，混勻。再取0. Iml待測血清只加入對照管中，混勻后于37°C水浴20min。最后在測定管和對照管中都加入5ml0. 4mol/l的氫氧化鈉液混勻。室溫放置lOmin，于505nm處，蒸餾水調(diào)零，測定對照管和測定管的OD值。每組重復(fù)三次。
絕對OD值=測定管OD值-對照管OD值
查標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過擬合公式求得相應(yīng)的AST、ALT活性
2.3.3MDA 活性測定
將試管分為標(biāo)準(zhǔn)管、標(biāo)準(zhǔn)空白管、測定管及測定空白管四組。首先取試劑盒中的 lOnmol/ml的標(biāo)準(zhǔn)品0. Iml加入標(biāo)準(zhǔn)管中，取0. Iml無水乙醇加入標(biāo)準(zhǔn)空白管中，在測定管和測定空白管中同時加入0. Iml的肝勻漿上清液，最后在標(biāo)準(zhǔn)管、標(biāo)準(zhǔn)空白管、測定管及測定空白管都加入0. Iml試劑一，充分混勻。再在標(biāo)準(zhǔn)管、標(biāo)準(zhǔn)空白管、測定管及測定空白管都加入3ml試劑二后，取Iml試劑三分別加入標(biāo)準(zhǔn)管、標(biāo)準(zhǔn)空白管及測定管，而測定空白管加入lml50%冰醋酸1ml，充分混勻后，試管口用保鮮薄膜扎緊，用針頭刺一小孔，95°C水浴 45min，取出后流水冷卻，然后3500r/min離心lOmin，取上清液，于532nm處，蒸餾水調(diào)零，測定各管的OD值。
組織中MDA含量的計算公式
組織中MDA含量=(測定管吸光度-測定空白管吸光度/標(biāo)準(zhǔn)管吸光度-標(biāo)準(zhǔn)空白管吸光度)X標(biāo)準(zhǔn)品濃度+待測樣本蛋白濃度
2. 4統(tǒng)計學(xué)方法
數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 10. O軟件包進行處理。各項數(shù)據(jù)以χ士s表示，用方差分析及t檢驗比較組間差異的顯著性，P < 0. 05表示差異顯著，有統(tǒng)計學(xué)意義。
3實驗結(jié)果
3. 1透骨草提取物對小鼠體重的影響，見表1。
表1透骨草水煎液對小鼠體重的影響
組別 η 初始體重(g) 3d后體重正常組 10 25.60 + 1.32 26.56 ±1.84 陰性對照組 10 M.29±2.74 U.87±2.54 透骨草低劑量組 10 24.58±3.75 24.37±1.96 透骨草中劑量組 10 25.07±2.53 24.96±2.75 透骨草高劑量組 10 24.57±1.73 23.28±2.45 _陽性對照組__25.53 士 2.34_26.38±1.62
由表1知透骨草提取物對小鼠體重的影響與初始體重相比，3d后正常組和陽性對照組小鼠體重分別增加了 3. 75%,3. 32%，酒精陰性對照組，透骨草低、中、高劑量組小鼠體重分別減少了 1.72%,0. 85%,0. 44%,5. 25%,20. 33%，組間比較未見統(tǒng)計學(xué)差異(P > 0.05)，表明透骨草對小鼠的食欲和體重?zé)o明顯影響(表1)。
3. 2ALT、AST含量測定結(jié)果，見表2。
表2ALT、AST含量測定結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種對酒精性肝損傷具有保護作用的透骨草提取物，其特征在于該提取物的制備包括以下過程步驟(1)稱取透骨草全草干燥粗粉，加入以粗粉8-10倍量的水浸泡他-lOh，煎煮 1. 5h-2h,煎煮后真空抽濾，收集濾液；步驟⑵將步驟⑴中的透骨草全草干燥粗粉的濾渣再加水煎煮lh-1. 5h，煎煮后真空抽濾，收集濾液；步驟(3)將步驟(1)和O)中的濾液合并，將濾液濃縮至浸膏狀，烘干浸膏，粉碎，得到透骨草提取物。
2.如權(quán)利要求1所述的對酒精性肝損傷具有保護作用的透骨草提取物的用途，其特征在于該提取物用于制備對酒精性肝損傷具有保護作用的制劑。
全文摘要
本發(fā)明所屬醫(yī)藥產(chǎn)品研究開發(fā)技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明涉及一種對酒精性肝損傷具有保護作用的透骨草提取物。稱取透骨草全草干燥粗粉，加入以粗粉8-10倍量的水浸泡8h-10h，煎煮1.5h-2h，煎煮后真空抽濾，收集濾液；將濾渣再加水煎煮1h-1.5h，煎煮后真空抽濾，收集濾液；將濾液合并，濃縮至浸膏狀，烘干浸膏，粉碎，得到透骨草提取物。該提取物用于制備對酒精性肝損傷具有保護作用的制劑。
文檔編號A61P1/16GK102512464SQ201210009880
公開日2012年6月27日 申請日期2012年1月1日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月1日
發(fā)明者侯欣池, 關(guān)鍵, 張崇禧, 張成城, 鄭友蘭 申請人:山東大學(xué)威海分校